[摘" "要]" "目的：分析α-細(xì)辛醚上調(diào)細(xì)胞色素C（cytochrome C， cytC）及Caspase-3表達(dá)對(duì)食管癌Eca-109細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。方法：將食管癌Eca-109細(xì)胞隨機(jī)等量分為4組，即低、中及高劑量（分別給予25、50及100 mg/L的α-細(xì)辛醚），另隨機(jī)取等量細(xì)胞加入等體積培養(yǎng)液作為空白組，培養(yǎng)48 h后通過平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)4組細(xì)胞增殖情況，Annexin V/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，RT-qPCR及Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞中cytC及Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)果：（1）細(xì)胞克隆數(shù)在空白組最高，低劑量組顯著高于高劑量組；凋亡率在空白組最低，低劑量組顯著低于高劑量組。（2）4組細(xì)胞遷移至小室下的細(xì)胞數(shù)空白組gt;低劑量組gt;中劑量組gt;高劑量組。（3）CytC及Caspase-3蛋白在高劑量組表達(dá)顯著高于空白組及低劑量組，且中劑量組表達(dá)高于空白組。（4）CytC及Caspase-3 mRNA的表達(dá)：高劑量組gt;中劑量組gt;低劑量組gt;空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05）。結(jié)論：α-細(xì)辛醚抑制Eca-109細(xì)胞增殖及侵襲，并且可能通過上調(diào)cytC及Caspase-3表達(dá)促進(jìn)調(diào)亡。

[關(guān)鍵詞]" "α-細(xì)辛醚；細(xì)胞色素C；Caspase-3；食管癌Eca-109細(xì)胞；增殖；凋亡

[中圖分類號(hào)]" "R735.1" " " " " " " "[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]" "A" " " " " " " "[文章編號(hào)]" "1674-7887（2024）04-0342-04

The influence of α-asarone in biological behavior of esophageal cancer Eca-109 cells by up-regulating expression of cytochrome C and Caspase-3

[Abstract]" "Objective： To analyze influence of α-asarone affects biological behavior of esophageal cancer Eca-109 cells by up-regulating expression of cytochrome C（cytC） and Caspase-3. Methods： Eca-109 cells of esophageal cancer were randomly divided into four groups， low dose， medium dose and high dose groups（administered 25， 50 and 100 mg/L of α-asarone， respectively）， and the same amount of cells severed as the blank group without α-asarone. After 48 hours of culture， the cell proliferation of four groups were detected with plate cloning experiment and apoptosis of cells was detected with Annexin V/PI method， and cytC and Caspase-3 protein and mRNA in cells were detected by RT-qPCR and Western Blot. Results： （1）The number of cell clones was the highest in the blank group， and the low dose group was significantly higher than the high dose group. The apoptosis rate of the four groups was the lowest in the blank group， and the low dose group was significantly lower than the high dose group. （2）Four groups of cells migrated to the cell number blank groupgt;low dose groupgt;medium dose groupgt;high dose group. （3）The expression of cytC and Caspase-3 protein in highdose group was significantly higher than that in blank group and low dose group， and the expression in medium dose group was higher than that in blank group. （4）The expression of cytC and Caspase-3 mRNA in each group was as follows： high dose groupgt;medium dose groupgt;low dose groupgt;blank group（all Plt;0.05）. Conclusion： α-asarone inhibits proliferation and invasion of Eca-109 cells and promotes apoptosis by up-regulating expression of cytC and Caspase-3.

[Key words]" "α-asarone; cytochrome C; Caspase-3; esophageal cancer Eca-109 cell; proliferation; apoptosis

食管癌是我國(guó)居民高發(fā)惡性腫瘤之一，由于其起病早期癥狀隱匿，一旦確診多數(shù)患者已處于中晚期，積極治療預(yù)后不佳，死亡率較高[1-3]，早期診斷及有效干預(yù)是改善預(yù)后、延長(zhǎng)生存時(shí)間的關(guān)鍵[4]。近年來，隨著醫(yī)學(xué)科技的不斷發(fā)展，臨床更加關(guān)注食管癌的早期診斷和臨床綜合治療，希望能夠找到更有效的手段來應(yīng)對(duì)這一嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。α-細(xì)辛醚是從石菖蒲中提取的物質(zhì)，在心腦血管疾病中發(fā)揮保護(hù)作用，同時(shí)也具備一定的抗癌作用，研究[5]證實(shí)其能夠調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移及侵襲等生物學(xué)行為，本研究擬分析α-細(xì)辛醚對(duì)食管癌Eca-109細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

1" "材料與方法

1.1" "細(xì)胞、藥品與試劑" "人食管癌Eca-109細(xì)胞株，生產(chǎn)批號(hào)：KG189，購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。α-細(xì)辛醚注射液，規(guī)格：2 mL/瓶；生產(chǎn)批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20059986，購(gòu)自亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司。胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司，胰蛋白酶購(gòu)自Sigma公司，RPM-1640培養(yǎng)基、青霉素及鏈霉素購(gòu)自Gibco公司，Annexin V-FITC購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)有限公司，結(jié)晶紫染色液購(gòu)自碧云天公司，PCR引物、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和RT-qPCR試劑盒均購(gòu)自大連寶生物工程有限公公司，Western Blot試劑盒購(gòu)自Migma公司，細(xì)胞色素C（cytochrome C， cytC）兔抗人單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司，兔抗人Caspase-3抗體購(gòu)自Proteintech公司，山羊抗兔二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2" "儀器" "ABI7500熒光定量PCR儀購(gòu)自ABI公司，96孔板購(gòu)自Corning公司，CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自SANYO公司，XDS-1B倒置顯微鏡購(gòu)自重慶光電儀器有限公司，Cytoflex流式細(xì)胞儀購(gòu)于貝克曼庫(kù)爾德公司。

1.3" "實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1" "細(xì)胞培養(yǎng)" "將凍存管中的食管癌Eca-109細(xì)胞于室溫狀態(tài)下復(fù)蘇，放入含10%胎牛血清、鏈霉素及青霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于5%CO2 37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，濕度為95%，細(xì)胞貼壁符合要求時(shí)消化傳代，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞備用。

1.3.2" "細(xì)胞分組" "依據(jù)張妍等[6]團(tuán)隊(duì)的研究方法，分別應(yīng)用生理鹽水配制成質(zhì)量濃度為25、50及100 mg/L的α-細(xì)辛醚溶液；選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞隨機(jī)均分為4組，包括空白組、低劑量組（加入25 mg/L）、中劑量組（加入50 mg/L）及高劑量組（加入100 mg/L），空白組加入等體積培養(yǎng)液。

1.3.3" "細(xì)胞培養(yǎng)及克隆形成" "配制細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10-4/mL，計(jì)數(shù)并確保細(xì)胞存活率gt;95%，鋪于96孔板中，每孔100 μL細(xì)胞懸液，設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后應(yīng)用結(jié)晶紫染色液進(jìn)行染色，倒置顯微鏡下拍照（100×），手工計(jì)算細(xì)胞克隆形成數(shù)。

1.3.4" "Annexin V/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡" "依據(jù)1.3.2方法將配制好的4組細(xì)胞接種于96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，置于同等條件下培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，應(yīng)用PBS洗滌2次，后加入100 μL Binging buffer重懸，后加入Alexa Fluor 488 annexin V 5 μL和100 μg/mL PI 1 μL，將上述混合體系置于暗室中室溫孵育15 min后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.5" "細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)" "在Transwell小室上層放入基質(zhì)膠，下層放入培養(yǎng)基，而后將1.3.2配置好的4組細(xì)胞懸液接種在小室上層，每組細(xì)胞各鋪6個(gè)復(fù)孔，按1.3.3方法培養(yǎng)，而后沖洗掉上層細(xì)胞及培養(yǎng)基，用甲醇固定后進(jìn)行結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.3.6" "Western Blot法檢測(cè)" "4組細(xì)胞由1.3.2方法培養(yǎng)48 h后提取總蛋白，通過BCA蛋白試劑盒測(cè)定提取蛋白的濃度，而后提取等量蛋白配置凝膠電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉，加入兔抗人cytC、兔抗人Caspase-3及β-actin一抗，4 ℃反應(yīng)條件下過夜，孵育24 h后充分洗滌，加入山羊抗兔二抗，繼續(xù)孵育1.5 h，應(yīng)用Bio-Rad凝膠成像儀進(jìn)行成像，條帶灰度值通過Image J軟件分析。

1.3.7" "RT-qPCR法檢測(cè)" "應(yīng)用Trizol試劑提取1.3.2中4組細(xì)胞的總RNA，檢測(cè)總RNA純度及濃度合格后進(jìn)行RT-qPCR；依據(jù)RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒構(gòu)建cDNA文庫(kù)，依據(jù)RNA轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配置PCR反應(yīng)體系（總體積為10 μL）后，上機(jī)進(jìn)行RT-qPCR，反應(yīng)條件為：預(yù)變性90 ℃ 10 min，變性 95 ℃ 15 s，退火60 ℃ 30 s，延伸70 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，通過2-ΔΔCT方程式計(jì)算cytC及Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量；引物序列為：cytC上游引物：5′-TTGCACTTACACCGGTACTTAAGC-3′，下游引物：5′-ACGTCCCCACTCTCTAAGTCCAA-3′；Caspase-3上游引物：5′-GACCTCCTACCTCTGGTTCTT-3′，下游引物：5′-TA-AGCCATGTCCTTCATCACA-3′；內(nèi)參β-actin上游引物：5′-ATCATGTTTGAGACCTTCA-3′，下游引物：5′-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3′。

1.4" "統(tǒng)計(jì)學(xué)方法" "所有數(shù)據(jù)通過SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，其中正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，Plt;0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2" "結(jié)" " " 果

2.1" "細(xì)胞克隆數(shù)及凋亡率" "細(xì)胞克隆數(shù)空白組最高，低劑量組顯著高于高劑量組；細(xì)胞凋亡率空白組最低，低劑量組顯著低于高劑量組（均Plt;0.05），見表1、圖1。

2.2" "細(xì)胞侵襲能力" "顯微鏡計(jì)數(shù)可知，4組細(xì)胞遷移至小室下的細(xì)胞數(shù)分別為空白組（192.52±63.21）個(gè)、低劑量組（151.43±51.06）個(gè)、中劑量組（107.44±49.27）個(gè)及高劑量組（63.28±26.56）個(gè)，空白組細(xì)胞數(shù)顯著高于其他3組，同時(shí)低劑量組高于中、高劑量組，且中劑量組高于高劑量組（均Plt;0.05），見圖2。

2.3" "細(xì)胞中cytC、Caspase-3蛋白及mRNA表達(dá)" "空白組cytC、Caspase-3蛋白表達(dá)量顯著低于其他3組，且高劑量組cytC、Caspase-3蛋白表達(dá)量顯著高于中、低劑量組（均P＜0.05），見圖3、表2；cytC、Caspase-3 mRNA表達(dá)量的順序?yàn)楦邉┝拷Mgt;中劑量組gt;低劑量組gt;空白組，任意兩組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05），見表2。

3" "討" " " 論

目前食管癌的臨床治療手段包括手術(shù)、放化療、分子靶向藥物及中醫(yī)藥綜合治療等[7-10]，其中手術(shù)是首選治療措施，但上述治療手段存在手術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)、放化療部分患者無法耐受、分子靶向藥物價(jià)格高昂等缺點(diǎn)[11]，且晚期食管癌患者5年生存率僅20%[12]，在我國(guó)仍舊有較高的死亡率[13]。中醫(yī)藥被證實(shí)在食管癌的治療中發(fā)揮重要價(jià)值。細(xì)辛醚中的α-細(xì)辛醚異構(gòu)體具備潛在的促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，抑制神經(jīng)膜細(xì)胞瘤侵襲及遷移[14]，而α-細(xì)辛醚則被證實(shí)具備抑制炎癥、促進(jìn)蜥蜴細(xì)胞增殖等作用。近年來發(fā)現(xiàn)，α-細(xì)辛醚也可能參與了組織細(xì)胞的凋亡，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[15]證實(shí)其通過調(diào)控Caspase-3蛋白表達(dá)參與斑馬魚心肌細(xì)胞凋亡，也參與了腫瘤細(xì)胞的凋亡，主要是通過X連鎖凋亡抑制蛋白影響食管癌細(xì)胞凋亡[16-17]。眾所周知，細(xì)胞凋亡涉及多種機(jī)制，因此探尋α-細(xì)辛醚對(duì)食管癌細(xì)胞增殖及凋亡影響的其他機(jī)制存在臨床意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，α-細(xì)辛醚對(duì)食管癌Eca-109細(xì)胞生物學(xué)行為存在影響，可抑制此類細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，且影響程度與α-細(xì)辛醚質(zhì)量濃度密切相關(guān)，隨著α-細(xì)辛醚質(zhì)量濃度的增加，Eca-109細(xì)胞增殖能力明顯下降，凋亡率則明顯上升，這與既往研究結(jié)果[6， 14， 18]一致。更重要的是，本研究發(fā)現(xiàn)α-細(xì)辛醚也可影響細(xì)胞遷移能力，基于此推測(cè)α-細(xì)辛醚可能作為治療食管癌的藥物，通過增加腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖及遷移。位于線粒體內(nèi)的cytC是參與細(xì)胞凋亡的始動(dòng)因子，其釋放入細(xì)胞質(zhì)后與其他物質(zhì)形成凋亡體，引起相關(guān)凋亡蛋白如Caspase-3的切割及活化，引起細(xì)胞凋亡[19-20]。研究[21]指出，氧化應(yīng)激等促凋亡信號(hào)作用下，線粒體內(nèi)cytC表達(dá)增加，募集細(xì)胞質(zhì)中bax前體，促使細(xì)胞分子剪切進(jìn)而活化，激活下游的Caspase-3等家族，切割細(xì)胞底物，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)，α-細(xì)辛醚引起食管癌細(xì)胞中cytC及Caspase-3的表達(dá)上調(diào)，同時(shí)隨著α-細(xì)辛醚質(zhì)量濃度的增加，上述兩者表達(dá)上調(diào)幅度均顯著增加，提示α-細(xì)辛醚可能是通過破壞線粒體引起cytC釋放至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，進(jìn)而引起凋亡蛋白表達(dá)及活化增加，參與食管癌細(xì)胞凋亡。此外，α-細(xì)辛醚同時(shí)具備抑制食管癌細(xì)胞增殖及侵襲的作用，可能應(yīng)用于食管癌的治療，但具體機(jī)制尚需深入探討。

綜上，α-細(xì)辛醚可抑制Eca-109細(xì)胞增殖及侵襲，且通過上調(diào)cytC及Caspase-3表達(dá)促進(jìn)凋亡。

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