[摘" "要]" "目的：探索PDZ結合激酶（PDZ-binding-kinase， PBK）在前列腺癌放射治療中的影響和預后意義。方法：從基因表達綜合（gene expression omnibus， GEO）數據庫中下載尋找前列腺癌細胞中放療抵抗基因，選取符合閾值的樣本資料。隨后分析樣本中前列腺癌組織與正常組織中PBK的表達差異。基于PBK的表達繪制前列腺癌的生存曲線，利用Western Blot檢測不同放療劑量下PBK的表達情況，最后收集50例局部晚期前列腺癌患者，分析PBK表達與放療敏感性的關系。結果：PBK是前列腺癌的放療抵抗基因，PBK在腫瘤細胞中高表達，PBK高表達患者總生存率低。當放療劑量提高時，PBK的表達也相應增高，放療抵抗患者PBK表達高于放療敏感者。結論：PBK促進前列腺癌患者放療抵抗，并且有可能成為前列腺癌的潛在治療靶點。

[關鍵詞]" "前列腺癌；PDZ結合激酶；放療抵抗

[中圖分類號]" "R737.25" " " " " " " "[文獻標志碼]" "A" nbsp; " " " " " "[文章編號]" "1674-7887（2024）04-0333-04

PBK promotes radiotherapy resistance in prostate cancer patients

[Abstract]" "Objective： To investigate the effect and prognostic significance of PDZ-binding-kinase（PBK） in radiotherapy for prostate cancer. Methods： The radiotherapy resistance genes in prostate cancer cells were downloaded from the gene expression omnibus（GEO） database， and the samples meeting the threshold were selected. The differences in PBK expression between prostate cancer tissues and normal tissues were analyzed. The survival curve of prostate cancer was drawn based on the expression of PBK. Finally， Western Blot was used to detect the expression of PBK under different radiotherapy doses. Results： PBK was the radiotherapy resistance gene of prostate cancer， and PBK was highly expressed in tumor cells. In patients with high PBK expression， the former overall survivals was lower. When the radiotherapy dose was increased， the expression of PBK was also increased. Conclusion： PBK can promote radiotherapy resistance in patients with prostate cancer， and may be a potential therapeutic target for prostate cancer.

[Key words]" "prostate cancer; PDZ-binding-kinase; radiotherapy resistance

前列腺癌是老年人常見的惡性腫瘤，在全球男性惡性腫瘤中發(fā)病率高居第二位，也是因癌癥導致死亡的第五大原因[1]。近年來，我國前列腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，甚至反超歐美國家，占我國男性惡性腫瘤的12%，嚴重威脅男性的健康[2]。前列腺癌早期癥狀不明顯，多數患者初次就診時即為中晚期，單純手術治療不能有效解決問題，因此放療成為多數部分晚期患者的選擇之一。雖然放療較其他方式在部分晚期患者中有明顯的優(yōu)勢，但若腫瘤細胞對放療產生抵抗，其療效會受到明顯影響[3]。前列腺癌發(fā)生放療抵抗的具體機制尚不清楚，可能與DNA修復、mTOR信號通路、自噬等途徑有關[4]。

PDZ結合激酶（PDZ-binding-kinase， PBK）作為一種新發(fā)現的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，也被稱作T-LAK細胞源蛋白激酶（T-LAK cell originated protein kinase， TOPK）[5]。它隸屬于細胞外調節(jié)激酶3/6相關的蛋白質家族，包含主要分布在細胞質和細胞核中的322個氨基酸[6-7]。目前研究[8]發(fā)現，PBK分子與cdk1/cyclin B1復合物關系緊密，一同參與有絲分裂，在細胞周期G2/M期中發(fā)揮重要作用。PBK可能影響有絲分裂的紡錘體形成，當PBK受到抑制時，紡錘體變得模糊，且此后也無法順利完成胞漿分裂。由此可見，PBK參與腫瘤細胞的增殖分化，影響腫瘤的進展。

目前尚無PBK分子影響前列腺癌放療抵抗的有關研究，因此本研究基于基因表達綜合（gene expression omnibus， GEO）數據庫中的GSE134499數據集并結合臨床數據，初步探索PBK分子對前列腺癌放療抵抗的影響。

1" "資料與方法

1.1" "GEO數據庫分析" "從GEO數據庫中篩選出包含一般資料以及預后數據的前列腺癌樣本，尋找低轉移細胞系和高轉移細胞系間差異表達的放療抵抗基因，分析非配對樣本中前列腺癌組織和正常組織中PBK的表達情況。從GEO數據庫中篩選滿足條件的轉移組，篩去共有差異后，找出前列腺放療抵抗的基因PBK；為研究對比PBK在癌細胞與正常細胞中的表達量，選取原發(fā)腫瘤、復發(fā)/轉移瘤和正常細胞，分析其中的PBK表達量；為研究PBK對前列腺癌患者預后的影響，將前列腺癌患者按照PBK表達量的高低進行分組，用Log-Rank檢驗和Cox回歸分析不同表達量的PBK所導致的不同預后時間；為研究PBK與放療抵抗的關系，使用Western Blot法檢測在不同情況下，放療劑量的改變對PBK分子表達的影響。

1.2" "臨床資料" "收集2020年1月—2022年12月在南通大學附屬醫(yī)院及南通市第一人民醫(yī)院就診的未行前列腺癌根治術且行盆腔局部放療的局部晚期前列腺癌患者50例，所有患者均經病理明確診斷。收集患者的一般資料，免疫組織化學實驗檢測前列腺癌組織中PBK的表達情況，并分析臨床相關數據。根據實體瘤治療評價RECIST1.1標準，放療結束6個月后對目標病灶進行評價，分為：完全緩解（complete response， CR）、部分緩解（partial response， PR）、病情穩(wěn)定（stable disease， SD）與病情進展（progressive disease， PD）。放療敏感定義為放療效果評估為CR及PR的患者；放療抵抗定義為放療效果評估為SD及PD的患者。

1.3" "免疫組織化學" "按照EnVision二步法進行免疫組織化學實驗，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。組織芯片脫蠟，然后置于0.01 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）中，100 ℃微波抗原修復處理20 min，待組織芯片自然冷卻至室溫，滴加過氧化物酶阻斷劑（3%H2O2）孵育15 min。0.01 mmol/L PBS（pH 7.4）沖洗3 min，重復3次。滴加兔抗單克隆PBK抗體（Proteintech，貨號：16110-1-AP，1∶100稀釋），37 ℃孵育60 min。再次PBS沖洗3 min，重復3次。滴加HRP標記的EnVisionTM二抗試劑，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3 min，重復3次。DAB顯色3 min。蘇木精復染（淡染）。梯度乙醇脫水、透明、封固。采用已知陽性染色的前列腺癌組織切片作為陽性對照。染色結果由２位病理醫(yī)師綜合判斷，根據染色強度和陽性細胞百分比綜合判斷。染色強度評分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞百分比lt;10%為0分，10%～25%為1分，gt;25%～50%為2分，gt;50%～75%為3分，gt;75%為4分。根據兩項乘積綜合判定：≤6分為低表達，gt;6分為高表達。

1.4" "統(tǒng)計學方法" "基于SPSS 22.0軟件對前列腺癌患者的預后進行數據分析。計數資料采用χ2檢驗，以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2" "結" " " 果

2.1" "前列腺癌中的放療抵抗基因" "在GSE134499基因表達數據庫中，以|log2FoldChange|gt;1.5且P＜0.01作為篩選閾值，尋找低轉移細胞系LNCaP和高轉移細胞系DU145間差異表達的放療抵抗基因，發(fā)現PBK分子在高轉移細胞系內與放療抵抗相關（圖1）。

2.2 " PBK在腫瘤組織及正常組織中的表達情況" "對前列腺癌組織和正常組織中PBK的表達進行分析，可以發(fā)現PBK在原發(fā)腫瘤（n=78）、復發(fā)/轉移瘤（n=14）中的表達高于正常組織（n=52），且在復發(fā)/轉移瘤中的表達最高（Plt;0.05），見圖2。

2.3 " PBK表達與前列腺癌患者的預后" "前列腺癌患者中PBK的表達水平與無進展生存期（progression free survival， PFS）呈負相關。PBK高表達的前列腺癌患者總生存率低，而PBK低表達的總生存率則較高（HR=2.24， 95%CI： 1.45～3.45，Plt;0.000 1）（圖3）。

2.4 " PBK與細胞放療抵抗的關系" "分別用1、2、4 Gy放療劑量處理DU145細胞，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，Western Blot檢測PBK示：隨著放療劑量的增加，PBK表達升高（圖4A）。當用恒定4 Gy處理DU145細胞時，分別在6、12、24、48 h后提取蛋白，發(fā)現隨著時間推移，腫瘤細胞放療劑量逐漸下降，PBK表達也逐漸減弱（圖4B），因此PBK與放療抵抗密切相關。

2.5 " PBK與臨床放療的相關性" "在50例前列腺癌患者中，放療敏感者38例，其中PBK高表達16例（42.1%）；放療抵抗12例，其中PBK高表達9例（75.0%）（圖5），兩組PBK表達率比較差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），提示PBK高表達與前列腺癌放療抵抗相關。

3" "討" " " 論

據國際癌癥中心發(fā)布的2018全球腫瘤統(tǒng)計結果，前列腺癌已成為男性的高發(fā)腫瘤，在所有腫瘤中位居第二[9]。由于患病時初始癥狀不明顯，因此前列腺癌生存率較低，而老年人發(fā)病率高、生存率低的特點尤其明顯[10]。根據歐洲的長期隨訪研究[11]，前列腺癌有家族遺傳傾向，遺傳因素占發(fā)病風險的42%～45%。此外，代謝綜合征、吸煙、脂肪攝入量過多都是前列癌發(fā)病的危險因素[12]。而經常食用富含番茄紅素和硒的食物有助于降低發(fā)病率[13]。由于多數患者發(fā)現較晚，所以單純的手術效果并不理想，需要配合放療及內分泌治療。然而，部分患者在放療后出現局部復發(fā)，放療抵抗是主要原因[14]。因此，研究影響前列腺癌放療抵抗的因素是必要的，以改善放療效果及生存率。

作為MAPKK分子家族成員之一的PBK/TOPK，PBK參與惡性腫瘤細胞的增殖、分化，影響腫瘤細胞的生長和轉化[15]。它不僅在腫瘤細胞中高度表達，如淋巴瘤、肺癌、結腸癌、膀胱癌及乳腺癌等，還參與癌細胞耐藥[16]。PBK過表達影響了人宮頸癌HeLa細胞的凋亡抵抗，使HeLa細胞對化療藥耐藥[17]；過表達的PBK在高級別漿液型卵巢癌中的相關位點誘導自噬，使卵巢癌細胞對鉑類化療藥耐藥[18]；高表達PBK使結腸癌對靶向藥物耐藥[19]。PBK的高表達也存在于前列腺癌中，影響前列腺癌的增殖、分化及對放療的效果，但PBK在前列癌中的放療敏感性研究并不十分明確[20]。因此，本研究旨在探討PBK分子對前列腺癌放療敏感性的影響。

本研究基于GEO數據庫中的GSE134499基因表達數據庫，探索可能會影響前列腺癌放療抵抗的基因和機制。首先，在GSE134499數據庫中尋找前列腺癌細胞中放療抵抗基因，結果發(fā)現，PBK在高轉移細胞內與放療抵抗有關。其次，對原發(fā)腫瘤、復發(fā)腫瘤及正常組織中PBK的表達進行差異分析，發(fā)現PBK在腫瘤細胞中的表達顯著高于正常組織，且復發(fā)/轉移瘤中尤其明顯。隨后，繪制生存曲線發(fā)現，PBK高表達的前列腺癌總生存率更低。Western Blot檢測不同情況下PBK的表達，顯示放療劑量越大，PBK表達程度越高，PBK與腫瘤放療抵抗相關。最后，通過對50例進行放療的局部晚期前列腺癌患者的癌組織進行免疫組織化學檢測，發(fā)現放療抵抗患者的PBK表達高于放療敏感者，與生信分析以及基礎實驗結果一致，但具體機制仍需進一步研究。

綜上所述，PBK在前列腺癌組織中高表達，PBK的過表達造成前列腺癌放療抵抗，揭示了PBK分子可能成為前列腺癌的潛在診斷指標及治療靶點，同時也為前列腺癌的放療方案及預后提供了新的思路。

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