[摘" "要]" "目的：為了使透明質(zhì)酸（hyaluronic acid， HA）具備負(fù)載和釋放生長(zhǎng)因子的能力，設(shè)計(jì)制備透明質(zhì)酸-肝素（hyaluronic acid-heparin， HA-Hep）支架作為骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2， BMP-2）緩釋載體，并探討其對(duì)牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells， DPSCs）成牙本質(zhì)分化的影響。方法：化學(xué)方法制備不同投料比HA-Hep材料。通過傅立葉變換紅外光譜與元素分析技術(shù)表征肝素與HA的接枝位點(diǎn)、效率等特點(diǎn)。掃描電鏡觀察該材料微觀形態(tài)和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。借助靜電吸附法將BMP-2加載至HA-Hep，并測(cè)繪其釋放曲線。通過測(cè)定DPSCs增殖情況評(píng)價(jià)該材料的生物相容性。qPCR檢測(cè)成牙分化相關(guān)基因的表達(dá)水平，評(píng)估HA-Hep負(fù)載BMP-2對(duì)DPSCs成牙分化的影響。結(jié)果：HA-Hep微觀呈疏松多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能夠緩釋BMP-2達(dá)28 d，且釋放速率隨材料肝素含量比例的增加呈減緩趨勢(shì)。HA-Hep對(duì)DPSCs增殖有促進(jìn)作用，且與材料濃度呈正相關(guān)；qPCR結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，載BMP-2的HA-Hep材料組牙本質(zhì)涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein， DSPP）、Ⅰ型膠原蛋白（typeⅠcollagen， Col-1）和牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白-1（dentin matrix protein-1， DMP-1）表達(dá)水平在7、14 d均顯著升高（均P＜0.001）。結(jié)論：肝素修飾HA能延緩BMP-2釋放，HA-Hep負(fù)載BMP-2可上調(diào)DPSCs成牙基因（DSPP、Col-1、DMP-1）的表達(dá)，有助于生長(zhǎng)因子在細(xì)胞分化中發(fā)揮長(zhǎng)期效應(yīng)。

[關(guān)鍵詞]" "透明質(zhì)酸；肝素；緩釋；支架；生長(zhǎng)因子；牙髓干細(xì)胞

[中圖分類號(hào)]" "R783.3" " " " " " " "[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]" "A" " " " " " " "[文章編號(hào)]" "1674-7887（2024）04-0320-06

Preparation of hyaluronic-heparin scaffold capable of sustainably releasing BMP-2 and the study of its influence on the differentiation of dental pulp stem cells

[Abstract]" "Objective： In order to enable hyaluronic acid（HA） to load and release growth factors， a hyaluronic acid-heparin （HA-Hep）scaffold was designed as a sustained-release carrier for bone morphogenetic protein 2（BMP-2）， and the effect of the scaffold on odontogenic differentiation of dental pulp stem cells（DPSCs） was studied. Methods： HA-Hep materials with different ratios were prepared using chemical methods. The connection position and efficiency of heparin and hyaluronic acid were detected by Fourier transform infrared spectroscopy and elemental analysis. The microstructure and structural characteristics of the materials were observed by scanning electron microscope. BMP-2 was loaded into HA-Hep by electrostatic adsorption method， and its release curve was measured and drawn. To evaluate the biocompatibility of HA-Hep by detecting the proliferation of DPSCs. The expression levels of odontogenic differentiation-related genes were detected by qPCR to evaluate the effect of HA-Hep loading BMP-2 on odontogenic differentiation of dental pulp stem cells. Results： Microscopically， HA-Hep showed a loose porous network structure. The release of BMP-2 was sustained for 28 days， and the release rate slowed down with the increase of heparin content. HA-Hep promoted the proliferation of DPSCs was positively correlated with the materials concentration. qPCR results showed that the expression levels of dentin sialophosphoprotein（DSPP）， typeⅠcollagen（Col-1）， and dentin matrix protein-1（DMP-1） in BMP-2-loaded HA-Hep material group were significantly higher than those in the control group at 7 and 14 days（all Plt;0.001）. Conclusion： Heparin-modified HA can delay the release of BMP-2. HA-Hep loaded with BMP-2 can up-regulate the expression of odontoblast genes（DSPP， Col-1， and DMP-1） in DPSCs， which contributes to the long-term effect of growth factors in cell differentiation.

[Key words]" "hyaluronic acid; heparin; slow release; scaffold; growth factor; dental pulp stem cell

因深齲、外傷等導(dǎo)致的牙髓感染是一類口腔常見疾病，目前主要通過根管治療控制感染、保留患牙[1-2]。但根管治療后失去生活牙髓的牙齒因喪失感覺、營(yíng)養(yǎng)等功能而變脆易裂[3]。牙髓再生是一種利用組織工程技術(shù)，即應(yīng)用干細(xì)胞、支架和生長(zhǎng)因子等重建牙髓與牙本質(zhì)、根尖周的功能性關(guān)聯(lián)，最終使患牙能夠再生牙髓組織的新技術(shù)，逐漸成為解決牙髓疾病的治療策略和研究熱點(diǎn)[4-5]。與傳統(tǒng)根管治療相比，牙髓再生可以更有效地促進(jìn)牙齒的自然修復(fù)過程，降低與根管治療相關(guān)的根折或根管再感染的可能性[6]。牙髓再生有望成為傳統(tǒng)根管治療的替代方案，使功能性牙髓得以再生，從而更好地恢復(fù)患牙功能。目前，已有研究[7]借助牙髓組織工程技術(shù)再生具有神經(jīng)、血管的牙髓樣組織。然而牙髓再生仍然存在挑戰(zhàn)，例如支架材料的選擇與制備，生長(zhǎng)因子易失活、利用率較低等，因此制備功能型支架并有效利用生長(zhǎng)因子是牙髓再生成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[8]。

透明質(zhì)酸（hyaluronic acid， HA）是體內(nèi)天然存在的多糖，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一，在調(diào)節(jié)組織損傷和修復(fù)中起著至關(guān)重要的作用[9]。D.ATILA等[10]制備了載有Tideglusib（Td）與人參皂苷Rg1的可注射HA水凝膠系統(tǒng)，經(jīng)體外研究發(fā)現(xiàn)，水凝膠通過釋放Td促進(jìn)牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells， DPSCs）成牙本質(zhì)分化，通過釋放Rg1促進(jìn)牙髓血管化。HA具有優(yōu)良的生物相容、生物降解和非免疫原，在牙髓再生的支架制備方面具有巨大潛力，是牙髓組織修復(fù)再生的理想生物材料。

生長(zhǎng)因子是刺激細(xì)胞活動(dòng)、促進(jìn)組織修復(fù)和再生的信號(hào)肽，是組織工程中常用的重要藥物之一[11-12]。有研究[13]將牙本質(zhì)形成誘導(dǎo)因子骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2， BMP-2）或牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白-1（dentin matrix protein-1， DMP-1）的質(zhì)粒DNA加載到經(jīng)過處理的牙本質(zhì)支架上，快速誘導(dǎo)DPSCs分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞，從而重建牙本質(zhì)-牙髓界面，且表現(xiàn)出與天然組織相似的結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能。此外，還有學(xué)者[14]研究BMP-2促進(jìn)牙本質(zhì)形成的分子機(jī)制，證實(shí)BMP-2通過p38MAPK介導(dǎo)，激活WNT/β-catenin信號(hào)通路，從而促進(jìn)DPSCs的成牙分化和牙本質(zhì)的形成?？梢?，生長(zhǎng)因子在干細(xì)胞誘導(dǎo)與促進(jìn)牙本質(zhì)形成方面具有重要作用，但生長(zhǎng)因子的突釋性、體內(nèi)穩(wěn)定性差等特性限制了其應(yīng)用[15-16]，導(dǎo)致再生體系難以維持長(zhǎng)期的誘導(dǎo)效果。迄今為止，生長(zhǎng)因子的可控和持續(xù)輸送仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。因此，構(gòu)建生長(zhǎng)因子原位緩釋的載體系統(tǒng)已逐漸成為功能型生物支架制備的目標(biāo)之一。

肝素是一種高度硫酸化的天然糖胺聚糖，已被證明能與多種蛋白質(zhì)相互作用，其酸性硫酸鹽基團(tuán)與生長(zhǎng)因子堿性結(jié)合結(jié)構(gòu)域存在靜電吸附作用，具有較高親和力，可作為載體制備緩釋藥物[17]。許多生長(zhǎng)因子通過與肝素相互作用而與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合，細(xì)胞外基質(zhì)能夠保護(hù)生長(zhǎng)因子免于降解并調(diào)節(jié)其在組織中的分布[18]。目前，肝素已被廣泛應(yīng)用于生長(zhǎng)因子的控制釋放與穩(wěn)定調(diào)節(jié)[19]，但以肝素修飾支架應(yīng)用于DPSCs分化及牙髓再生的研究尚不多見。

本研究以牙髓天然組分HA為支架主鏈，借助肝素修飾制備復(fù)合支架，選取BMP-2為模型生長(zhǎng)因子檢測(cè)支架緩釋情況，并進(jìn)一步探討其對(duì)DPSCs增殖分化的影響，為牙髓再生制備功能型支架材料提供新思路。

1" "材料與方法

1.1" "試劑與儀器" "HA（山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司）；嗎啉乙磺酸（morpholine ethanesulfonic acid， MES）、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide， NHS）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽[1-ethyl -（3-dimethylaminopropyl） carbodiimide hydrochloride， EDC]（上海阿拉丁生物試劑有限公司）；肝素鈉（上海源葉生物科技有限公司）；重組人BMP-2（MedChemExpress，美國(guó)）；重組人BMP-2 ELISA分析試劑（江蘇綠葉生物科技有限公司）；高糖DMEM液體培養(yǎng)基、FBS（Gibco，美國(guó)）；MTT試劑盒（Amresco，美國(guó)）；TRIzol（Takara，中國(guó)）；Hifair"Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（Yeasen，中國(guó)）；引物合成（Takara，中國(guó)）；HieffTM qPCR SYBR"Green Master Mix（Yeasen，中國(guó)）；冷凍干燥機(jī)（Labconco，美國(guó)）；傅立葉變換紅外光譜儀（Bruker，德國(guó)）；掃描電子顯微鏡（JEOL，日本）；元素分析儀（Elementar，德國(guó)）；倒置相差顯微鏡（OLYMPUS，日本）；離心機(jī)（Eppendorf，美國(guó)）；酶標(biāo)儀（Rayto，美國(guó)）；MX3005P qPCR system（Agilent，美國(guó)）。

1.2" "實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1" "透明質(zhì)酸-肝素（hyaluronic acid-heparin， HA-Hep）支架的制備與表征" "設(shè)計(jì)3種投料比（表1）。將250.0 mg透明質(zhì)酸溶于50 mL MES緩沖液（pH4.5、0.05 mol/L），先后加入交聯(lián)劑（142.7 mg NHS、237.7 mg EDC），隨后加入對(duì)應(yīng)比例的肝素，室溫?cái)嚢柽^夜，然后滲析純化3 d，反應(yīng)式如圖1。凍干72 h，得到HA-Hep。

取少量HA、HA-Hep通過傅立葉變換紅外光譜儀檢測(cè)其紅外吸光度；通過掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope， SEM）觀察HA-Hep凍干樣品的微觀形態(tài)和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)；利用元素分析儀測(cè)量肝素原材料和HA-Hep材料的硫元素（S）含量，計(jì)算各組材料肝素含量。

1.2.2" "DPSCs的分離與培養(yǎng)" "經(jīng)患者本人知情同意與荊楚理工學(xué)院學(xué)術(shù)誠(chéng)信與科研倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)同意（倫理審批號(hào)：2024-01-04），選取人新鮮拔除的健康第三磨牙，劈開取髓、剪碎、消化分散后靜置培養(yǎng)1周。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋瓶底面積80%時(shí)傳代培養(yǎng)，直至P2代備用（圖2）。

1.2.3" "HA-Hep對(duì)DPSCs體外增殖的影響" "稱取10 mg不同比例HA-Hep材料，紫外消毒后分別浸泡在10 mL培養(yǎng)基中，得到質(zhì)量濃度為1 mg/mL（0.1%）的HA-Hep混懸液。為了后續(xù)實(shí)驗(yàn)在材料濃度篩選與應(yīng)用方面的需要，將上述0.1%的HA-Hep混懸液再倍比稀釋到0.05%、0.01%，37 ℃靜置24 h后收集上清液作為HA-Hep條件培養(yǎng)基備用。將P2代DPSCs接種至96孔板（3×103個(gè)/孔），對(duì)照組用正常培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組用上述條件培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1、3 d。按照MTT法處理后檢測(cè)各孔在波長(zhǎng)490 nm處的吸光度。

1.2.4" "BMP-2的載入與釋放" "稱取10 mg HA與不同比例HA-Hep材料，紫外消毒后分別浸泡于1 mL BMP-2溶液（500 ng/mL），12 h后，離心取全部上清留存，沉淀凍干得到負(fù)載BMP-2的HA-Hep材料（HA-Hep-BMP-2），將其浸泡于等量PBS溶液中，37 ℃孵育，分別在1、7、14、21、28 d離心（3 000 r/min，10 min）后吸取上清液（500 μL），同時(shí)補(bǔ)充等量PBS溶液。最后，用ELISA試劑盒和酶標(biāo)儀測(cè)定上述收集到的上清液和BMP-2標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線與釋放曲線。

1.2.5" "HA-Hep載BMP-2對(duì)DPSCs體外分化的實(shí)驗(yàn)" "通過上述初步篩選，選取投料比為10∶5的HA-Hep及相應(yīng)的HA-Hep-BMP-2進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。分別稱取10 mg HA、HA-Hep、HA-Hep-BMP-2，紫外消毒，同樣方法制備濃度為0.1%的條件培養(yǎng)基備用。選取P2代DPSCs接種至6孔板（5×104個(gè)/孔），實(shí)驗(yàn)組換成上述條件培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)7、14 d。選取β-actin為內(nèi)參基因，利用qPCR技術(shù)檢測(cè)目的基因牙本質(zhì)涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein， DSPP）、Ⅰ型膠原蛋白（typeⅠcollagen， Col-1）和牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白-1（dentin matrix protein-1， DMP-1）表達(dá)結(jié)果，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

1.2.6" "統(tǒng)計(jì)學(xué)方法" "所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次，數(shù)據(jù)表示為x±s。通過SPSS 22.0軟件采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2" "結(jié)" " " 果

2.1" "獲得HA-Hep支架材料" "紅外光譜曲線顯示，HA-Hep在1 244 cm-1周圍存在SO3-拉伸帶峰，為肝素分子中SO3-基團(tuán)，而HA曲線中未發(fā)現(xiàn)此峰（圖3A），說明肝素成功接枝到HA。肉眼觀察HA-Hep材料呈白色扁圓形的海綿樣外觀（圖3B），形態(tài)穩(wěn)定。

掃描電鏡觀察HA-Hep呈疏松網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖4），其中10∶5和10∶7兩組材料可見三維多孔結(jié)構(gòu)，孔隙排布均勻，孔間連通度良好，經(jīng)ImageJ軟件測(cè)量上述兩組材料的平均孔徑分別為（58.07±13.37） μm和（62.96±14.23） μm。

通過元素分析發(fā)現(xiàn)，3組材料均檢測(cè)出S元素，而HA中不含有，說明肝素接枝成功。將原材料的肝素含量定義為100%，計(jì)算各組材料肝素含量百分比，其中最高為10∶7組，最低為10∶3組（表2）。

2.2" "HA-Hep材料對(duì)細(xì)胞體外增殖的影響" "與對(duì)照組相比，3組材料在1、3 d對(duì)DPSCs增殖均有促進(jìn)作用，且隨各組濃度的升高促進(jìn)作用逐漸增強(qiáng)，說明HA-Hep對(duì)細(xì)胞增殖無毒性。觀察1 d時(shí)，當(dāng)濃度為0.01%時(shí)，10∶7組促進(jìn)DPSCs增殖效果強(qiáng)于10∶5組（P=0.004），10∶5組與10∶3組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)濃度為0.05%與0.1%時(shí)，10∶3組促進(jìn)DPSCs增殖效果均顯著強(qiáng)于其他兩組（Plt;0.001）。觀察3 d時(shí)，當(dāng)濃度為0.01%與0.05%時(shí)，10∶5組促進(jìn)DPSCs增殖效果均顯著強(qiáng)于其他兩組（Plt;0.001）；當(dāng)濃度為0.1%時(shí)，10∶5組的促進(jìn)作用高于10∶3組（P=0.032），顯著高于10∶7組（Plt;0.001）（圖5）?？梢姡?組不同比例相比，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，10∶5組對(duì)DPSCs的增殖表現(xiàn)出漸強(qiáng)的促進(jìn)作用。不同濃度相比，3組材料均在高濃度（0.1%）時(shí)表現(xiàn)出更強(qiáng)的增殖促進(jìn)作用。鑒于上述結(jié)果綜合考慮，預(yù)選取比例為10∶5、濃度為0.1%的材料進(jìn)行后續(xù)分化實(shí)驗(yàn)。

2.3" "BMP-2的釋放" "繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖6A）和BMP-2釋放曲線（圖6B），3組材料均表現(xiàn)為緩慢釋放曲線，且釋放率與肝素含量呈負(fù)相關(guān)。其中，對(duì)照組HA在1 d的釋放率為51.06%，存在一定突釋，7 d累積釋放率達(dá)到66.49%，此后釋放曲線增長(zhǎng)緩慢，28 d釋放率為70.73%。

10∶3組在1 d釋放率為27.30%，7 d累積釋放率達(dá)45.68%，14 d釋放率達(dá)58.47%，此后釋放趨于平緩；10∶5和10∶7組1 d釋放率分別為10.65%和6.76%，低于HA組與10∶3組的首日釋放率，此后釋放曲線均呈現(xiàn)緩慢平穩(wěn)上升之勢(shì)，28 d累積釋放率分別為33.16%和28.15%，均低于10∶3組，總體呈現(xiàn)緩釋趨勢(shì)。

2.4" "載BMP-2的HA-Hep對(duì)DPSCs成牙分化的影響" "觀察DSPP的表達(dá)，載BMP-2組相比于其他3組，在7、14 d均顯著上調(diào)（Plt;0.001）；HA-Hep組在7、14 d均明顯高于對(duì)照組與HA組（Plt;0.001）；HA組在7 d與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在14 d高于對(duì)照組（P=0.002）（圖7）。

觀察Col-1的表達(dá)，載BMP-2組與對(duì)照組相比，在7、14 d顯著升高（Plt;0.001）；與HA-Hep組相比7 d有所升高（P=0.011），14 d明顯增高（P=0.003）；與HA組相比7 d明顯升高（P=0.009），14 d顯著升高（Plt;0.001）；HA-Hep在7 d與對(duì)照組、HA組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在14 d高于HA組（P=0.02）與對(duì)照組（P=0.005）；HA組與對(duì)照組在7、14 d比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖7）。

觀察DMP-1的表達(dá)，載BMP-2組相比于其他3組，在7、14 d均顯著上調(diào)（Plt;0.001）；HA-Hep組在7、14 d均顯著高于對(duì)照組（Plt;0.001），與HA組7 d比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在14 d高于HA組（P=0.005）；HA組相較于對(duì)照組在7 d明顯增高（P=0.002），在14 d差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖7）。

3" "討" " " 論

牙髓組織工程需要干細(xì)胞、支架和生長(zhǎng)因子的合理搭配與恰當(dāng)應(yīng)用，其中生長(zhǎng)因子由于生物半衰期短、局部清除快等特性難以長(zhǎng)期發(fā)揮誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化的功能。肝素作為一種高度硫酸化的糖胺聚糖，是由糖醛酸和葡萄糖胺組成的二糖單元，其中含有帶大量負(fù)電荷的磺酸基團(tuán)（SO3-），對(duì)生長(zhǎng)因子帶正電荷的氨基酸殘基具有強(qiáng)親和性，可作為載體制備緩釋藥物[20]。因此本研究以HA為主鏈，借助交聯(lián)劑EDC與NHS使HA的羧基（-COOH）與肝素的氨基（-NH2）結(jié)合制備HA-Hep復(fù)合支架，并探討該支架作為載體緩釋BMP-2的特點(diǎn)及其對(duì)DPSCs成牙分化的影響。

BMP-2是一種有效的骨誘導(dǎo)因子，常用于誘導(dǎo)DPSCs的成牙成骨分化，肝素與之結(jié)合能使肽因子持續(xù)被引入其同源信號(hào)受體，進(jìn)而增強(qiáng)BMP-2生物活性。A.K.JHA等[21]研究發(fā)現(xiàn)相同濃度下，高分子量肝素對(duì)TGFβ-1的負(fù)載量最大、釋放最慢。本研究以同等分子量肝素為原料，制備不同肝素含量的HA-Hep材料，結(jié)果顯示肝素含量較高材料（10∶7組）釋放最慢，與上述研究結(jié)果有相似之處，由此猜測(cè)肝素作為生長(zhǎng)因子載體，其分子質(zhì)量和相對(duì)濃度是調(diào)節(jié)負(fù)載效率和釋放動(dòng)力學(xué)的關(guān)鍵變量。

DSPP在牙本質(zhì)鈣化過程中參與羥基磷灰石礦物相的成核與控制，作為牙本質(zhì)非膠原基質(zhì)蛋白，是牙本質(zhì)正常礦化的指標(biāo)，也是成牙分化的重要標(biāo)志[22]。BMP-2可通過Smads和Runx2等作用調(diào)節(jié)DSPP的轉(zhuǎn)錄激活[23]。Col-1參與調(diào)節(jié)DPSCs的黏附和擴(kuò)散，在誘導(dǎo)細(xì)胞牙源性分化中起重要作用。DMP-1參與調(diào)節(jié)磷酸鹽穩(wěn)態(tài)，通過調(diào)控羥基磷灰石晶體成核影響牙本質(zhì)礦化，是成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的多功能蛋白[24]。本研究HA-Hep組相比于對(duì)照組和HA組，DSPP的表達(dá)在7、14 d均明顯上調(diào)（Plt;0.01），Col-1與DMP-1的表達(dá)相比于對(duì)照組和HA組在14 d也有不同程度上調(diào)（Plt;0.05），說明HA-Hep材料本身具有促進(jìn)DPSCs成牙本質(zhì)分化的潛能；載BMP-2組相比于HA-Hep組，DSPP與DMP-1的表達(dá)在7、14 d均顯著升高（Plt;0.001），Col-1的表達(dá)于7 d上調(diào)（Plt;0.05），14 d明顯升高（Plt;0.01），此結(jié)果提示以HA-Hep為載體釋放的BMP-2在促進(jìn)DPSCs成牙分化中發(fā)揮了長(zhǎng)期作用，說明肝素修飾的功能型支架在生長(zhǎng)因子應(yīng)用方面具備可行性，一定程度上彌補(bǔ)了半衰期短、重復(fù)給藥等不足。

總之，本研究制備的HA-Hep支架，微觀結(jié)構(gòu)疏松多孔，能促進(jìn)DPSCs增殖，可吸附BMP-2并延緩釋放，其負(fù)載的BMP-2可上調(diào)DPSCs成牙基因DSPP、Col-1、DMP-1的表達(dá)，該材料為牙髓再生緩釋支架的制備及生長(zhǎng)因子的有效應(yīng)用提供了新思路。

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