摘要 蛋白質(zhì)翻譯后修飾是賦予蛋白質(zhì)生理功能的關(guān)鍵機制，其中可逆的磷酸化修飾在眾多生命活動中起著開/關(guān)的作用，其異常變化通常與多種重大疾病過程密切相關(guān)。近年來，借助蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和方法，磷酸化蛋白質(zhì)的高通量、高精度定性與定量分析方法也得到了快速發(fā)展。本文綜述了近年來基于“自下而上”策略的磷酸化蛋白質(zhì)定量與化學(xué)計量分析方法的研究進展，包括磷酸化肽的富集方法、磷酸化肽質(zhì)譜碎裂方式、定量分析方法以及磷酸化位點的化學(xué)計量分析方法，并對磷酸化蛋白質(zhì)研究的發(fā)展趨勢進行了討論。

關(guān)鍵詞 磷酸化蛋白質(zhì)；富集方法；質(zhì)譜；定量方法；化學(xué)計量；評述

蛋白質(zhì)翻譯后修飾（Post-translational modifications， PTMs）是賦予蛋白質(zhì)生理功能的關(guān)鍵機制，包括磷酸化、糖基化和泛素化乙?；萚1]。PTMs 在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞周期、發(fā)育與分化、細胞凋亡以及多種代謝通路調(diào)控中發(fā)揮了極為重要的作用[2-3]。經(jīng)磷酸化修飾的蛋白質(zhì)在催化、調(diào)節(jié)及蛋白相互作用等方面發(fā)揮著重要作用，是很多生命過程的關(guān)鍵調(diào)控“開關(guān)”[4]，許多重大疾病（如心血管疾病、癌癥、神經(jīng)退行性疾病等）已被證明與一些蛋白質(zhì)的磷酸化水平變化密切相關(guān)。因此，對磷酸化蛋白質(zhì)的定量與化學(xué)計量分析對理解生命體代謝過程、疾病發(fā)生機制以及個體預(yù)防治療等均具有重要意義[5]。

質(zhì)譜技術(shù)具有高靈敏度、高精密度和高通量等優(yōu)勢，已被廣泛用于磷酸化蛋白質(zhì)的定量分析。然而，由于磷酸化蛋白質(zhì)的豐度極低，并且易受到生物基質(zhì)中高豐度肽段信號的干擾，采用質(zhì)譜技術(shù)很難對磷酸化肽直接進行檢測[6]。因此，對磷酸化肽進行高效、高特異性富集是實現(xiàn)對其準(zhǔn)確定性和定量分析的必要條件。針對上述問題，研究者開發(fā)了多種針對磷酸化肽富集和定量分析的方法，以提高磷酸化肽的質(zhì)譜檢測靈敏度和定量分析的準(zhǔn)確性，在此基礎(chǔ)上，開發(fā)了不同的質(zhì)譜分析技術(shù)和基于“自下而上”

策略的磷酸化蛋白質(zhì)定量和化學(xué)計量分析方法。本文介紹了磷酸化肽常用的富集方法、碎裂方式以及定量方法，總結(jié)了磷酸化位點的化學(xué)計量學(xué)及其研究方法近年來的研究進展，并討論了其未來的發(fā)展趨勢。

1 磷酸化肽的分離富集方法

目前，對于磷酸化蛋白質(zhì)的定量和化學(xué)計量分析多采用“自下而上”的研究策略，首先將蛋白質(zhì)酶解成肽段，再利用質(zhì)譜技術(shù)對這些肽段進行分析，實現(xiàn)磷酸化蛋白質(zhì)的鑒定和研究。對磷酸化肽段進行高效、高特異性的富集分離是實現(xiàn)高精度定性和定量分析的關(guān)鍵步驟[7]。研究者已基于磷酸化肽段化學(xué)特性開發(fā)了不同富集方法，大體可分為金屬離子親和色譜法、離子交換色譜法和免疫親和富集法（作用于pTyr 結(jié)構(gòu)域）等[8]。

固定化金屬親和色譜法（Immobilized metal-ion affinity chromatography， IMAC）[9]和金屬氧化物親和色譜法（Metal oxide affinity chromatography， MOAC）[10]是兩種最普遍的富集pSer、pThr 和pTyr 的親和色譜技術(shù)[11]。IMAC 方法利用螯合作用將金屬陽離子（Fe3+、Ga3+和Zr4+等）固定在磁珠、二氧化硅或樹脂等基質(zhì)上，再通過與帶負電荷磷酸基團的親和作用實現(xiàn)對磷酸化肽的選擇性保留。MOAC 主要是利用兩性金屬氧化物（如TiO2、ZrO2 和Fe3O4 等）[12]和磷酸根基團的結(jié)合作用富集磷酸化肽。Jensen 等[13]發(fā)現(xiàn)IMAC 更適宜多磷酸化肽富集而MOAC 更適宜單磷酸化肽富集。Thingholm 等[14]基于這兩個特點，將這兩種技術(shù)聯(lián)用，有效增加了磷酸化肽鑒定覆蓋率。

離子交換色譜技術(shù)是基于帶負電荷的磷酸化肽與色譜基質(zhì)上的離子交換基團發(fā)生靜電相互作用，主要有強陽離子交換法（Strong cation exchange， SCX）和強陰離子交換法（Strong anion exchange， SAX）。Quan 等[15]發(fā)現(xiàn)SCX 主要是吸附一些堿性磷酸化肽段（pIgt;8.0），而SAX 主要是吸附一些酸性磷酸化肽段（pI 介于2.91～6.45 之間）和一些強酸性磷酸化肽段（pIlt;3.0）。免疫親和富集方法基于抗原-抗體反應(yīng)，其特異性更強，但由于抗體開發(fā)周期長、價格昂貴以及結(jié)果重現(xiàn)性不佳等問題，主要用于富集豐度較低的酪氨酸磷酸化肽（pTyr）。SH2 結(jié)構(gòu)域是已知最大的一類pTyr 識別結(jié)構(gòu)域[16]。Bian 等[17]使用SH2 超親體并結(jié)合Ti4+-IMAC，實現(xiàn)了pTyr 的高特異性富集，從9 個人類細胞系中鑒定了約20000 個不同的pTyr和1000 余個酪氨酸磷酸化位點，其中36%的位點為首次鑒定。

N-磷酸化發(fā)生在堿性氨基酸上，形成磷酰胺鍵（P—N）。針對N-磷酸化肽的富集，已開發(fā)出pHis 抗體[18]和pArg 抗體[19]用于實現(xiàn)pHis 和pArg 肽段的有效富集。此外，基于IMAC 材料親和色譜保留時間差異的方法也被用于pHis 和pLys 肽段的有效富集[20-21]。為了提高N-磷酸化肽的覆蓋率，研究者又開發(fā)了多種富集N-磷酸化肽的方法。如Hu[22]等制備了具有核殼結(jié)構(gòu)的亞二微米硅球，在硅球表面鍵合雙二甲基吡啶胺雙鋅分子，在中性條件下基于該材料的On-tip 富集方法實現(xiàn)了N-磷酸化肽段的高效、高選擇性和快速富集，結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)，從HeLa 細胞中鑒定到3384 個N-磷酸化位點。然而， P—N 磷酰胺鍵具有較高的吉布斯自由能，在富集過程中易發(fā)生水解，因此，對于N-磷酸化肽的高效富集和檢測仍是一項具有挑戰(zhàn)性的研究工作。

2 磷酸化肽的質(zhì)譜碎裂方式

磷酸化肽離子的二級碎裂解離和解析是“自下而上”的磷酸化蛋白鑒定與定量分析策略的關(guān)鍵，因此磷酸化肽離子的碎裂方式在分析檢測磷酸化位點過程中至關(guān)重要[23]。常用的磷酸化肽離子質(zhì)譜碎裂方式包括碰撞誘導(dǎo)解離（Collision-induced dissociation， CID）、高能碰撞誘導(dǎo)解離（Higher-energy collisionaldissociation， HCD）、電子捕獲解離（Electron capture dissociation， ECD）、電子轉(zhuǎn)移解離（Electrontransfer dissociation， ETD）和紫外光誘導(dǎo)光解離（Ultraviolet photodissociation， UVPD）等。

CID 和HCD 是質(zhì)譜實驗中常用的磷酸化肽碎裂方法，均通過碰撞裂解肽段生成碎片離子，以獲得關(guān)于肽段的結(jié)構(gòu)和序列信息。CID 是通過氣相肽離子與惰性氣體（例如氦、氮）碰撞增加肽離子的內(nèi)能，進而使肽離子碎裂[24-25]。雖然CID 的效率高，易于實現(xiàn)，但是CID 碎裂會造成磷酸化肽母離子及其b 型和y 型離子的非序列性中性丟失，丟失的中性部分可能是磷酸基團，影響磷酸化狀態(tài)和結(jié)構(gòu)的分析。HCD 是通過高能碰撞誘導(dǎo)解離產(chǎn)生碎片離子，常用于離子阱式質(zhì)譜儀（如Orbitrap），利用多極碰撞單元或碰撞池實現(xiàn)， HCD 碰撞的能量比CID 強很多，因此會產(chǎn)生更多的碎片離子[26]，與CID 相比， HCD 碎裂中b 型和y 型離子仍然會經(jīng)歷中性丟失，盡管中性丟失發(fā)生的頻率或程度較小，但仍會阻礙鑒定和位點定位[27]。

ECD 和ETD 都是利用電子與磷酸化肽離子的相互作用實現(xiàn)碎裂。ECD 依賴于多電荷氣相陽離子對低能電子的捕獲，通過低能量的自由電子與質(zhì)子化的多電荷蛋白質(zhì)或肽離子相互作用放熱而瞬間發(fā)生碎裂，主要產(chǎn)生由N—C 鍵斷裂形成的c 和z 類型碎片離子[28]。Kruger 等[29]發(fā)現(xiàn)CID 能產(chǎn)生更多的碎片離子，而ECD 能解離不同類型的化學(xué)鍵，將ECD 與CID 聯(lián)用可提高磷酸化蛋白測序的效率與準(zhǔn)確度，增加磷酸化肽段鑒定覆蓋率。ETD 利用低電子親和力的陰離子將電子轉(zhuǎn)移到多電荷肽陽離子，使其發(fā)生裂解，通過離子阱可有效地捕獲陰離子試劑和陽離子肽[30]。主要產(chǎn)生由N—C 鍵α 斷裂形成的c 和z 類型碎片離子，可以有效保留肽段骨架信息和磷酸化修飾信息，同時克服了ECD 中熱電子傳遞和轉(zhuǎn)移時間長的缺點。ECD 和ETD 在碎裂磷酸化肽中主要存在兩個問題：（1）ECD 和ETD 的碎裂效率均取決于母離子的電荷狀態(tài)，對于三電荷及更高電荷的肽都表現(xiàn)出良好碎裂效率，但對于最常見的雙電荷磷酸化肽的碎裂效率不足；（2）ECD 和ETD 碎裂頻率較低，需要較長的反應(yīng)時間才能實現(xiàn)母離子解離，相對于碰撞碎裂的方法需要更長的循環(huán)時間，對鑒定磷酸化肽的數(shù)量有影響[31]。

EThcD 融合了ETD 和高能碰撞解離HCD 兩種技術(shù)，其原理是先將較低能量的電子轉(zhuǎn)移解離，保留更多的修飾位點信息，然后通過高能碰撞解離產(chǎn)生更多的碎片離子，提供更詳細的序列信息，目前被廣泛應(yīng)用于磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)[32-33]。雖然EThcD 鑒定的磷酸化肽數(shù)目少于HCD，但其序列覆蓋率和位點定位的置信度比ETD 和HCD 顯著增加。磷酸化肽段經(jīng)ETD、HCD 和EThcD 碎裂后的MS/MS 譜圖見圖1，經(jīng)ETD 碎裂后磷酸化肽段序列覆蓋率較低，經(jīng)HCD 碎裂產(chǎn)生足夠多的b 離子和y 離子，但伴隨著大量中性損失；經(jīng)EThcD碎裂后的光譜圖提供了足夠的序列覆蓋，且沒有顯著的修飾中性損失[34]。Penkert等[34]使用含有磷酸化的合成肽驗證了EThcD 技術(shù)碎裂雙電荷磷酸化肽的能力，證明EThcD 在雙電荷磷酸肽的碎裂過程中優(yōu)于ETD，并認為EThcD 是鑒定蛋白質(zhì)中不穩(wěn)定的磷酸化新位點的首選方法。

UVPD 是利用紫外光激發(fā)磷酸化肽內(nèi)的鍵，引發(fā)磷酸化肽的離子解離，產(chǎn)生碎片離子，通過質(zhì)譜對離子質(zhì)荷比進行分析得到磷酸化位點和序列信息[35]。與HCD 相比， UVPD 產(chǎn)生的修飾損失顯著減少（如單、雙、三和四磷酸化肽離子分別減少47%、40%、50%和58%）， b 離子和y 離子損失也較少，并且顯示的離子得分顯著增加，如圖2 所示[36]。相比HCD， UVPD 提供的譜圖信息更多，能顯著減少磷酸化修飾基團的損失，并實現(xiàn)在納秒時間尺度內(nèi)深度分析磷酸化蛋白質(zhì)組樣品[36]。Robinson 等[37]發(fā)現(xiàn)，與HCD 相比， UVPD 提供了更多類型的子離子，并改善了子離子上的磷酸基團信息的保留，雖然陰性模式UVPD 在檢測和測序高酸性磷酸化肽方面更優(yōu)，但由于陰性模式下的電離效率較低，在進行大規(guī)模分析時可能無法充分覆蓋整個樣品的范圍，因此， UVPD 適于與其它質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合（如HCD），充分利用各自的優(yōu)勢，提高磷酸化蛋白質(zhì)的檢測和測序能力，從而獲得更可靠的結(jié)果。不同磷酸化肽碎裂方式的優(yōu)缺點見表1。

3 磷酸化蛋白質(zhì)的定量分析方法

磷酸化蛋白質(zhì)的定量分析主要采用“自下而上”的研究策略。相較于蛋白質(zhì)組，磷酸化蛋白質(zhì)組的定量分析更困難，具體表現(xiàn)在：（1）生物樣品中非磷酸化肽含量較多，干擾磷酸化肽的質(zhì)譜信號；（2）由于磷酸化肽段具有負電性，在質(zhì)譜正離子模式下較難帶正電荷，離子化效率低；（3）磷酰鍵比肽鍵更易斷裂，增加了磷酸化肽定量的難度[38]。磷酸化肽段的定量分析方法有很多種，根據(jù)所用的質(zhì)譜信息可分為一級質(zhì)譜定量（MS1）和二級質(zhì)譜定量（MS2），如圖3 所示[11]。根據(jù)前處理過程的不同， MS1 定量又可分為非標(biāo)記定量（Label-free）、代謝標(biāo)記定量（Metabolic labeling）和化學(xué)標(biāo)記定量（Chemical labeling）等；MS2定量主要是等重標(biāo)記定量法。

3.1 非標(biāo)記定量方法

Label-free 方法的準(zhǔn)確性主要取決于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)的穩(wěn)定性。Label-free 主要有兩種方法：其一為譜圖計數(shù)法，對獲得的目標(biāo)肽段二級質(zhì)譜圖數(shù)量進行計數(shù)和比較，以此作為蛋白質(zhì)表達量差異的定量依據(jù)；其二為離子強度法，利用測定的多肽母離子的色譜峰面積實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的表達量的定量分析[39]。與標(biāo)記法相比， Label-free 無需使用特殊介質(zhì)或昂貴的試劑，避免了在標(biāo)記過程帶來的實驗誤差，同時不需要考慮標(biāo)記效率[40]。但是， Label-free 數(shù)據(jù)處理過程復(fù)雜、對儀器性能要求高、不適用于低豐度蛋白質(zhì)檢測。目前，已有研究者將Label-free 應(yīng)用于重大疾病相關(guān)磷酸化蛋白質(zhì)的定量分析，如Liu 等[41]利用高分辨率質(zhì)譜法和開放式搜索方法對胃癌患者的腫瘤及癌組織的磷酸化蛋白質(zhì)進行Label-free 定量分析，共鑒定了832 個與胃癌相關(guān)的磷酸化位點，為尋找放射治療耐藥性的重要靶點奠定了基礎(chǔ)。此外， Label-free 也應(yīng)用在識別生物標(biāo)志物方面，如De Oliveira 等[42]為識別胃腺癌患者血清生物標(biāo)志物，使用Label-free 對胃腺癌患者血清和非癌癥患者血清中的33 種肽進行了差異定量分析，其中，19 種肽在胃腺癌患者血清樣品中表達上調(diào)， 14 種肽表達下調(diào)。該研究表明，蛋白酶MMP-7 是一種有前景的生物標(biāo)志物。

3.2 代謝標(biāo)記定量方法

代謝標(biāo)記定量方法是通過細胞正常代謝使蛋白質(zhì)帶上同位素標(biāo)簽。典型的代謝標(biāo)記定量方法為氨基酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記法（Stable isotope labeling by amino acid in cell culture， SILAC）[43]。SILAC 將輕、中或重型穩(wěn)定同位素標(biāo)記的必需氨基酸（賴氨酸和精氨酸）加入細胞培養(yǎng)基，通過細胞的正常代謝，新合成的蛋白會帶上穩(wěn)定同位素標(biāo)簽，將各類型蛋白質(zhì)等量混合后進行質(zhì)譜分析，通過比較一級質(zhì)譜圖中同位素峰形的面積而進行相對定量分析[44]。SILAC 的主要優(yōu)勢是在實驗樣品前處理時進行標(biāo)記，從而將平行樣品處理過程中可能引起的誤差降至最低。但是， SILAC 需要經(jīng)過多次細胞分裂才能確保定量分析穩(wěn)定，因此不適合定量分析初代細胞。由于SILAC 可用于分析細胞、組織和體液等，因而被廣泛應(yīng)用于表征不同的生物樣本蛋白質(zhì)磷酸化差異[45]。Stepath 等[46]評估了Label-free、SILAC 和TMT 方法對磷酸化位點量化方面的性能，發(fā)現(xiàn)SILAC 在磷酸化位點的量化方面表現(xiàn)出較高的精度，是分析細胞培養(yǎng)模型中細胞信號傳導(dǎo)的首選方法。Erber 等[47]利用SILAC 技術(shù)研究海馬神經(jīng)元HT-22 細胞中急性和慢性缺鐵引起的磷酸化信號通路的變化，發(fā)現(xiàn)超過10%的磷酸化位點的相對豐度變化超過2 倍，表明缺鐵和缺氧顯著影響神經(jīng)元細胞中的磷酸化信號通路。一些SILAC 衍生方法也被應(yīng)用于磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析，如脈沖式穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)（Pulsed SILAC， pSILAC）[48]、高級穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)（Super-SILAC）[49]等。與SILAC 直接分析混合后的輕重標(biāo)記的樣品不同， Pulsed SILAC 技術(shù)是在細胞培養(yǎng)過程中將“輕”、“中”、“重”氨基酸交替加入到培養(yǎng)基中，并培養(yǎng)特定時間，以跟蹤和定量分析蛋白質(zhì)的動態(tài)變化[50]。Wu 等[51]基于Pulsed SILAC 開發(fā)出差異同位素標(biāo)記技術(shù)（DeltaSILAC）新策略，將細胞在不同時間點進行SILAC 標(biāo)記，比較不同時間點的蛋白質(zhì)組成的變化，該方法可以直接考察磷酸位點對蛋白質(zhì)壽命的影響，進一步分析磷酸化位點對蛋白質(zhì)表達壽命的影響。

3.3 化學(xué)標(biāo)記定量方法

化學(xué)標(biāo)記定量方法是采用物理和化學(xué)性質(zhì)相似的化學(xué)試劑對生物樣品進行標(biāo)記，再采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)對生物樣品進行定量分析。近十年來，化學(xué)同位素標(biāo)記受到越來越多的關(guān)注，并實現(xiàn)了對生物樣品中內(nèi)源性代謝物的準(zhǔn)確定量分析[52]。磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)中最常用的化學(xué)標(biāo)記定量方法是穩(wěn)定同位素二甲基標(biāo)記定量分析方法（Stable-isotope dimethyl labeling），該方法具有良好的標(biāo)記效率、簡單的實驗過程以及低廉的試劑成本，可用于分析多種類型樣本。二甲基標(biāo)記采用甲醛（CH2O）和氰代硼氫化鈉（NaBH3CN）兩種穩(wěn)定的同位素試劑標(biāo)記蛋白質(zhì)/肽的N 端或賴氨酸的氨基基團，使蛋白質(zhì)/肽標(biāo)記上不同的標(biāo)簽[53]，可在每個標(biāo)記位點與非標(biāo)記對應(yīng)物間產(chǎn)生28 個質(zhì)量單位值差，在每個對應(yīng)標(biāo)記同位素上產(chǎn)生4 個質(zhì)量單位值差，并且不會產(chǎn)生任何可檢測的副產(chǎn)物[54]。由于二甲基適用性強，因而被廣泛應(yīng)用于重大疾病的磷酸化組學(xué)定量分析。Liu 等[55]使用穩(wěn)定同位素二甲基標(biāo)記結(jié)合高分辨率質(zhì)譜法，在5-Fu耐藥細胞系Bel/5-Fu 中共確定了8272 種獨特的蛋白質(zhì)和22095 個具有高定位置信性的磷酸化位點，并確定了肝細胞癌中減弱化學(xué)耐藥性的潛在靶點。

3.4 等重標(biāo)記定量方法

等重標(biāo)記定量方法的原理是基于報告區(qū)與平衡區(qū)具有相同數(shù)量的總重同位素，當(dāng)報告離子斷開后即可通過比較樣品之間相對報告離子強度對樣品進行定量分析，包括同位素標(biāo)記相對和絕對定量分析（Isobaric Tags for relative and absolute quantitation， iTRAQ）[56]、串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽（Tandem mass tags， TMT）[57]、氘同位素標(biāo)記定量分析（Deuterium （2H） isobaric aminereactive tag， DiART）以及組合等壓質(zhì)量標(biāo)簽（Combinatorial isobaric mass tags， CMTs）等。

3.4.1 同位素標(biāo)記相對和絕對定量分析

同位素標(biāo)記相對和絕對定量分析（iTRAQ）的原理是利用多種同位素試劑標(biāo)記蛋白多肽N 末端或賴氨酸側(cè)鏈基團，經(jīng)高精度串聯(lián)質(zhì)譜分析實現(xiàn)蛋白質(zhì)組定量分析。目前， iTRAQ 試劑有4-plex 和8-plex，可分別標(biāo)記4 組或8 組樣品，包含與氨基結(jié)合的反應(yīng)基團、不同分子量的報告基團以及不同分子量的質(zhì)量平衡基團，當(dāng)不同的報告基團分別與對應(yīng)的平衡基團結(jié)合后會達到相同的質(zhì)量，但在MS/MS 碎裂后產(chǎn)生獨特的報告離子，以此對多肽進行定量分析[58]。iTRAQ 標(biāo)記無偏倚且掃描范圍廣，可用于絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸位點上的磷酸化定量分析[59]。為了鑒定參與調(diào)節(jié)MAT-LyLu 細胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵生物標(biāo)志物，Xu 等[60]分別用TTX-S VGSCs 的特異性抑制劑HNTX-Ⅲ和激活劑JZTX-Ⅰ處理細胞，然后進行了基于iTRAQ 的定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析，與對照組相比，在HNTX-Ⅲ和JZTX-Ⅰ處理組中分別鑒定出554 種和1779 種獨特的磷酸化蛋白，其中， 55 種和36 種磷酸化蛋白質(zhì)被鑒定為差異表達的蛋白質(zhì)。差異表達的磷酸化蛋白與前列腺腫瘤的遷移和侵襲顯著相關(guān)，因此有望成為前列腺癌癥精確藥物的潛在生物標(biāo)記物。

3.4.2 串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽

TMT 標(biāo)記具有通量高、準(zhǔn)確性高、對低豐度蛋白的鑒定效率高等優(yōu)點，可同時對多個樣品進行全蛋白質(zhì)組定量分析，最新的16-Plex TMT 標(biāo)記允許對多達16 個樣本進行蛋白質(zhì)組定量分析[61]?；赟PS-MS3-TMT（Synchronous precursor selection-MS3）的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析的主要流程如圖4 所示[25]。TMT 標(biāo)記定量磷酸化肽的方法已被廣泛應(yīng)用。Friedrich 等[62]使用TMT 標(biāo)記，在非小細胞肺癌、亞型腺癌和鱗狀細胞癌中定量分析8000 余種蛋白質(zhì)，并確定了超過1400 個磷酸位點，為肺癌相關(guān)癌基因、腫瘤抑制因子及信號通路的蛋白質(zhì)豐度和磷酸位點調(diào)節(jié)提供了相關(guān)定量信息。人參皂苷是一種重要的抗癌活性成分， Zou 等[63]利用TMT 標(biāo)記定量分析人參皂苷治療后乳腺癌MDA-MB-231 細胞中磷酸化蛋白質(zhì)組的變化，在皂苷處理后的MDA-MB-231 細胞中鑒定出13 個位點的磷酸化狀態(tài)發(fā)生變化，分析了人參皂苷的抗癌作用機制。TMT 標(biāo)記反應(yīng)通常在磷酸化肽富集之前，但TMT 標(biāo)記對肽標(biāo)記后會改變其化學(xué)性質(zhì)，從而導(dǎo)致TiO2 富集磷酸肽的選擇性發(fā)生變化， Ogata 等[64]設(shè)計了一種納米級固相TMT 標(biāo)記反應(yīng)器，在磷酸化肽富集后進行TMT 標(biāo)記，通過優(yōu)化固相TMT 標(biāo)記反應(yīng)器中的pH 值、反相吸附劑和離子成功標(biāo)記磷酸化肽，只需要少量TMT 試劑標(biāo)記磷酸肽即可完成測定。此研究有助于納米級TMT 標(biāo)記應(yīng)用于大規(guī)模磷酸蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

3.5 微量樣品中磷酸化蛋白質(zhì)的定量策略

磷酸化蛋白質(zhì)定量組學(xué)分析通常采用數(shù)據(jù)依賴采集模式（Data dependent acquisition， DDA）采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，在該模式下，需要有足夠高豐度的磷酸肽離子才能實現(xiàn)有效的MS1 和MS2 分析。由于生物樣本中磷酸化蛋白質(zhì)豐度低，并且在正離子模式下質(zhì)譜對磷酸化肽離子化效率較差，目前多需使用300～1000 μg 的提取蛋白才能實現(xiàn)可重復(fù)性的深度磷蛋白質(zhì)組鑒定[65]。然而，臨床樣品通常只能提供少于10 μg 的提取肽，在如此微量的樣品中實現(xiàn)磷酸化蛋白定量分析是一項重要且艱巨的任務(wù)。Budnik 等[66]利用等重標(biāo)記法的MS1 信號強度取決于所有通道混合后的肽段總含量且各樣品的MS2 定量離子信號互不干擾這一特性，開發(fā)了一種高通量SCoPE-MS（Single cell protEomics by mass spectrometry）方法，用于分析單細胞蛋白質(zhì)組。選擇TMT 標(biāo)簽的其中一個通道標(biāo)記200 個細胞樣品作為“Carrier”以提高MS1 信號強度，其余通道標(biāo)記待測單細胞樣品，所有通道混合后進行定量分析，在單細胞水平的蛋白質(zhì)組學(xué)分析實驗中，實現(xiàn)了對平均細胞直徑僅為11 μm 的Jurkat 和U-937 細胞的蛋白質(zhì)定量分析。上述的“Carrier”策略為微量樣本中磷酸化蛋白質(zhì)組的定量分析提供了新思路[67-69]。Yi 等[70]開發(fā)了一種BASIL（Boosting to amplify signal with isobaric labeling）等重標(biāo)記策略，選擇TMT 的一個通道標(biāo)記“Carrier”樣品，與其它通道混合后進行磷酸化肽富集和質(zhì)譜檢測，該設(shè)計顯著增強了磷酸化肽的可檢測性和可識別性，使可量化磷酸化位點的總數(shù)增加了4 倍以上。但是，在BASIL 策略中，研究樣品和“Carrier”樣品是在混合之后進行磷酸化肽富集和檢測，每次分析都需要進行磷酸化肽富集處理，因而每個通道至少需要10 μg 的研究樣品才能滿足磷酸化肽分析的需求。Kwom 等[71]對上述策略進行了改進，使用富集后的高濃度磷酸化肽取代蛋白質(zhì)組樣品作為“Phosphocarrier”樣品，該策略的原理示意圖如圖5 所示。來自“Phosphocarrier”樣品的高濃度磷酸化肽貢獻更強的MS1 信號強度（圖5B），研究樣品通道中的磷酸化肽無需進行富集處理且更易被選擇用于MS2 分析（圖5C），因而每個研究通道僅需低于1 μg 的樣品即可實現(xiàn)全面的磷酸化蛋白質(zhì)組分析。

酪氨酸磷酸化僅占總O-磷酸化蛋白質(zhì)的0.05%，因此微量樣品中酪氨酸的全面磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析更困難。Chua 等[72]開發(fā)了BOOST（Broad-spectrum optimization of selective triggering）策略，利用酪氨酸磷酸酶抑制劑（Pervanadate， PV）處理的細胞作為TMT 標(biāo)記的一個通道，選擇性地增加了含磷酸化酪氨酸肽段的信號相對豐度，使磷酸化酪氨酸的定量深度提高6.3 倍，并且從1 mg T 細胞受體激活的Jurkat T 細胞中定量分析了2300 多種特異性酪氨酸磷酸化肽。

前處理樣品轉(zhuǎn)移過程中產(chǎn)生的非特異性表面吸附導(dǎo)致的樣品損失也是微量樣品磷酸化蛋白質(zhì)定量分析面臨的重要問題。Tsai 等[73]開發(fā)了一種基于串聯(lián)Tip 的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)樣品制備方法，該方法利用C18 與IMAC 結(jié)合形成串聯(lián)C18-IMAC-C18，可快速、高效地富集磷酸化肽，并與SOP（Surfactant-assistedone-pot）[74]方法和iBASIL（Improved Boosting to amplify signal with isobaric labeling）[75]方法結(jié)合形成了一個簡化的工作流程（圖6），實現(xiàn)了高靈敏度、高通量的納克級磷酸化蛋白質(zhì)組定量分析，精確定量分析了100 個MCF10A 細胞中約600 條磷酸化肽和200 μm×200 μm×10 μm 的人類脾臟組織體素（相當(dāng)于約100 個細胞）中約700 條磷酸化肽，為納克級磷酸化蛋白質(zhì)組分析開辟了新途徑。

4 磷酸化位點的化學(xué)計量學(xué)

上述富集和定量方法幫助研究者鑒定到大量的磷酸化位點，并在一些研究中確定了磷酸化蛋白質(zhì)的相對和絕對豐度。然而，蛋白的功能除了與特定位點的化學(xué)修飾有關(guān)外，還與該位點的修飾程度有關(guān)[76]。磷酸化位點占有率也稱磷酸化位點化學(xué)計量，可通過測量給定位點的磷酸化形式相對于蛋白質(zhì)總量的比例實現(xiàn)（圖7）[76]。磷酸化位點的化學(xué)計量是磷酸化的重要屬性，也是確定磷酸化位點生物學(xué)相關(guān)性的重要指標(biāo)，對磷酸化依賴性的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)過程研究具有重要意義[77]。與重大疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)磷酸化位點的化學(xué)計量研究對于深入理解疾病的發(fā)生機制以及開發(fā)新的治療方法具有重要意義[78-79]。

4.1 絕對定量分析

由于蛋白質(zhì)組的復(fù)雜性，在蛋白質(zhì)組水平上確定特定位點的絕對磷酸化化學(xué)計量是一項具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。早期，磷酸化化學(xué)計量均采用低通量方法，如定量蛋白質(zhì)印跡法[80]。2003 年， Gerber 等[77]首次使用AQUA（Absolute quantification）法測量人體細胞周期依賴性的分離酶上Ser-1126 位點的磷酸化和非磷酸化形式的絕對量，從16 μg 樣品中定量人類分離酶蛋白Ser-1126 位點的化學(xué)計量為34%。該方法的原理是向待測樣品中加入已知量的穩(wěn)定同位素標(biāo)記磷酸化肽段和與其對應(yīng)的穩(wěn)定同位素標(biāo)記非磷酸化肽段，通過比較同位素標(biāo)記肽段與目標(biāo)肽段的信號強度計算目標(biāo)肽段的豐度。AQUA 被應(yīng)用于精準(zhǔn)量化不同樣本的磷酸化位點化學(xué)計量，也可用于新的磷酸化位點化學(xué)計量定量方法的評估。但是， AQUA 在量化磷酸化位點化學(xué)計量時會受到肽電離效率的影響，并且AQUA 定量肽合成的成本較高。

4.2 非標(biāo)記定量分析

采用同位素標(biāo)記肽段進行定量分析成本較高， Steen 等[81]開發(fā)了一種非標(biāo)記定量的方法，用于估計樣品系列中磷酸化化學(xué)計量，當(dāng)磷酸化肽及其對應(yīng)的非磷酸化肽兩種肽的信號強度變化具有相關(guān)性時，可通過監(jiān)測磷酸化肽及其對應(yīng)的非磷酸化肽的離子電流強度來測量磷酸化化學(xué)計量，基于此設(shè)計了相關(guān)計算方案：首先采用適當(dāng)?shù)臍w一化程序確定檢測效率，然后通過監(jiān)測磷酸化肽及其對應(yīng)的非磷酸化肽之間的信號強度比即可得到目標(biāo)磷酸化肽段的化學(xué)計量。該方法可用于定量分析多重磷酸化肽或蛋白酶切割效率受磷酸化位點影響的肽。該方法的局限是：定量分析的前提條件是目標(biāo)磷酸肽及其對應(yīng)的非磷酸化肽兩種肽的信號強度變化必須相關(guān)；蛋白質(zhì)的磷酸化比例必須達到一定程度（gt;10%），但不完全磷酸化。此外， Bekker-Jense 等[82]將多種實驗條件信息集成到一個化學(xué)計量模型中，通過使用多通路復(fù)用量化磷酸化肽、非磷酸化肽和相應(yīng)的蛋白質(zhì)信號強度，然后在Perseus 插件中實現(xiàn)線性建模和化學(xué)計量計算，最終使用戶能從Label-free 數(shù)據(jù)中計算磷酸化占用率。

4.3 磷酸化肽和非磷酸化肽的相對豐度分析

通過量化磷酸化肽和非磷酸化肽的相對豐度對磷酸化位點進行化學(xué)計量分析，通常是先量化樣品中的磷酸化肽、非磷酸化肽和相應(yīng)的蛋白質(zhì)強度，再結(jié)合比例關(guān)系進行數(shù)學(xué)計算，進而得到位點的磷酸化水平。Olsen 等[83]假設(shè)磷酸化肽段與其對應(yīng)的非磷酸化肽段比例達到1，從SILAC 輕標(biāo)和SILAC 重標(biāo)兩種狀態(tài)下計算磷酸化位點的絕對化學(xué)計量，具體計算公式如圖8 所示，其中， x 表示SILAC 標(biāo)記的輕、重磷酸化肽比例， y 表示SILAC 標(biāo)記的輕、重非磷酸化肽比例， z 表示SILAC 標(biāo)記的輕、重蛋白質(zhì)比例，通過x、y、z 的SILAC 標(biāo)記比率信息計算位點的磷酸化化學(xué)計量。采用該方法實現(xiàn)了磷酸化位點化學(xué)計量的大規(guī)模研究，并獲得了人類培養(yǎng)細胞系HeLa S3 細胞周期中蛋白質(zhì)和磷酸化位點動力學(xué)的系統(tǒng)視圖。此外， Hogrebe 等[84]開發(fā)了一種基于三維多元回歸模型（3DMM）的方法，使用量化方法中的磷酸化肽、非磷酸化肽和相應(yīng)的蛋白質(zhì)強度，結(jié)合肽的數(shù)量與肽的強度比例關(guān)系，在不同條件下對這3 種強度進行多元回歸擬合，計算磷酸化程度。

近些年，已有大量通過磷酸酶去除磷酸化再結(jié)合同位素標(biāo)記技術(shù)來測量蛋白質(zhì)的磷酸化位點的研究[85-86]。Wu 等[87]將蛋白質(zhì)裂解產(chǎn)物的兩個相同等分試樣分別進行虛擬處理以及磷酸酶處理，然后用穩(wěn)定同位素進行差異化學(xué)標(biāo)記?；旌虾?，將獲得的肽段序列與已知位點的數(shù)據(jù)庫進行對比，基于重疊的非磷酸化形式的比率計算化學(xué)計量，最終確定了對數(shù)中期的釀酒酵母的5033 個磷酸化位點的化學(xué)計量。Chen 等[88]設(shè)計了一種二甲基標(biāo)記結(jié)合磷酸酶去磷酸化的方法定量分析蛋白質(zhì)中特定位點磷酸化水平，測得牛奶中α-S1 酪蛋白Ser130 位點和α-S2 酪蛋白Ser158 位點的磷酸化程度分別為97.2%和97.3%，這是首次在肽段水平上報道α-酪蛋白位點的特異性磷酸化程度。隨后，研究者采用該方法測得未經(jīng)過氧化叔丁醇溶液（Tert-butyl hydroperoxide， t-BHP）處理的Hsp27 上Ser82 的磷酸化程度為10.76%，經(jīng)t-BHP 處理的Hsp27 上Ser82 的磷酸化程度為37.46%，表明該方法在分析蛋白質(zhì)磷酸化動態(tài)變化方面具有可行性。

上述磷酸酶處理和同位素標(biāo)記的方法具有工作流程簡單、數(shù)據(jù)處理易于實現(xiàn)等優(yōu)點，但僅適用于定量蛋白樣品上有限數(shù)量位點的化學(xué)計量。在通過量化修飾肽和未修飾肽的相對豐度來進行化學(xué)計量測定的方法中，確保觀察到的肽豐度變化具有統(tǒng)計學(xué)意義至關(guān)重要。為了使肽豐度變化更具有統(tǒng)計學(xué)意義， Lim 等[89]設(shè)計了貝葉斯模型（The Bayesian models），將化學(xué)計量建模為β 分布，可解決基于磷酸酶的磷酸化化學(xué)計量實驗中的負化學(xué)計量的問題。

4.4 同位素標(biāo)記非磷酸化肽段

使用磷酸化標(biāo)準(zhǔn)肽段定量磷酸化位點的化學(xué)計量會面臨一些問題，其中合成定量用的磷酸化肽段中含有其對應(yīng)的非磷酸化肽段，同時，磷酸化肽的低靈敏度也給質(zhì)譜監(jiān)測帶來挑戰(zhàn)。為規(guī)避上述問題，可通過磷酸酶處理或表達出無磷酸化修飾的QconCAT 蛋白，再通過歸一化計算提高定量分析的準(zhǔn)確性，最后只需利用同位素標(biāo)記的非磷酸化肽段即可對目標(biāo)肽段進行化學(xué)計量定量分析[90]。除此之外，Dominik 等[91]開發(fā)了一種基于磷酸酶處理和同位素標(biāo)記用于測定復(fù)雜生物樣品中的磷酸化化學(xué)計量的定量方法（Phosphatase-based phosphopeptide quantitation， PPQ）。該方法在酶切后加入同位素標(biāo)記的非磷酸化肽段，然后將樣品分為未處理和磷酸酶處理兩部分，比較兩部分樣品的峰面積比即可確定磷酸化化學(xué)計量，因此，只需比較非磷酸化肽段的相對或絕對豐度即可確定單個肽的磷酸化化學(xué)計量。

4.5 磷酸化化學(xué)計量分析在激酶研究中的應(yīng)用

激酶能夠轉(zhuǎn)移磷酸基團到特定的底物分子上，從而引發(fā)磷酸化修飾。磷酸化化學(xué)計量對于揭示激酶的調(diào)控機制和信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)具有重要意義。激酶介導(dǎo)的磷酸化化學(xué)計量在細胞調(diào)控和疾病發(fā)展過程中具有重要作用。不同激酶對磷酸化位點的化學(xué)計量具有特異性，這種特異性可以調(diào)節(jié)底物的功能和細胞過程。此外，異常的磷酸化化學(xué)計量與許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和心血管疾病等。為了探究激酶對磷酸化的影響， Karayel 等[92]針對帕金森病患者中性粒細胞中Rab10-Thr73磷酸化水平進行了研究，發(fā)現(xiàn)帕金森病患者的富亮氨酸重復(fù)激酶2（Leucine-rich repeat kinase 2， LRRK2）突變會增加Rab10-Thr73 磷酸化水平。Tsai 等[93]采用兩次富集結(jié)合磷酸酶處理的方法探究了不同激酶作用位點的磷酸化化學(xué)計量，在使用CK2、MAPK 和EGFR 作為肺癌癥細胞中的基序靶向激酶的驗證實驗中，測量了1000 余個磷酸化位點，包括642 個CK2 靶向位點、940 個MAPK 靶向位點和366 個EGFR靶向位點，然后對不同激酶作用的磷酸化位點進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)CK2 有30%的磷酸化位點化學(xué)計量超過70%，而MAPK 和EGFR 只有少于15%的磷酸化位點化學(xué)計量大于70%，為激酶與磷酸化化學(xué)計量研究提供了新的研究思路。

5 總結(jié)和展望

磷酸化蛋白質(zhì)參與多種生理和病理過程，具有重要的研究意義。不同類型的磷酸化肽段需采用不同的富集方法，質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展也為磷酸化蛋白質(zhì)研究提供了可靠的技術(shù)支撐。在此基礎(chǔ)上的磷酸化位點化學(xué)計量學(xué)研究不僅對探究磷酸化位點和占有率具有生物學(xué)意義，也可用于分析磷酸化位點上游激酶的靶向位點和作用機制，這些成果可應(yīng)用于重大疾病發(fā)病機制的探索和活性激酶抑制劑的臨床研究，評估激酶抑制劑的靶向結(jié)合、劑量和療效等，在生物醫(yī)學(xué)上具有較大的應(yīng)用潛力。此外，對微量樣品進行全面的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析仍然是一項艱巨的任務(wù)，也是目前的研究熱點，研究者采用不同的解決方案提高微量樣品檢測效率。磷酸化蛋白質(zhì)的定量與化學(xué)計量分析方法在深入理解細胞信號傳導(dǎo)、生物學(xué)過程和疾病機制方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，未來的研究方向應(yīng)主要集中在提高分析方法的精確度、靈敏度和通量，開發(fā)治療重大疾病的靶向磷酸化位點的藥物以及加速其在生物醫(yī)學(xué)和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

References

[1] DUAN G Y， WALTHER D. PLoS Comput. Biol. ， 2015， 11（2）： 23.

[2] CZUBA L C， HILLGREN K M， SWAAN P W. Pharmacol. Ther. ， 2018， 192： 88-99.

[3] SEYREK K， LAVRIK I N. Apoptosis， 2019， 24（5-6）： 385-394.

[4] GRIMSRUD P A， SWANEY D L， WENGER C D， BEAUCHENE N A， COON J J. ACS Chem. Biol. ， 2010， 5（1）： 105-119.

[5] THORNER J， HUNTER T， CANTLEY L C， SEVER R. Cold Spring Harbor. Perspect. Biol. ， 2014， 6（12）： a022913.

[6] MANN M， ONG S E， GR?NBORG M， STEEN H， JENSEN O N， PANDEY A. Trends Biotechnol. ， 2002， 20（6）： 261-268.

[7] CHAN C Y， GRITSENKO M A， SMITH R D， QIAN W J. Expert Rev. Proteomics， 2016， 13： 421-433.

[8] LOW T Y， MOHTAR M A， LEE P Y， OMAR N， ZHOU H， YE M. Mass Spectrom. Rev. ， 2021， 40（4）： 309-333.

[9] FICARRO S B， MCCLELAND M L， STUKENBERG P T， BURKE D J， ROSS M M， SHABANOWITZ J， HUNT D F，WHITE F M. Nat. Biotechnol. ， 2002， 20（3）： 301-305.

[10] LARSEN M R， THINGHOLM T E， JENSEN O N， ROEPSTORFF P， J?RGENSEN T J. Mol. Cell. Proteomics， 2005， 4（7）：873-886.

[11] RILEY N M， COON J J. Anal. Chem. ， 2016， 88（1）： 74-94.

[12] KANSHIN E， MICHNICK S W， THIBAULT P. J. Proteome Res. ， 2013， 12（6）： 2905-2913.

[13] JENSEN S S， LARSEN M R. Rapid Commun. Mass Spectrom. ， 2007， 21（22）： 3635-3645.

[14] THINGHOLM T E， JENSEN O N， ROBINSON P J， LARSEN M R. Mol. Cell. Proteomics， 2008， 7（4）： 661-671.

[15] QUAN Q， FENG J， LUI L T， SHI T， CHU I K. J. Chromatogr. A， 2017， 1498： 196-206.

[16] HUANG H， LI L， WU C， SCHIBLI D， COLWILL K， MA S， LI C， ROY P， HO K， SONGYANG Z， PAWSON T， GAO Y， LI SS. Mol. Cell. Proteomics， 2008， 7（4）： 768-784.

[17] BIAN Y， LI L， DONG M， LIU X， KANEKO T， CHENG K， LIU H， VOSS C， CAO X， WANG Y， LITCHFIELD D， YE M， LIS S C， ZOU H. Nat. Chem. Biol. ， 2016， 12（11）： 959-966.

[18] MAKWANA M V， MUIMO R， JACKSON R F. Lab. Invest. ， 2018， 98（3）： 291-303.

[19] FUHRMANN J， SUBRAMANIAN V， THOMPSON P R. Angew. Chem. Int. Ed. ， 2015， 54（49）： 14715-14718.

[20] POTEL C M， LIN M H， HECK A J R， LEMEER S. Nat. Methods， 2018， 15（3）： 187-190.

[21] HU Y， WENG Y， JIANG B， LI X， ZHANG X， ZHAO B， WU Q， LIANG Z， ZHANG L， ZHANG Y. Sci. China： Chem. ，2019， 62（6）： 708-712.

[22] HU Y， JIANG B， WENG Y， SUI Z， ZHAO B， CHEN Y， LIU L， WU Q， LIANG Z， ZHANG L， ZHANG Y. Nat. Commun. ，2020， 11（1）： 6226.

[23] SHI Wen-Hao， TONG Meng-Sha， LI Kai， WANG Yu-Shen， DING Chen. Prog. Biochem. Biophys. ， 2018， 45（12）： 1250-1258.

石文昊， 童夢莎， 李愷， 王鈺珅， 丁琛. 生物化學(xué)與生物物理進展， 2018， 45（12）： 1250-1258.

[24] WELLS J M， MCLUCKEY S A. Methods Enzymol. ， 2005， 402： 148-185.

[25] PAULO J A， SCHWEPPE D K. Proteomics， 2021， 21（9）： e2000140.

[26] ZHANG Y， FICARRO S B， LI S， MARTO J A. J. Am. Soc. Mass Spectrom. ， 2009， 20（8）： 1425-1434.

[27] CUI L， REID G E. Proteomics， 2013， 13（6）： 964-973.

[28] ZUBAREV R A， KELLEHER N L， MCLAFFERTY F W. J. Am. Chem. Soc. ， 1998， 120， 3265-3266.

[29] KRUGER N A， ZUBAREV R A， CARPENTER B K， KELLEHER N L， HORN D M， MCLAFFERTY F W. Int. J. Mass Spectrom. ， 1999， 182-183： 1-5.

[30] SYKA J E P， COON J J， SCHROEDER M J， SHABANOWITZ J， HUNT D J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ， 2004， 101：9528-9533.

[31] POTEL C M， LEMEER S， HECK A J R. Anal. Chem. ， 2019， 91（1）： 126-141.

[32] FRESE C K， ALTELAAR A M， TOORN H V D， NOLTING D， GRIEP-RAMING J， HECK A J， MOHAMMED S. Anal.Chem. ， 2012， 84（22）： 9668-9673.

[33] FRESE C K， ZHOU H， TAUS T， ALTELAAR A M， MECHTLER K， HECK A J， MOHAMMED S. J. Proteome Res. ， 2013，12（3）： 1520-1525.

[34] PENKERT M， HAUSER A， HARMEL R， FIEDLER D， HACKENBERGER C P R， KRAUSE E. J. Am. Soc. Mass Spectrom. ， 2019， 30（9）： 1578-1585.

[35] BRODBELT J S. Chem. Soc. Rev. ， 2014， 43（8）： 2757-2783.

[36] FORT K L， DYACHENKO A， POTEL C M， CORRADINI E， MARINO F， BARENDREGT A， MAKAROV A A，SCHELTEMA R A， HECK A J R. Anal. Chem. ， 2016， 88（4）： 2303-2310.

[37] ROBINSON M R， TALIAFERRO J M， DALBY K N， BRODBELT J S. J. Proteome Res. ， 2016， 15（8）： 2739-2748.

[38] SUI Shao-Hui， WANG Jing-Lan， CAI Yun， QIAN Xiao-Hong. Prog. Biochem. Biophys. ， 2007， 34（3）： 240-245.

隋少卉， 王京蘭， 蔡耘， 錢小紅. 生物化學(xué)與生物物理進展， 2007， 34（3）： 240-245.

[39] MEGGER D A， BRACHT T， MEYER H E， SITEK B. Biochim. Biophys. Acta， 2013， 1834（8）： 1581-1590.

[40] ANKNEY J A， MUNEER A， CHEN X. Annu. Rev. Anal. Chem. ， 2018， 11（1）： 49-77.

[41] LIU J， LI J， SUN Z， DUAN Y， WANG F， WEI G， YANG J H. J. Transl. Med. ， 2021， 19（1）： 339.

[42] DE OLIVEIRA T M， DE LACERDA J T J G， LEITE G G F， DIAS M， MENDES M A， KASSAB P， E SILVA C G S E，JULIANO M A， FORONES N M. Clin. Biochem. ， 2020， 79： 61-69.

[43] MANN M. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2006， 7（12）： 952-958.

[44] HOEDT E， ZHANG G， NEUBERT T A. Adv. Exp. Med. Biol. ， 2019， 1140： 531-539.

[45] CHEN X， WEI S， JI Y， GUO X， YANG F. Proteomics， 2015， 15（18）： 3175-3192.

[46] SSTEPATH M， ZULCH B， MAGHNOUJ A， SCHORK K， TUREWICZ M， EISENACHER M， HAHN S， SITEK B， BRACHT T. J. Proteome Res. ， 2020， 19（2）： 926-937.

[47] ERBER L N， LUO A， GONG Y， BEESON M， TU M， TRAN P， CHEN Y. Nutrients， 2021， 13（1）： 179.

[48] HAMMAREN H M， GEISSEN E M， POTEL C M， BECK M， SAVITSKI M M. Nat. Commun. ， 2022， 13（1）： 7431.

[49] LLUCENA A C R， AMORIM J C， DE PAULA LIMA C V， BATISTA M， KRIEGER M A， DE GODOY L M F， MARCHINI F K. Cell Stress Chaperones， 2019， 24（5）： 927-936.

[50] BELLER N C， HUMMON A B. Mol. Omics， 2022， 18（7）： 579-590.

[51] WU C， BA Q， LU D， LI W， SALOVSKA B， HOU P， MUELLER T， ROSENBERGER G， GAO E， DI Y， ZHOU H，F(xiàn)ORNASIERO E F， LIU Y. Dev. Cell， 2021， 56（1）： 111-124.e6.

[52] CHEN Y Q， SHEN H， YANG R J， WAN J B. Anal. Chim. Acta， 2021， 1179： 338839.

[53] BOERSEMA P J， AYE T T， VAN VEEN T A B， HECK A J R， MOHAMMED S. Proteomics， 2008， 8（22）： 4624-4632.

[54] HSU J L， HUANG S Y， CHOW N H， CHEN S H. Anal. Chem. ， 2003， 75（24）： 6843-6852.

[55] LIU Z， WANG Y， YAO Y， FANG Z， MIAO Q R， YE M. J. Proteomics， 2019， 208： 103501.

[56] MERTINS P， UDESHI N D， CLAUSER K R， MANI D R， PATEL J， ONG S E， JAFFE J D， CARR S A. Mol. Cell.Proteomics， 2012， 11（6）： M111. 014423.

[57] MCALISTER G C， HUTTLIN E L， HAAS W， TING L， JEDRYCHOWSKI M P， ROGERS J C， KUHN K， PIKE I， GROTHE R A， BLETHROW J D， GYGI S P. Anal. Chem. ， 2012， 84（17）： 7469-7478.

[58] TEDFORD N C， WHITE F M， RADDING J A. Briefings Funct. Genomics Proteomics， 2008， 7（5）： 383-394.

[59] XIAO W， YANG Z， YAN X， FENG L， LONG L， TU T， DENG N， CHEN W， XIAO B， LONG H， ZENG Y. Front. Neurol. ，2020， 11： 626013.

[60] XU R， CHEN Y， WANG Z， ZHANG C， DONG X， YAN Y， WANG Y， ZENG Y， CHEN P. Toxins， 2021， 13（8）： 554.

[61] NOTARAS M， LODHI A， BARRIO-ALONSO E， FOORD C， RODRICK T， JONES D， FANG H， GREENING D， COLAK D.Mol. Psychiatry， 2021， 26（12）： 7760-7783.

[62] FRIEDRICH C， SCHALLENBERG S， KIRCHNER M， ZIEHM M， NIQUET S， HAJI M， BEIER C， NEUDECKER J， KLAUSCHEN F， MERTINS P. Nat. Commun. ， 2021， 12（1）： 3576.

[63] ZOU M， WANG J， GAO J， HAN H， FANG Y. Oncol. Lett. ， 2018， 15（3）： 2889-2898.

[64] OGATA K， TSAI C F， ISHIHAMA Y. J. Proteome Res. ， 2021， 20（8）： 4193-4202.

[65] NEEDHAM E J， HINGST J R， PARKER B L， MORRISON K R， YANG G， ONSLEV J， KRISTENSEN J M， H?JLUND K，LING N X Y， OAKHILL J S， RICHTER E A， KIENS B， PETERSEN J， PEHM?LLER C， JAMES D E， WOJTASZEWSKI JF P， HUMPHREY S J. Nat. Biotechnol. ， 2022， 40（4）： 576-584.

[66] BUDNIK B， LEVY E， HARMANGE G， SLAVOV N. Genome Biol. ， 2018， 19（1）： 161.

[67] TSAI C F， OGATA K， SUGIYAMA N， ISHIHAMA Y. Cell Rep. Methods， 2022， 2（1）： 100138.

[68] CHUA X Y， SALOMON A. J. Proteome Res. ， 2021， 20（6）： 3330-3344.

[69] STOPFER L E， CONAGE-POUGH J E， WHITE F M. Mol. Cell. Proteomics， 2021， 20： 100104.

[70] YI L， TSAI C F， DIRICE E， SWENSEN A C， CHEN J， SHI T， GRITSENKO M A， CHU R K， PIEHOWSKI P D， SMITH R D， RODLAND K D， ATKINSON M A， MATHEWS C E， KULKARNI R N， LIU T， QIAN W J. Anal. Chem. ， 2019， 91（9）：5794-5801.

[71] KWON Y， LEE S， PARK N， JU S， SHIN S， YOO S， LEE H， LEE C. Anal. Chem. ， 2022， 94（10）： 4192-4200.

[72] CHUA X Y， MENSAH T， ABALLO T， MACKINTOSH S G， EDMONDSON R D， SALOMON A R. Mol. Cell. Proteomics，2020， 19（4）： 730-743.

[73] TSAI C F， WANG Y T， HSU C C， KITATA R B， CHU R K， VELICKOVIC M， ZHAO R， WILLIAMS S M， CHRISLER W B，JORGENSEN M L， MOORE R J， ZHU Y， RODLAND K D， SMITH R D， WASSERFALL C H， SHI T， LIU T. Commun.Biol. ， 2023， 6（1）： 70.

[74] TSAI C F， ZHANG P， SCHOLTEN D， MARTIN K， WANG Y T， ZHAO R， CHRISLER W B， PATEL D B， DOU M， JIA Y，REDUZZI C， LIU X， MOORE R J， BURNUM-JOHNSON K E， LIN M H， HSU C C， JACOBS J M， KAGAN J，SRIVASTAVA S， RODLAND K D， STEVEN WILEY H， QIAN W J， SMITH R D， ZHU Y， CRISTOFANILLI M， LIU T，LIU H， SHI T. Commun. Biol. ， 2021， 4（1）： 265.

[75] TSAI C F， ZHAO R， WILLIAMS S M， MOORE R J， SCHULTZ K， CHRISLER W B， PASA-TOLIC L， RODLAND K D，SMITH R D， SHI T， ZHU Y， LIU T. Mol. Cell. Proteomics， 2020， 19（5）： 828-838.

[76] PRUS G， HOEGL A， WEINERT B T， CHOUDHARY C. Trends Biochem. Sci. ， 2019， 44（11）： 943-960.

[77] GERBER S A， RUSH J， STEMMAN O， KIRSCHNER M W， GYGI S P. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ， 2003， 100（12）：6940-6945.

[78] ALSUFAYAN T A， MYERS E J， QUADE B N， BRADY C T， MARSHALL A， HAQUE N， DUFFEY M E， PARKER M D.Int. J. Mol. Sci. ， 2021， 22（23）： 12817.

[79] FAN Y， NIRUJOGI R S， GARRIDO A， RUIZ-MARTINEZ J， BERGARECHE-YARZA A， MONDRAGON-REZOLA E，VINAGRE-ARAGON A， CROITORU I， GOROSTIDI PAGOLA A， PATERNAIN MARKINEZ L， ALCALAY R，HICKMAN R A， DURING J， GOMES S， PRATUSEVICIUTE N， PADMANABHAN S， VALLDEORIOLA F， PEREZ SISQUES L， MALAGELADA C， XIMELIS T， MOLINA PORCEL L， MARTI M J， TOLOSA E， ALESSI D R， SAMMLER E M. Acta Neuropathol. ， 2021， 142（3）： 475-494.

[80] COLYER J. Ann. N. Y. Acad. Sci. ， 1998， 853： 79-91.

[81] STEEN H， JEBANATHIRAJAH J A， SPRINGER M， KIRSCHNER M W. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ， 2005， 102（11）：3948-3953.

[82] BEKKER-JENSEN D B， BERNHARDT O M， HOGREBE A. Nat. Commun. ， 2020， 11（1）： 787.

[83] OLSEN J V， VERMEULEN M， SANTAMARIA A， KUMAR C， MILLER M L， JENSEN L J， GNAD F， COX J， JENSEN T S，NIGG E A， BRUNAK S， MANN M. Sci. Signal. ， 2010， 3（104）： ra3.

[84] HOGREBE A， VON STECHOW L， BEKKER-JENSEN D B， WEINERT B T， KELSTRUP C D， OLSEN J V. Nat. Commun. ，2018， 9（1）： 1045.

[85] HEGEMAN A D， HARMS A C， SUSSMAN M R， BUNNER A E， HARPER J F. J. Am. Soc. Mass Spectrom. ， 2004， 15（5）：647-653.

[86] PFLIEGER D， JUNGER M A， MüLLER M， RINNER O， LEE H， GEHRIG P M， GSTAIGER M， AEBERSOLD R. Mol.Cell. Proteomics， 2008， 7（2）： 326-346.

[87] WU R， HAAS W， DEPHOURE N， HUTTLIN E L， ZHAI B， SOWA M E， GYGI S P. Nat. Methods， 2011， 8（8）： 677-683.

[88] CHEN S H， LIN Y C， SHIH M K， WANG L F， LIU S S， HSU J L. Molecules， 2020， 25（22）： 5316.

[89] LIM M Y， O’BRIEN J， PAULO J A， GUGI S P. J. Proteome Res. ， 2017， 16（11）： 4217-4226.

[90] JOHNSON H， EYERS C E， EYERS P A， BEYNON R J， GASKELL S J. J. Am. Soc. Mass Spectrom. ， 2009， 20（12）： 2211-2220.

[91] DOMANSKI D， MURPHY L C， BORCHERS C H. Anal. Chem. ， 2010， 82（13）： 5610-5620.

[92] KARAYEL O， TONELLI F， VIRREIRA WINTER S， GEYER P E， FAN Y， SAMMLER E M， ALESSI D R， STEGER M，MANN M. Mol. Cell. Proteomics， 2020， 19（9）： 1546-1560.

[93] TSAI C F， KU W C， CHEN Y J， ISHIHAMA Y. Methods Mol. Biol. ， 2017， 1636： 313-325.