摘要 建立了核磁共振氫譜(1H NMR)法測(cè)定肺炎球菌莢膜多糖中C 多糖雜質(zhì)(C-polysaccharide, C-Ps)含量的方法。通過二維1H-15N 異核多鍵相關(guān)(HMBC)譜確定δH 3.24 為C-Ps 的特征峰。以3 種血清型肺炎球菌莢膜多糖6A、6B 和10A 為樣品、二甲基亞砜為內(nèi)標(biāo)物,建立了C-Ps 絕對(duì)定量分析方法,并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果表明, C-Ps 濃度在2.5~198 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2gt;0.999),檢測(cè)方法的定量限為2.5 μg/mL;加標(biāo)回收率在102%~109%之間;重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于3%, 5 d 內(nèi)穩(wěn)定性RSD 小于1%。本分析方法操作簡單,重復(fù)性和普適性良好,可作為肺炎球菌莢膜多糖研發(fā)和生產(chǎn)中C-Ps 雜質(zhì)的檢測(cè)方法,為質(zhì)檢控制提供了新方法和新思路。
關(guān)鍵詞 定量核磁共振氫譜;肺炎球菌莢膜多糖;C多糖雜質(zhì);磷酸膽堿;質(zhì)量控制
肺炎球菌是引起全球不同年齡人群,尤其是幼兒和老年人肺炎、中耳炎、支氣管炎、腦膜炎和敗血癥等嚴(yán)重疾病的重要病原菌,其中,侵襲性肺炎球菌疾病具有很高的致死率[1-2]。肺炎球菌莢膜多糖是肺炎球菌細(xì)胞壁外莢膜的主要組成成分,具有免疫原性,可在人體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體,阻止肺炎球菌的感染。目前,接種以肺炎球菌莢膜多糖為主要抗原成分的疫苗是預(yù)防肺炎球菌性疾病的有效措施[3-4]。根據(jù)莢膜多糖組成結(jié)構(gòu)的不同,已鑒別出96 種不同血清型肺炎球菌。針對(duì)成人使用的23 價(jià)肺炎球菌莢膜多糖疫苗由常見的致病率高的23 種血清型肺炎球菌的莢膜多糖組成。
目前,肺炎球菌莢膜多糖主要通過不同肺炎球菌菌株進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)純化制備。肺炎球菌的C 多糖(C-polysaccharide, C-Ps)是所有肺炎球菌共有的細(xì)胞壁組成成分,經(jīng)由核糖醇磷酸二酯鍵與莢膜多糖及細(xì)胞壁肽聚糖相連。C-Ps 由重復(fù)的五糖單元組成,其分子結(jié)構(gòu)和大小與肺炎球菌莢膜多糖類似。因此,在肺炎球菌莢膜多糖的生產(chǎn)純化過程中很難將C-Ps 完全去除[5],甚至可能會(huì)含有大量的C-Ps。C-Ps 具有高度的免疫原性,但是C-Ps 抗體并不具有保護(hù)性[6]。當(dāng)使用蒽酮硫酸這類顯色方法對(duì)肺炎球菌莢膜多糖進(jìn)行含量測(cè)定時(shí),并不能區(qū)分肺炎球菌莢膜多糖與C-Ps 的顯色差別,給準(zhǔn)確評(píng)價(jià)有效抗原含量帶來困難。C-Ps 在肺炎球菌莢膜多糖疫苗生產(chǎn)中被視為雜質(zhì)項(xiàng),世界衛(wèi)生組織(WHO)目前也將C-Ps 列為肺炎球菌莢膜多糖疫苗的雜質(zhì)[7]。因此, C-Ps 雜質(zhì)的定性和定量檢測(cè)在肺炎球菌莢膜多糖疫苗研發(fā)和生產(chǎn)過程中具有重要意義。
C-Ps 是由β-D-葡萄糖(A)、2-氮乙酰-4-氨基-2,4,6-三脫氧-α-D-半乳糖(B)、2-氮乙酰-2-脫氧-α-D-半乳糖(C)、2-氮乙酰-2-脫氧-β-D-半乳糖(D)和磷酸核糖醇(E)五糖重復(fù)單元組成,重復(fù)單元間由磷酸二酯鍵連接。C-Ps 區(qū)別于肺炎球菌莢膜多糖最主要的特征是在重復(fù)單元的C、D 單糖殘基6 位上含有磷酸膽堿基團(tuán)(Phosphocholine, P-Cho)。磷酸膽堿基團(tuán)主要以兩種取代方式存在[8],一種是僅在C 單糖殘基上的單取代,另一種是在C、D 單糖殘基上的雙取代(見圖1)。
目前,關(guān)于C-Ps 定量檢測(cè)方法的文獻(xiàn)報(bào)道很少,在實(shí)際的研發(fā)和生產(chǎn)過程中,多采用離子色譜法和酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)法。其中, HPAEC-PAD 離子色譜法利用C-Ps 中存在的核糖醇片段(E),采用酸對(duì)C-Ps 進(jìn)行多次水解,然后檢測(cè)水解產(chǎn)物中核糖醇的含量,以此間接計(jì)算C-Ps 的含量。該方法前處理復(fù)雜,而且6A、6B 和10A 這3 種血清型莢膜多糖結(jié)構(gòu)中本身也含有核糖醇片段,因此無法準(zhǔn)確檢測(cè)C-Ps含量[5,9]。此外,還有研究者采用C-Ps 單克隆抗體,利用速率比濁法檢測(cè)C-Ps 含量[10];或者采用ELISA法,利用抗體與抗原的特異性結(jié)合檢測(cè)C-Ps 含量。這兩種生物學(xué)方法都存在檢測(cè)時(shí)間長、成本高、專一性和重復(fù)性差等問題。