摘要 建立了核磁共振氫譜（1H NMR）法測(cè)定肺炎球菌莢膜多糖中C 多糖雜質(zhì)（C-polysaccharide， C-Ps）含量的方法。通過二維1H-15N 異核多鍵相關(guān)（HMBC）譜確定δH 3.24 為C-Ps 的特征峰。以3 種血清型肺炎球菌莢膜多糖6A、6B 和10A 為樣品、二甲基亞砜為內(nèi)標(biāo)物，建立了C-Ps 絕對(duì)定量分析方法，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果表明， C-Ps 濃度在2.5～198 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2gt;0.999），檢測(cè)方法的定量限為2.5 μg/mL；加標(biāo)回收率在102%～109%之間；重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于3%， 5 d 內(nèi)穩(wěn)定性RSD 小于1%。本分析方法操作簡單，重復(fù)性和普適性良好，可作為肺炎球菌莢膜多糖研發(fā)和生產(chǎn)中C-Ps 雜質(zhì)的檢測(cè)方法，為質(zhì)檢控制提供了新方法和新思路。

關(guān)鍵詞 定量核磁共振氫譜；肺炎球菌莢膜多糖；C多糖雜質(zhì)；磷酸膽堿；質(zhì)量控制

肺炎球菌是引起全球不同年齡人群，尤其是幼兒和老年人肺炎、中耳炎、支氣管炎、腦膜炎和敗血癥等嚴(yán)重疾病的重要病原菌，其中，侵襲性肺炎球菌疾病具有很高的致死率[1-2]。肺炎球菌莢膜多糖是肺炎球菌細(xì)胞壁外莢膜的主要組成成分，具有免疫原性，可在人體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體，阻止肺炎球菌的感染。目前，接種以肺炎球菌莢膜多糖為主要抗原成分的疫苗是預(yù)防肺炎球菌性疾病的有效措施[3-4]。根據(jù)莢膜多糖組成結(jié)構(gòu)的不同，已鑒別出96 種不同血清型肺炎球菌。針對(duì)成人使用的23 價(jià)肺炎球菌莢膜多糖疫苗由常見的致病率高的23 種血清型肺炎球菌的莢膜多糖組成。

目前，肺炎球菌莢膜多糖主要通過不同肺炎球菌菌株進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)純化制備。肺炎球菌的C 多糖（C-polysaccharide， C-Ps）是所有肺炎球菌共有的細(xì)胞壁組成成分，經(jīng)由核糖醇磷酸二酯鍵與莢膜多糖及細(xì)胞壁肽聚糖相連。C-Ps 由重復(fù)的五糖單元組成，其分子結(jié)構(gòu)和大小與肺炎球菌莢膜多糖類似。因此，在肺炎球菌莢膜多糖的生產(chǎn)純化過程中很難將C-Ps 完全去除[5]，甚至可能會(huì)含有大量的C-Ps。C-Ps 具有高度的免疫原性，但是C-Ps 抗體并不具有保護(hù)性[6]。當(dāng)使用蒽酮硫酸這類顯色方法對(duì)肺炎球菌莢膜多糖進(jìn)行含量測(cè)定時(shí)，并不能區(qū)分肺炎球菌莢膜多糖與C-Ps 的顯色差別，給準(zhǔn)確評(píng)價(jià)有效抗原含量帶來困難。C-Ps 在肺炎球菌莢膜多糖疫苗生產(chǎn)中被視為雜質(zhì)項(xiàng)，世界衛(wèi)生組織（WHO）目前也將C-Ps 列為肺炎球菌莢膜多糖疫苗的雜質(zhì)[7]。因此， C-Ps 雜質(zhì)的定性和定量檢測(cè)在肺炎球菌莢膜多糖疫苗研發(fā)和生產(chǎn)過程中具有重要意義。

C-Ps 是由β-D-葡萄糖（A）、2-氮乙酰-4-氨基-2，4，6-三脫氧-α-D-半乳糖（B）、2-氮乙酰-2-脫氧-α-D-半乳糖（C）、2-氮乙酰-2-脫氧-β-D-半乳糖（D）和磷酸核糖醇（E）五糖重復(fù)單元組成，重復(fù)單元間由磷酸二酯鍵連接。C-Ps 區(qū)別于肺炎球菌莢膜多糖最主要的特征是在重復(fù)單元的C、D 單糖殘基6 位上含有磷酸膽堿基團(tuán)（Phosphocholine， P-Cho）。磷酸膽堿基團(tuán)主要以兩種取代方式存在[8]，一種是僅在C 單糖殘基上的單取代，另一種是在C、D 單糖殘基上的雙取代（見圖1）。

目前，關(guān)于C-Ps 定量檢測(cè)方法的文獻(xiàn)報(bào)道很少，在實(shí)際的研發(fā)和生產(chǎn)過程中，多采用離子色譜法和酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）法。其中， HPAEC-PAD 離子色譜法利用C-Ps 中存在的核糖醇片段（E），采用酸對(duì)C-Ps 進(jìn)行多次水解，然后檢測(cè)水解產(chǎn)物中核糖醇的含量，以此間接計(jì)算C-Ps 的含量。該方法前處理復(fù)雜，而且6A、6B 和10A 這3 種血清型莢膜多糖結(jié)構(gòu)中本身也含有核糖醇片段，因此無法準(zhǔn)確檢測(cè)C-Ps含量[5，9]。此外，還有研究者采用C-Ps 單克隆抗體，利用速率比濁法檢測(cè)C-Ps 含量[10]；或者采用ELISA法，利用抗體與抗原的特異性結(jié)合檢測(cè)C-Ps 含量。這兩種生物學(xué)方法都存在檢測(cè)時(shí)間長、成本高、專一性和重復(fù)性差等問題。