［摘 要］ 目的：探討長期使用氯己定對糞腸球菌（E. faecalis）耐藥性的影響，并闡明其作用機(jī)制。方法：將E. faecalis標(biāo)準(zhǔn)菌株反復(fù)暴露于氯己定中傳代10代，記錄每一次傳代時的最低抑菌濃度（MIC）值。收集第10 代且MIC 值增加的細(xì)菌，即為E. faecalis 氯己定耐藥菌株（E. faecalis-Cs）。繪制2 種菌株生長曲線，透射電子顯微鏡觀察2 種菌株形態(tài)表現(xiàn)，結(jié)晶紫染色法檢測2 種菌株細(xì)菌生物膜形成量，微生物黏著碳?xì)浠衔铮∕ATH） 法檢測2 種菌株細(xì)菌疏水率，實(shí)時熒光定量PCR （RT-qPCR） 法檢測2種菌株細(xì)菌生物膜中S-核糖基高半胱氨酸裂解酶 （LuxS） mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：隨著傳代次數(shù)（第0～10 代） 的增加，E. faecalis 的MIC 值逐漸升高。E. faecalis 和E. faecalis-Cs 的生長曲線無明顯差異。透射電鏡，E. faecalis 和E. faecalis-Cs 均呈橢圓形或雙球型，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整，邊緣光滑，細(xì)胞質(zhì)分布均勻，2 種細(xì)菌形態(tài)大小和細(xì)胞壁厚度及完整性方面無明顯差異。結(jié)晶紫染色法，與E. faecalis比較，E. faecalis-Cs生物膜形成量明顯增加（Plt;0. 05）。MATH 法，與E. faecalis比較，E. faecalis-Cs的細(xì)菌疏水率明顯升高（Plt;0. 05）。RT-qPCR 法， 與E. faecalis 比較， E. faecalis-Cs 細(xì)菌生物膜中LuxS mRNA表達(dá)水平明顯升高 （Plt;0. 05）。結(jié)論：E. faecalis在反復(fù)暴露于氯己定后會產(chǎn)生耐藥性，耐藥菌株致病能力增強(qiáng)。群體感應(yīng)（QS） 系統(tǒng) LuxS 基因高表達(dá)和更強(qiáng)的細(xì)菌生物膜形成能力可能是E. faecalis 對氯己定產(chǎn)生耐藥性的潛在機(jī)制。

［關(guān)鍵詞］ 糞腸球菌； 氯己定； 耐藥性； 糞腸球菌氯己定耐藥菌株； 群體感應(yīng)系統(tǒng)

［中圖分類號］ Q939.121 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

糞腸球菌（Enterococcus faecalis， E. faecalis）是一種革蘭陽性兼性厭氧菌，也是導(dǎo)致持續(xù)難治性根尖周炎最常見的細(xì)菌之一，可定植于根管壁的牙本質(zhì)小管內(nèi)形成生物膜［1-2］。根尖周炎治療的有效性主要取決于根管內(nèi)E. faecalis 生物膜清除程度，因此根管治療術(shù)是控制根尖周感染的關(guān)鍵。氯己定作為最常見的根管沖洗劑之一，在臨床上被大量使用。氯己定是一種雙胍類廣譜抗菌劑，在低濃度時會導(dǎo)致細(xì)菌中鈣離子和鎂離子的置換及細(xì)胞壁中鉀離子的流失，從而產(chǎn)生抑菌作用。高濃度氯己定環(huán)境會導(dǎo)致所有細(xì)胞內(nèi)主要成分滲出至細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)菌裂解死亡， 從而產(chǎn)生殺菌作用［3］。研究［4］ 顯示：長期使用氯己定可能會導(dǎo)致部分口腔微生物產(chǎn)生耐藥性。EMILSON 等［5］ 從長期使用氯己定漱口水的患者口腔中分離出對氯己定敏感性降低的血鏈球菌。研究［6-7］ 表明：E. faecalis 對多種抗生素的耐藥性較高，但目前關(guān)于E. faecalis 對氯己定耐藥性的研究較少，具體機(jī)制尚未完全闡明。E. faecalis具有形成生物膜的能力，可在根管壁上形成牢固附著的生物膜，利用牙本質(zhì)和牙周膜的血清作為其營養(yǎng)來源， 可耐受抗菌劑和高堿性環(huán)境等極端環(huán)境［8］。同時， E. faecalis 含有多種毒力因子， 這些毒力因子有利于細(xì)菌之間的質(zhì)粒交換和黏附［9-10］。

持留菌狀態(tài)是指細(xì)菌中可耐受致死濃度抗生素的亞群，E. faecalis 可在低氧、強(qiáng)堿、高鹽、寡營養(yǎng)狀態(tài)和干燥的環(huán)境中以持留菌狀態(tài)生存，并可誘導(dǎo)羥基磷灰石沉淀形成鈣化生物膜，使其對常用的根管消毒藥物不敏感［11］。待藥物被清除后， 持留菌狀態(tài)的E. faecalis 則恢復(fù)生長能力，導(dǎo)致感染復(fù)發(fā)和炎癥遷延不愈［12］。群體感應(yīng)（quorum sensing，QS） 系統(tǒng)是細(xì)菌之間傳遞信號和調(diào)節(jié)群體行為的機(jī)制［13］。QS 系統(tǒng)為細(xì)菌種群密度依賴性調(diào)節(jié)機(jī)制，細(xì)菌與細(xì)菌之間可通過自誘導(dǎo)劑（autoinducer，AI）進(jìn)行交流。研究［14］ 證實(shí)： 細(xì)菌QS 系統(tǒng)與細(xì)菌耐藥性和生物膜形成有關(guān)，細(xì)菌可通過QS 系統(tǒng)產(chǎn)生信號分子，調(diào)節(jié)細(xì)菌的基因表達(dá)［15］。在E. faecalis中 QS 系統(tǒng)可由 S- 核糖基高半胱氨酸裂解酶（S-ribosylhomocysteine lyase， LuxS） 基因操控。目前E. faecalis 氯己定耐藥性與QS 系統(tǒng)之間的關(guān)系尚未完全闡明。本研究探討長期使用氯己定對E. faecalis 耐藥性的影響， 初步闡明其作用機(jī)制，為相關(guān)疾病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 細(xì) 菌、 主 要 試 劑 和 儀 器

E. faecalisATCC29212 （廣東環(huán)凱微生物科技有限公司），腦心浸出液（brain heart infusion， BHI） 培養(yǎng)基（英國Oxoid 公司）， 氯己定（北京索萊寶科技有限公司），結(jié)晶紫染料（北京酷來博科技有限公司），引物由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成，總RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RTqPCR）試劑盒（上海翌圣生物科技股份有限公司）。RT-qPCR 儀（型號： CFX96， 美國Bio-Rad公司），高速低溫冷凍離心機(jī)（型號：Sorvall ST8，美國Thermo 公司），酶標(biāo)儀（型號：Synergy-HT，美國Bio-Tek公司），透射電子顯微鏡（型號：HT7800，日本HITACHI 公司）。

1. 2 體 外 誘 導(dǎo) 耐 藥 菌 株

收 集 過 夜 培 養(yǎng) 的E. faecalis，離心后將其重懸于新鮮的BHI 培養(yǎng)基中，調(diào)整其濃度為1×107 CFU·L－1。將溶解于BHI培養(yǎng)基中的氯己定連續(xù)稀釋后， 取出100 μL 氯己定溶液， 將其與100 μL 調(diào)整后的菌懸液共同加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 以未接種細(xì)菌的BHI 培養(yǎng)基為對照。于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h， 記錄最低抑菌濃度（minimum inhibition concentration，MIC） 值。并將亞MIC 的細(xì)菌懸液吸出， 接種至含有相同濃度氯己定的新鮮BHI 培養(yǎng)基中， 繼續(xù)培養(yǎng)24 h。隨后5 000 r·min－ 1 離心5 min， 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline， PBS） 洗滌2 次以除去殘留的氯己定溶液。將離心后的細(xì)菌重懸于BHI 培養(yǎng)基中， 調(diào)整濃度， 繼續(xù)重復(fù)10 次。最后一次收集到的細(xì)菌即為 E. faecalis 氯己定耐藥菌株（E. faecalis chlorhexidine-resistant strains，E. faecalis-Cs）。氯己定體外誘導(dǎo)耐藥菌株在不含氯己定的BHI 瓊脂平板上連續(xù)傳代5 次，觀察其藥物耐受性是否穩(wěn)定存在，并于－80 ℃條件下存儲，以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1. 3 繪 制 2 種 菌 株 生 長 曲 線

將 過 夜 培 養(yǎng) 的E. faecalis 和E. faecalis-Cs 菌株分別重懸于新鮮的BHI 培養(yǎng)基中， 然后加入至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔200 μL。于37 ℃條件下分別在培養(yǎng)0、2、4、6、8、10、12、24 和48 h 時，采用酶標(biāo)儀檢測并記錄波長600 nm 處的吸光度（A） 值，以A 值反映細(xì)菌懸液中的細(xì)菌數(shù)量，繪制E. faecalis 和E. faecalis-Cs菌株的生長曲線。

1. 4 透射電子顯微鏡觀察 2種菌株形態(tài)表現(xiàn)

分別將E. faecalis 和E. faecalis-Cs 菌株以5 000 r·min－1離心5 min，PBS 緩沖液沖洗2 次，加入2. 5% 戊二醛溶液室溫避光固定30 min，4 ℃冰箱過夜。對樣品進(jìn)行包埋和制片，采用透射電子顯微鏡觀察2 種菌株形態(tài)表現(xiàn)。

1. 5 結(jié)晶紫染色法檢測 2種菌株細(xì)菌生物膜形成量

采用含1% 蔗糖的BHI培養(yǎng)基分別重懸E. faecalis和 E. faecalis-Cs 菌株， 調(diào)整細(xì)菌濃度至 1×108 CFU·L－1。將細(xì)菌懸液加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 于37 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h。待生物膜形成后，去除上層培養(yǎng)基，PBS 緩沖液沖洗3 次。每孔加入100 μL 甲醇固定15 min，再加入100 μL 0. 1%結(jié)晶紫溶液，室溫染色5 min 后，PBS 緩沖液洗去多余染料后風(fēng)干。最后每孔中加入200 μL 95% 乙醇，室溫避光振蕩 30 min 后， 采用酶標(biāo)儀檢測波長550 nm 處A 值，以生物膜A 值代表菌株細(xì)菌生物膜形成量。

1. 6 微生物黏著碳?xì)浠衔铮╩icrobial adhesionto hydrocarbons，MATH）法檢測2種菌株細(xì)菌疏水率

按照參考文獻(xiàn)［16］ 的方法，將培養(yǎng)24 h 的菌液以5 000 r·min－1 離心5 min，并在PUM 緩沖液中洗滌2 次后重懸， 檢測其在波長600 nm 處A 值為A0。取3 mL 重懸后的菌液，加入400 μL 正十六烷，連續(xù)振蕩 1 min， 使其充分混勻， 隨后室溫靜置15 min， 待其分層后取下層水相， 于波長 600 nm處檢測其最終A 值為A1， 以緩沖液為空白對照，計(jì)算2 種菌株細(xì)菌疏水率。 細(xì)菌疏水率= （A0－A1） /A0×100%。

1. 7 RT-qPCR 法 檢 測 2 種 菌 株 細(xì) 菌 生 物 膜 中LuxS mRNA 表 達(dá) 水 平

采 用 TRIzol 法 提 取E. faecalis 和E. faecalis-Cs 生物膜的總RNA，測定總RNA 濃度后，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，將總 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA 后進(jìn)行擴(kuò)增。采用RTqPCR法檢測2 種細(xì)菌中LuxS mRNA 表達(dá)水平，反應(yīng)總體系為20 μL。引物序列：LuxS 上游引物，5'-CGTTGGAACATTTATTAGC-3'， 下游引物，5'-TAGTTTCCGCACTCTTTTG-3'； 16S 上游引物，5'-AAGCAACGCGAAGAACCTTA-3'，下游引物， 5'-GTCTCGCTAGAGTGCCCAAC-3'。以16S 為內(nèi)參， 反應(yīng)條件： 95 ℃預(yù)變性5 min； 95 ℃變性10 s，60 ℃退火，延伸30 s，循環(huán)40 次。采用2－△△Ct 法計(jì)算2 種菌株細(xì)菌中LuxS mRNA 表達(dá)水平。

1. 8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraghPad Prism 8. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2 種菌株細(xì)菌生物膜形成量、細(xì)菌疏水率和細(xì)菌中LuxS mRNA 表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以x±s 表示，2 組間樣本均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 氯己定誘導(dǎo)E. faecalis的MIC值

將E. faecalis暴露于氯己定中連續(xù)培養(yǎng)10 代，由第0 代至第10代，E. faecalis 的MIC 值逐漸升高。提示E. faecalis 長期暴露于氯己定中可以導(dǎo)致E. faecalis-Cs 產(chǎn)生，誘導(dǎo)的E. faecalis-Cs 在不含氯己定的BHI 瓊脂平板上連續(xù)傳代5 次后耐藥性穩(wěn)定存在。見圖1。

2. 2 2種菌株生長曲線

E. faecalis和E. faecalis-Cs菌株均在培養(yǎng)0～6 h 內(nèi)迅速生長，之后生長速度逐漸減慢，最后進(jìn)入穩(wěn)定期。E. faecalis-Cs 菌株在培養(yǎng)6～12 h 時菌液渾濁度高于標(biāo)準(zhǔn)株，后趨于一致。2 種菌株整體生長趨勢無明顯差異。見圖2。

2. 3 透 射 電 子 顯 微 鏡 觀 察 2 種 菌 株 形 態(tài) 表 現(xiàn)

E. faecalis 和E. faecalis-Cs 在透射電子顯微鏡下均呈橢圓形或雙球型， 細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整， 邊緣光滑，細(xì)胞質(zhì)分布均勻，2 種細(xì)菌大小和細(xì)胞壁厚度及完整性方面無明顯差異。見圖3。

2. 4 2 種菌株細(xì)菌生物膜形成量

與 E. faecalis（2. 633±0. 134） 比較， E. faecalis-Cs 菌株細(xì)菌生物膜形成量（3. 333±0. 121） 明顯增加（Plt;0. 05）。

2. 5 2 種 菌 株 細(xì) 菌 疏 水 率

培 養(yǎng) 24 h 后 ， 與E. faecalis（5. 410%±0. 217%）比較，E. faecalis-Cs菌株的細(xì)菌疏水率（29. 403%±1. 784%） 明顯升高（Plt;0. 05）。

2. 6 2 種菌株細(xì)菌生物膜中 LuxS mRNA 表達(dá)水平

與 E. faecalis （1. 001±0. 051） 比 較，E. faecalis-Cs 細(xì)菌生物膜中LuxS mRNA 表達(dá)水平（1. 454±0. 050） 明顯升高（Plt;0. 05）。

3 討 論

對于E. faecalis 導(dǎo)致的難治性根尖周炎，臨床上通常采用根管治療術(shù)進(jìn)行處理，氯己定作為一種根管沖洗藥物被廣泛使用。研究［17］ 顯示：氯己定會導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，盡管氯己定導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥多在實(shí)驗(yàn)室條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生，但在臨床中由氯己定導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的風(fēng)險也應(yīng)被重視。

本研究結(jié)果顯示： E. faecalis 反復(fù)暴露于氯己定會導(dǎo)致其MIC 值持續(xù)升高， 證實(shí)了長期使用氯己定會導(dǎo)致E. faecalis 產(chǎn)生耐藥性。研究［18］ 顯示：與標(biāo)準(zhǔn)株比較，部分耐藥株的生長速度較標(biāo)準(zhǔn)株更為緩慢， 許多耐藥株通常會改變其細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)。MAVRI 等［19］ 研究發(fā)現(xiàn)： 對十六烷基吡啶（cetylpyridinium chloride， CPC） 產(chǎn)生耐藥性的大腸彎曲桿菌細(xì)胞膜更厚。本研究結(jié)果顯示：標(biāo)準(zhǔn)菌株和耐藥菌株的生長曲線及形態(tài)表現(xiàn)均無顯著差異，這可能是由于細(xì)菌種類和抗菌藥物的多樣性導(dǎo)致的。

細(xì)菌黏附能力與其致病性有密切關(guān)聯(lián)，黏附是細(xì)菌形成生物膜的第一步［20］。E. faecalis 不僅能夠黏附于側(cè)支根管、根管峽部和根尖三角區(qū)等不易清除的部位，還可能黏附于預(yù)備后的根管壁上，進(jìn)而再次形成生物膜， 導(dǎo)致炎癥遷延不愈［21］。本研究結(jié)果顯示：與標(biāo)準(zhǔn)菌株比較，耐藥菌株的生物膜形成量明顯增加，且細(xì)菌疏水率明顯升高，提示耐藥菌株的黏附能力和生物膜形成能力明顯增強(qiáng)，其致病能力也較強(qiáng)。

盡管使用抗菌藥物能夠清除細(xì)菌群體中大部分細(xì)菌，但同時也會導(dǎo)致耐藥菌株的產(chǎn)生。目前關(guān)于細(xì)菌的耐藥機(jī)制已經(jīng)受到廣泛關(guān)注。研究［22-23］ 表明：細(xì)菌的耐藥性可能與QS 系統(tǒng)有關(guān)。隨著細(xì)菌密度的增加， AI 分子會在環(huán)境中積累， 激活其同源受體，調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)，可通過影響外排泵表達(dá)水平、可移動遺傳元件（mobile genetic elements，MGEs） 和雙組分調(diào)控系統(tǒng)等多種途徑調(diào)控細(xì)菌的耐藥性［14，24-25］。 在 E. faecalis 中，QS 系統(tǒng)主要是LuxS/AI-2 依賴性 QS 系統(tǒng)［26］。本研究結(jié)果顯示：與標(biāo)準(zhǔn)菌株比較，耐藥菌株的LuxS mRNA 表達(dá)水平明顯升高。研究［27］ 證實(shí)：LuxS 基因表達(dá)水平與生物膜形成能力呈正相關(guān)關(guān)系， 與本研究結(jié)果一致。提示E. faecalis 對氯己定的耐藥性可能與LuxS基因的高表達(dá)及更強(qiáng)的細(xì)菌生物膜形成能力有關(guān)。

綜上所述，E. faecalis 會對氯己定產(chǎn)生耐藥性，且耐藥菌株的致病性明顯增加，QS 系統(tǒng)LuxS 基因的高表達(dá)及更強(qiáng)的細(xì)菌生物膜形成能力可能是E. faecalis 對氯己定產(chǎn)生耐藥性的潛在機(jī)制。因此，有必要改進(jìn)氯己定或研發(fā)新的藥物以取代氯己定。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：徐智博參與文獻(xiàn)檢索、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)收集和分析及論文撰寫，姜鑫淼參與文獻(xiàn)檢索、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和論文撰寫，甄雨琦和白瑪曲珍參與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)收集及分析，孫夢瑤參與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析和討論， 孟秀萍參與論文寫作指導(dǎo)和審校。

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[基金項(xiàng)目] 吉林省財(cái)政廳科技項(xiàng)目（JCSZ2021893-23）