摘 要 目的：建立高壓放電法和微生物挑戰(zhàn)法（浸沒式）以測試西林瓶包裝系統(tǒng)密封性。方法：采用高壓放電法及微生物挑戰(zhàn)法（浸沒式）檢測西林瓶包裝系統(tǒng)密封性。結(jié)果：微生物挑戰(zhàn)法（浸沒式）對1、3、5、10 mm孔徑的激光打孔陽性樣品的陽性檢出率分別為0%、30%、60%、70%，而高壓放電法均為100%；微生物挑戰(zhàn)法（浸沒式）陽性率靈敏度和高壓放電法靈敏度（檢測限）分別為1.4 mm和1 mm。后者優(yōu)于前者。結(jié)論：高壓放電法及微生物挑戰(zhàn)法（浸沒式）均可用于評估西林瓶包裝系統(tǒng)的密封性。

關(guān)鍵詞 高壓放電法 微生物挑戰(zhàn)法（浸沒式） 西林瓶 包裝系統(tǒng)密封性

中圖分類號：TB487 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2024）09-0131-05

引用本文 咸富榮. 高壓放電法和微生物挑戰(zhàn)法（浸沒式）測試西林瓶包裝系統(tǒng)密封性[J]. 上海醫(yī)藥， 2024， 45（9）： 131-135.

基金項目：國家藥典委2019Y04藥包材密封性完整性指導(dǎo)原則課題項目（2019Y04）

High-voltage leak detection and microbial challenge method （microbial ingress method） for testing the package integrity of injection vials

XIAN Furong

（Shanghai Food and Drug Packaging Material Control Center， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Objective： To establish high-voltage leak detection and microbiological challenge test （microbial ingress method） to determine the package integrity of the injection vial. Methods： The package integrity of the injection vial was determined using the high-voltage leak detection and microbiological challenge test （microbial ingress method）. Results： The positive detection rates of 1， 3， 5 and 10 mm laser-bored hole samples were 0%， 30%， 60% and 70% by microbiological challenge test （microbial ingress method）， respectively and 100% by high-voltage leak detection method. The sensitivity of positive rate was 1.4 mm by the microbial ingress method， and 1 mm by the high-voltage leak detection， and the later was higher than the former. Conclusion： Both the high-voltage leak detection and microbiological challenge test （microbial ingress method） can be used to evaluate the container closure integrity of injection vials.

KEY WORDS high-voltage leak detection； microbiological challenge test （microbial ingress method）； injection vials； package integrity

包裝系統(tǒng)密封性（package integrity），是指包裝系統(tǒng)防止內(nèi)容物損失、微生物侵入以及氣體（氧氣、空氣、水蒸氣等）或其他物質(zhì)進入，保證藥品持續(xù)符合安全與質(zhì)量要求的能力[1-2]。包裝系統(tǒng)密封性檢查（package integrity test），或稱容器密封完整性檢查（container-closure integrity test，CCIT），是指檢測任何破裂或縫隙的包裝泄漏檢測（包括理化或微生物檢測方法），一些檢測可以確定泄漏的尺寸和/或位置[3-4]。如果一個包裝系統(tǒng)的泄漏不超過其最大允許泄漏限度（maximum allowable leakage limit，MALL），則認為該包裝系統(tǒng)的密封性良好[1]。最大允許泄漏限度是指產(chǎn)品允許的最大泄漏率或泄漏尺寸，即在這個泄漏率或泄漏尺寸下，不存在任何影響產(chǎn)品安全性和質(zhì)量的泄漏風(fēng)險，可保證產(chǎn)品在貨架期內(nèi)及使用過程中符合相應(yīng)的理化及微生物質(zhì)量要求[5-6]。密封性檢查方法優(yōu)選能檢測出產(chǎn)品最大允許泄漏限度的確定性方法，并對方法的靈敏度等進行驗證[1，4]。如方法靈敏度無法達到產(chǎn)品最大允許泄漏限度水平或產(chǎn)品最大允許泄漏限度不明確，建議至少采用兩種方法（其中一種推薦微生物挑戰(zhàn)法）進行密封性研究，對兩種方法的靈敏度進行比較研究[1，4]。我國藥品包裝系統(tǒng)密封完整性研究工作已經(jīng)啟動，但是實踐中有待進一步提高理解，存在的問題主要可歸因于對于包裝系統(tǒng)密封性測試方法的不了解，研究不深入。

高壓放電法（high-voltage leak detection，HVLD）是用于檢測包含液體或半液體產(chǎn)品的無孔、剛性或柔性包裝壁中泄漏的存在及可能位置的確定性方法[4，7-8]。產(chǎn)品應(yīng)具有一定導(dǎo)電性、不易燃，而包裝組件相對不導(dǎo)電[1]。測試分析基于定量的電導(dǎo)測量[1，4，7]。微生物挑戰(zhàn)法（浸沒式）是一種破壞性的定性測量方法，屬于概率性方法，可用于判斷無孔、剛性或柔性包裝中的泄漏[4]。本研究采用了微生物挑戰(zhàn)法（浸沒式）與高壓放電法對西林瓶包裝系統(tǒng)密封性進行檢測，以期為國內(nèi)無菌藥品包裝系統(tǒng)的密封性的研究提供有益參考。

1 材料和方法

1.1 儀器

Airstream S-Series Class Ⅱ型生物安全柜（ESCO公司）；Thermo 815型生化培養(yǎng)箱（賽默飛世爾）；MLS-3780型高壓蒸汽滅菌鍋（日本三洋公司）；Easy TS EVO高壓放電法容器密封性測試儀（Antares Vision Group）。

1.2 菌種

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），菌株編號CMCC（B）10104，購自中國食品藥品檢定研究所，菌株代數(shù)第3代。

1.3 樣品

試驗西林瓶樣品規(guī)格為0.5 mL/瓶；西林瓶包裝系統(tǒng)由橡膠塞、中性硼硅玻璃管制注射劑瓶及鋁塑組合蓋三部分組成，容積2 mL。

陰性樣品：已知完好的西林瓶樣品。激光打孔陽性樣品：在玻璃容器實樣上進行激光打孔，漏孔尺寸約為1、3、5、10 mm，并對孔徑進行校準檢測。

1.4 方法

1.4.1 微生物挑戰(zhàn)法試驗

1）試驗方法 取樣品，用無菌注射器在包裝完好的包裝系統(tǒng)中注入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基作為陰性對照[9]。用無菌注射器在包裝完好的包裝系統(tǒng)中注入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，并分別接種小于100 CFU的銅綠假單胞菌，作為陽性對照[9]。

將由激光打孔陽性樣品組成的包裝系統(tǒng)浸入銅綠假單胞菌懸液中，加壓浸泡4 h后取出。用無菌棉球擦干樣品西林瓶外殘余的菌懸液，用75%乙醇棉球消毒西林瓶外表面3次[9]。顛倒翻轉(zhuǎn)，確保容器的內(nèi)表面和膠塞內(nèi)表面跟培養(yǎng)基完全接觸[9]。樣品置于生化培養(yǎng)箱中33 ℃直立培養(yǎng)7 d。

2）方法學(xué)驗證 對7 d后激光打孔陽性樣品、陰性對照品和陽性對照品所觀測到的結(jié)果分析，有菌生長的記為陽性，無菌生長的記為陰性。陽性樣品在紫外燈的照射下培養(yǎng)基呈藍綠色，陰性樣品在紫外燈的照射下培養(yǎng)基不呈藍綠色，微生物挑戰(zhàn)法對1、3、5、10 mm孔徑的激光打孔陽性樣品的陽性檢出率分別為0%、30%、60%、70%。

1.4.2 高壓放電法試驗

1）試驗方法 使用陰性樣品，設(shè)置一個足夠的檢查時間，至少執(zhí)行一個完整的旋轉(zhuǎn)。陰性樣品10個，各測3次。平均閾值：記錄各結(jié)果的平均值，并將平均閾值設(shè)置為該值的130%。峰閾值：記錄各結(jié)果的峰值，并將峰閾值設(shè)置為該值的130%。檢測參數(shù)設(shè)置如表1所示。當(dāng)樣品測試結(jié)果的平均閾值或峰閾值大于上述的設(shè)定的參數(shù)值時，儀器判定結(jié)果為不合格（Fail）；平均閾值和峰閾值都小于上述的設(shè)定限制的參數(shù)值時，儀器判定結(jié)果為合格（Pass）。

2）陽性率靈敏度（檢測限） 將實際產(chǎn)品灌裝的10支陰性樣品和激光打孔陽性樣品1、3、5、10 mm各3支，通過檢測峰值（‰）不低于陰性樣品檢測峰值（‰）3倍的最小孔徑陽性樣品，作為該高壓放電法測定試驗樣品方法的陽性率靈敏度（檢測限）。

3）準確度 將陰性樣品和1、3、5、10 mm激光打孔陽性樣品檢測的結(jié)果的準確性作為該方法的準確度評定依據(jù)。

4）耐用性 耐用性是指方法在盡管程序參數(shù)微小變化的情況下，能夠準確識別泄漏與非泄漏包裝的能力，同時它能夠為該方法提供在正常使用期間的適用性指示。本試驗將旋轉(zhuǎn)時間±5 ms，判別設(shè)備識別陰性/陽性樣品的能力，以此來反應(yīng)高壓放電法泄漏測試的耐用性。

5）不同制備方式陽性樣品的檢出 取金屬絲（直徑為30 μm）制備陽性樣品，利用金屬絲在密封件與容器之間形成泄漏通道，以模擬西林瓶樣品橡膠塞存在問題的情況。為評估金屬絲陽性樣品的容器密封完整性，使用儀器測試參數(shù)進行測試。取陰性樣品，金屬絲陽性樣品（直徑為30 μm）各3個并各測3次。

2 結(jié)果

2.1 微生物挑戰(zhàn)試驗

試驗結(jié)果顯示10個樣品結(jié)果均為陰性，表明基于本研究條件下該中性硼硅玻璃管制注射劑瓶/注射液用局部覆聚四氯乙烯膜溴化丁基橡膠塞包裝系統(tǒng)容器密封完整性良好（檢測限：1.4 μm）。

ROC（receiver operating characteristic）曲線下面積（area under curve，AUC）為0.865 8（圖1），表明1.4.1中統(tǒng)計分析模型預(yù)測效果好。當(dāng)陽性率為10%時，P=0.1，得到孔徑大小X=1.4 μm。

2.2 高壓放電法試驗

2.2.1 陽性率靈敏度（檢測限）

為了檢測該方法的靈敏度，進行檢測限的測試。 USP<1207.1>：在給定目標產(chǎn)品包裝的情況下，泄漏測試的檢測限度是該方法能夠可靠檢測的最小泄漏率或泄漏體積。結(jié)果顯示陽性率靈敏度（檢測限）為1 mm，表明該方法的陽性率靈敏度（檢測限）較高。

2.2.2 準確度

使用本研究建立的方法檢測陰性樣品和激光打孔陽性樣品，正確識別率均達100%（表2），表明所建立的檢測方法準確性良好、準確度高，儀器測試參數(shù)可滿足方法驗證的設(shè)計要求，可確保檢測的可靠性。

2.2.3 耐用性

陰性樣品和激光打孔陽性樣品均能正確識別（表3），表明該方法測試結(jié)果的耐用性好。

2.3 不同制備方式陽性樣品的檢出

本研究建立的測試參數(shù)可有效的檢出金屬絲陽性樣品（表4），表明該測試參數(shù)具有較高的準確度。

2.4 不同檢測方法的陽性率

結(jié)果顯示，微生物挑戰(zhàn)法（浸沒式）對1、3、5、10 μm 孔徑的激光打孔陽性樣品的陽性檢出率分別為0%、30%、60%、70%；高壓放電法對1、3、5、10 μm孔徑的激光打孔陽性樣品的陽性檢出率均為100%（表5）。高壓放電法的靈敏度優(yōu)于概率性方法微生物挑戰(zhàn)法。高壓放電法微生物挑戰(zhàn)法（浸沒式）10%陽性率靈敏度為1.4 mm，高壓放電法陽性率靈敏度（檢測限）為1 mm。均滿足化學(xué)藥品注射劑包裝系統(tǒng)密封性研究技術(shù)指南所列舉的檢測限級別[1]。

3 討論

大多數(shù)容器密封完整性測試在室溫下檢測樣品包裝在所有存儲條件下始終存在的永久性缺陷的泄漏。近期我國對于包裝密封完整性的研究開展的較多。常曉強等探究了色水法（亞甲基藍溶液法）、真空衰減法和微生物挑戰(zhàn)法對2 mL西林瓶包裝系統(tǒng)泄漏的檢出能力，結(jié)合微生物侵入試驗，找出微生物侵入風(fēng)險與泄漏孔徑之間的關(guān)系，并探究色水法檢測和真空衰減法靈敏度之間的關(guān)系[10]。封二飛等[11]研究發(fā)現(xiàn)，真空衰減法、高壓放電法與頂空氣體激光法檢測結(jié)果的重復(fù)性較好，檢測靈敏度較高，檢測過程對產(chǎn)品無損傷。國外研究者們對于高壓放電法也進行了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)高壓放電法可以在裝滿用于人體注射的胰島素門冬胰島素溶液的小塑料袋中發(fā)現(xiàn)孔泄漏[7]；并探討了封裝材料和產(chǎn)品儲存溫度對HVLD結(jié)果的影響[12]。M？ll等[13]認為HVLD是一種適合于100%檢驗吹填密封容器的完整性試驗方法。綜上，本研究建立的高壓放電法及微生物挑戰(zhàn)法（浸沒式）可有效評估西林瓶包裝系統(tǒng)密封性。我國藥品包裝系統(tǒng)密封完整性研究工作已經(jīng)啟動，但是實踐中有待進一步提高理解，尚欠缺不同測試方法相應(yīng)的技術(shù)標準，后續(xù)可進一步建立方法標準體系，提高藥品包裝系統(tǒng)對藥品的保護作用，保證藥品質(zhì)量[14]。

參考文獻

[1] 國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心. 化學(xué)藥品注射劑包裝系統(tǒng)密封性研究技術(shù)指南（試行）[EB/OL]. （2020-10-21）[2022-02-09]. https：//www.nmpa.gov.cn/xxgk/ggtg/ypggtg/ ypqtggtg/20201023152807106.html.

[2] 姚琳， 咸富榮， 張芳芳. 質(zhì)量提取法測試西林瓶包裝系統(tǒng)密封性[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志， 2022， 53（7）： 1013-1017.

[3] Parenteral Drug Association. Technical report No. 86， industry challenge and current technologies for pharmaceutical package integrity testing （single user digital version）[EB/ OL]. [2023-04-14]. https：//www.pda.org/bookstore/productdetail/6132-tr-86-pharmaceutical-package.

[4] 國家藥典委員會. 歐美日藥典藥包材標準選編[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社， 2019： 175.

[5] 國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品認證管理中心. 藥品GMP指南： 無菌藥品[M]. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2011： 256.

[6] 陳江， 王俊蘇， 關(guān)天橫， 等. 注射劑包裝密封完整性檢測技術(shù)研究進展[J]. 中國藥業(yè)， 2021， 30（2）： 5-11.

[7] Damgaard R， Rasmussen M， Buus P， et al. High-voltage leak detection of a parenteral proteinaceous solution product packaged in form-fill-seal plastic laminate bags. Part 1. Method development and validation[J]. PDA J Pharm Sci Technol， 2013， 67（6）： 634-651.

[8] 曾凡云， 李姝潔， 李偉， 等. 注射劑一致性評價與無菌藥品包裝系統(tǒng)密封性創(chuàng)新驗證[J]. 流程工業(yè)， 2020（8）： 46-48.

[9] 王妮， 黃思嘉， 王靜， 等. 注射劑瓶容器密封完整性：微生物挑戰(zhàn)法與色水法的關(guān)聯(lián)比較分析[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志， 2022， 53（2）： 246-252.

[10] 常曉強， 劉海鵬， 智曉日. 色水法、真空衰減法及微生物挑戰(zhàn)法在密封性測試中的研究分析[J]. 計量與測試技術(shù)， 2022， 49（11）： 23-25； 29.

[11] 封二飛， 張筱宜， 趙明. 無菌藥品容器密封完整性檢測方法對比研究[J]. 中國藥業(yè)， 2021， 30（14）： 51-54.

[12] Rasmussen M， Damgaard R， Buus P， et al. High-voltage leak detection of a parenteral proteinaceous solution product packaged in form-fill-seal plastic laminate bags. Part 2. Method performance as a function of heat seal defects， product-package refrigeration， and package plastic laminate lot[J]. PDA J Pharm Sci Technol， 2013， 67（6）： 652-663.

[13] M？ll F， Doyle DL， Haerer M， et al. Validation of a high voltage leak detector for use with pharmaceutical blow-fillseal containers-a practical approach[J]. PDA J Pharm Sci Technol， 1998， 52（5）： 215-227.

[14] 陸維怡， 蔡榮. 國內(nèi)外藥品包裝系統(tǒng)密封完整性研究與保障藥品質(zhì)量安全的思考[J]. 中國藥事， 2021， 35（7）： 828-834.