摘 要 目的：優(yōu)選肺熱普清配方中水溶性有效成分的提取工藝。方法：采用L9（34）正交試驗(yàn)法優(yōu)選提取工藝，以干浸膏得率、羥基紅花黃色素A轉(zhuǎn)移率、乙酸乙酯萃取粗品得率為指標(biāo)，考察加水倍數(shù)、提取時(shí)間、提取次數(shù)3個(gè)因素對(duì)提取工藝的影響。結(jié)果：優(yōu)選的最佳工藝為加12倍水，提取3次，每次1 h。結(jié)論：優(yōu)選的工藝穩(wěn)定可靠，有效成分轉(zhuǎn)移率高。

關(guān)鍵詞 肺熱普清 提取工藝 正交試驗(yàn) 羥基紅花黃色素A

中圖分類號(hào)：R284.2； R29 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2024）09-0122-05

引用本文 宋麗莉， 采金金， 尼瑪次仁， 等. 正交試驗(yàn)優(yōu)選藏藥肺熱普清配方中水溶性有效成分提取工藝[J]. 上海醫(yī)藥， 2024， 45（9）： 122-126.

基金項(xiàng)目：西藏自治區(qū)科技廳中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展項(xiàng)目（XZ202202YD0020C）

Optimization of extraction process of water-soluble active ingredients in the formula of Tibetan medicine Lotse Kunsel by orthogonal test

SONG Lili1，2， CAI Jingjing1，3，4， NIMA Ciren1，5， BAIMA Danzeng1，5， XIE Hebing1，3，4，5

（1. Jiangsu God Monkey Pharmaceutical Research Co.， Ltd.， Nantong 226000， China； 2. School of Pharmacy， Nantong University， Nantong 226000， China； 3. School of Pharmacy， Anhui University of Chinese Medicine， Hefei 230012， China； 4. Yangtze Delta Drug Advanced Research Institute， Nantong 226000， China； 5. Tibet God Monkey Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shigatse 858300， China）

ABSTRACT Objective： To optimize the extraction process of water-soluble active ingredients in the formula of Lotse Kunsel. Methods： The yield of dry extract， the transfer rate of hydroxysafflower yellow A and the yield of solid content extracted by ethyl acetate were used as indexes. The effects of water addition ratio， extraction time and extraction times on the extraction process were investigated. L934 orthogonal test was used to optimize the extraction process. Results： The best process was to add 12 times of water and extract three times for 1 hour each. Conclusion： The optimized process is stable and reliable and the transfer rate of active ingredients is high.

KEY WORDS Lotse Kunsel； extraction process； orthogonal test； hydroxysafflower yellow A

肺熱普清散（藏名：洛才更賽）收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·藏藥 第一冊(cè)》[1]中，為西藏神猴藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)的獨(dú)家藏藥復(fù)方制劑。肺熱普清散由天竺黃、紅花、力嘎都、甘草、鐵棒錘幼苗、訶子等14味藥味組方，具有清肺泄熱、消炎的作用，可用于小兒肺炎、流行性感冒、風(fēng)熱、癘熱等病癥。本方已有400多年的臨床實(shí)踐應(yīng)用歷史，始載于16世紀(jì)時(shí)的《驗(yàn)方百編》，并沿用至今。本方中的檀香、力嘎都具有清熱涼血的療效；麝香、鐵棒錘具有清熱、消炎止痛的療效；訶子調(diào)和三因，治三因合并癥；木香、甘草、高山辣根菜具有清熱止咳、行氣止痛的療效。諸藥合用，清肺止咳，消炎止痛[2-5]。肺熱普清散為傳統(tǒng)散劑，全部藥味粉碎后直接入藥，存在易吸潮結(jié)塊、味苦、患者依從性較差的問(wèn)題。為了進(jìn)一步將其開(kāi)發(fā)成一種安全、有效、依從性高的口服混懸劑，本試驗(yàn)在對(duì)處方組成藥味所含有效物質(zhì)和主要成分、藥材性質(zhì)綜合分析的基礎(chǔ)上，將一部分藥材（檀香、木香、丁香、安息香、降香、銀朱、人工麝香）保持原先制備工藝直接粉碎入藥，一部分藥材（紅花、高山辣根菜、力嘎都、訶子、甘草、天竺黃、鐵棒錘幼苗）采用水回流提取浸膏入藥，本實(shí)驗(yàn)以干浸膏得率、羥基紅花黃色素A轉(zhuǎn)移率、乙酸乙酯萃取粗品得率為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選水提取工藝，并進(jìn)行了3批次的驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)所得最佳提取工藝穩(wěn)定可靠，有效成分轉(zhuǎn)移率高，可為該制劑的中試以及大生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

Agilent 1100型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；XSR205DU/AC型十萬(wàn)分之一天平（梅特勒-托利公司）。

天竺黃（批號(hào)220101）與甘草（批號(hào)210901）購(gòu)于安徽援康中藥飲片股份有限公司；紅花（批號(hào)20200301）、鐵棒錘幼苗（批號(hào)20200301）、高山辣根菜（批號(hào)210901）、訶子（批號(hào)20200201）以及力嘎都（批號(hào)20200401）購(gòu)自西藏神猴藥業(yè)有限責(zé)任公司；羥基紅花黃色素A對(duì)照品（批號(hào)111637-202111，含量96.8%）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純，安徽時(shí)聯(lián)特種溶劑股份有限公司）；磷酸（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙酸乙酯（分析純，General Reagent公司）；屈臣氏蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 羥基紅花黃色素A含量測(cè)定方法

色譜柱：Ultimate XB-C18（4.6 mm×250 mm， 5 mm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸溶液=30∶70；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)403 nm；進(jìn)樣體積10 mL；柱溫30 ℃。

1.2.2 溶液制備

1）對(duì)照品溶液 精密稱取羥基紅花黃色素A對(duì)照品10 mg，置50 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度；精密量取2 mL置10 mL量瓶中，用50%甲醇定容，即得。

2）供試品溶液 精密量取提取濾液5 mL置10 mL量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液。

1.2.3 干浸膏得率測(cè)定

精密移取水提取濾液20 mL置已干燥恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃烘箱干燥3 h，取出，置干燥器中放置30 min，迅速精密稱定重量；按下式計(jì)算干浸膏得率：干浸膏得率（%）=（W1/V1）/（Wt/V2）×100%。式中：W1為測(cè)定干浸膏重量（g），V1為取樣體積（mL），Wt為藥材總重量（g），V2為提取液體積（mL）。

1.2.4 乙酸乙酯萃取粗品得率

精密移取水提取液20 mL，每次加入乙酸乙酯60 mL至分液漏斗，萃取3次，振蕩，放置分層，合并有機(jī)相，置已恒重的蒸發(fā)皿中，放于水浴鍋蒸干，余同1.2.3。

1.2.5 提取工藝正交試驗(yàn)

分別稱取天竺黃10 g、甘草10 g、力嘎都10 g、紅花10 g、訶子5 g、高山辣根菜5 g、鐵棒錘幼苗1 g，共9份，每份51 g。以干浸膏得率、羥基紅花黃色素A轉(zhuǎn)移率、乙酸乙酯萃取粗品得率為考察指標(biāo)，對(duì)加水倍數(shù)（A）、提取時(shí)間（B）、提取次數(shù)（D）進(jìn)行L9（34）正交設(shè)計(jì)考察，采用綜合評(píng)分為考察指標(biāo)，其中干浸膏得率權(quán)重系數(shù)0.4、羥基紅花黃色素A轉(zhuǎn)移率權(quán)重系數(shù)0.3、乙酸乙酯萃取粗品得率權(quán)重系數(shù)0.3，即綜合評(píng)分=干浸膏得率×40%+羥基紅花黃色素A轉(zhuǎn)移率×30%+乙酸乙酯萃取粗品得率×30%。因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果

2.1 含量測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證

本方法經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，計(jì)算得羥基紅花黃色素A線性回歸方程：y=13.711x-23.216（r=1.000）；儀器精密度RSD為0.46%（n=6）；羥基紅花黃色素A重復(fù)性的平均含量為0.062 48 mg/mL，RSD為0.70%（n=6）；供試品和對(duì)照品溶液在常溫24 h的溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，羥基紅花黃色素A峰的峰面積RSD分別為0.67%、0.58%；加樣回收的平均回收率為100.3%，RSD為0.44%（n=6）。

另外，本方法的專屬性良好，供試品的色譜圖中與對(duì)照品相應(yīng)的位置有相同的色譜峰，相鄰峰之間互不干擾，可作為本工藝的提取方法進(jìn)行研究（圖1）。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，P<0.05提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正交試驗(yàn)結(jié)果及極差R顯示，3個(gè)因素的影響大小依次為D>A>B；根據(jù)K值可以看出D3>D2>D1，A3>A2>A1，B2>B1>B3（表2）。方差分析結(jié)果顯示，加水倍數(shù)（A）、提取次數(shù)（D）對(duì)提取工藝有顯著影響（P<0.05），而提取時(shí)間（B）無(wú)顯著影響（表3）。B2和B1的K值很接近，從節(jié)能與實(shí)際工藝生產(chǎn)等方面考慮，結(jié)合極差和方差結(jié)果，在保證充分提取的前提下，最終確定最佳提取工藝為C3B1A3，即加12倍水，提取3次，每次1 h。

2.3 提取工藝驗(yàn)證

以最佳工藝進(jìn)行公斤級(jí)3批驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果顯示，3批的平均干浸膏得率為31.34%，RSD為3.52%，羥基紅花黃色素A平均轉(zhuǎn)移率為66.62%，RSD為1.43%，乙酸乙酯萃取粗品得率為4.72%，RSD為2.15%（表4）。表明此提取工藝合理、穩(wěn)定可行。

3 討論

3.1 提取工藝的選擇

肺熱普清散的原料藥材有14種，通過(guò)對(duì)各原料藥材的有效物質(zhì)和主要成分、藥材性質(zhì)進(jìn)行綜合分析，本方的有效物質(zhì)主要包括難溶性的無(wú)機(jī)鹽類、難溶性的揮發(fā)油以及水溶性的生物堿、黃酮、皂苷、多糖成分。針對(duì)水溶性的有效物質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)將部分藥材進(jìn)行水提取后發(fā)現(xiàn)，該工藝穩(wěn)定、可行，且有效成分轉(zhuǎn)移率高。而針對(duì)難溶性的揮發(fā)油，本實(shí)驗(yàn)嘗試了提取揮發(fā)油并采用β-環(huán)糊精包合的工藝進(jìn)行固化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)工藝復(fù)雜，揮發(fā)油的轉(zhuǎn)移率較低，這可能與本方中所含揮發(fā)油的成分較為復(fù)雜有關(guān)，因此，需要進(jìn)一步地將揮發(fā)油進(jìn)行分離、精制，得到不同的揮發(fā)性成分，再針對(duì)性地研究?jī)?yōu)選環(huán)糊精的型號(hào)與包合工藝?？紤]到工藝的復(fù)雜性、產(chǎn)業(yè)化的成本、注冊(cè)的難易等因素，最終，選擇了一部分藥材水提取浸膏入藥，另一部分藥材保持原粉入藥的工藝不變。

3.2 水提取工藝研究指標(biāo)的選擇

本試驗(yàn)進(jìn)行L9（34）正交設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，采用綜合評(píng)分為考察指標(biāo)[6-9]，其中干浸膏得率權(quán)重系數(shù)0.4、羥基紅花黃色素A轉(zhuǎn)移率權(quán)重系數(shù)0.3、乙酸乙酯萃取粗品得率權(quán)重系數(shù)0.3。干浸膏得率是考察中藥提取工藝的傳統(tǒng)指標(biāo)且不容忽視，浸膏量不僅決定日服用劑量，還會(huì)影響有效成分含量并影響療效，因此將干浸膏得率賦予40%的權(quán)重。紅花藥材總量占提取藥材總量約19.6%，占比大；羥基紅花黃色素A是紅花中最具藥理活性的水溶性成分，研究表明羥基紅花黃色素A可顯著降低氣道阻力，改善動(dòng)態(tài)肺順應(yīng)性和減少炎癥因子等作用；2020版中國(guó)藥典明確規(guī)定以該成分為含有量測(cè)定和質(zhì)量控制的指標(biāo)，因此將羥基紅花黃色素A的轉(zhuǎn)移率賦予30%的權(quán)重[10-13]。黃酮類化合物廣泛存在于植物的根、莖、葉、花和果實(shí)中，具有廣譜抑菌性，且不易產(chǎn)生耐藥性；其易溶于諸如甲醇、乙醇和乙酸乙酯等有機(jī)溶劑中，水提法提取的黃酮類化合物雜質(zhì)多，須用乙酸乙酯進(jìn)一步純化[14]；通過(guò)乙酸乙酯萃取粗品得率來(lái)反應(yīng)提取液中黃酮類化合物的含量，因此將乙酸乙酯萃取粗品得率賦予30%的權(quán)重。本研究使用多指標(biāo)評(píng)分，避免單一因素對(duì)中藥復(fù)方提取工藝篩選的局限性和片面性，使分析結(jié)果更準(zhǔn)確、可靠，保證了提取工藝的合理性。通過(guò)正交試驗(yàn)結(jié)果分析，最終確定提取工藝為加12倍水，提取3次，每次1h。經(jīng)公斤級(jí)3批驗(yàn)證，優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好，可為肺熱普清混懸劑的中試、大生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)： 藏藥 第一冊(cè)[M]. 北京： 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社， 1995： 69.

[2] 李想， 李冀. 甘草提取物活性成分藥理作用研究進(jìn)展[J].江蘇中醫(yī)藥， 2019， 51（5）： 81-86.

[3] 李國(guó)峰， 陳海芳， 郎一帆， 等. 訶子總黃酮提取工藝的優(yōu)化及其體外生物活性研究[J]. 中成藥， 2021， 43（11）： 2945-2951.

[4] 立新， 郝俊生， 巴德瑪斯仁， 等. 紅花有效成分提取工藝研究[J]. 中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)， 2021， 27（6）： 45-46； 67.

[5] 王佐梅， 肖洪彬， 李雪瑩， 等. 中藥紅花的藥理作用及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 中華中醫(yī)藥雜志， 2021， 36（11）： 6608-6611.

[6] 晏菲， 王景媛， 曾永成， 等. 正交試驗(yàn)優(yōu)選抗風(fēng)止痛寧提取工藝[J]. 中國(guó)藥業(yè)， 2021， 30（23）： 40-43.

[7] 陳淼， 李曙光， 楊淡梅. 正交試驗(yàn)優(yōu)選通癃顆粒提取工藝[J]. 中國(guó)藥業(yè)， 2022， 31（11）： 51-55.

[8] 林帥軍， 郭麗， 榮曉哲， 等. 正交試驗(yàn)-多指標(biāo)權(quán)重分析法優(yōu)選芪苓益腎顆粒的提取工藝[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床， 2021， 36（11）： 2259-2263.

[9] 費(fèi)倩倩， 唐靜月， 張文明， 等. 多指標(biāo)權(quán)重正交試驗(yàn)優(yōu)選益腎泄?jié)岷蟿┲苽涔に嘯J]. 中國(guó)藥師， 2022， 25（5）： 889-893.

[10] 牛芬溪， 劉悅， 劉雅楠， 等. 羥基紅花黃色素A的藥理作用及研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志， 2021， 56（17）： 1372-1377.

[11] 馮驍騰， 杜敏， 張一凡， 等. 羥基紅花黃色素A 心血管保護(hù)作用及機(jī)制[J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊， 2022， 40（6）： 77-80.

[12] 趙虎義， 張德瑞， 李彥錚， 等. HPLC測(cè)定蒙藥沙日·毛都-9丸中羥基紅花黃色素A的含量[J]. 中國(guó)民族醫(yī)藥雜志， 2022， 28（5）： 59-60.

[13] 郝美玲， 趙麗娜， 籍學(xué)偉， 等. HPLC法測(cè)定蒙成藥小兒清肺八味丸中羥基紅花黃色素A的含量[J]. 中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)， 2020， 21（1）： 76-80.

[14] 景聯(lián)鵬， 唐徐禹， 顧麗莉， 等. 植物中黃酮類化合物提取技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 纖維素科學(xué)與技術(shù)， 2021， 29（4）： 60-70.