摘 要 目的：建立定量測(cè)定生物制品豬纖維蛋白原中枸櫞酸離子含量的高效液相色譜法，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。方法：采用示差折光檢測(cè)器和Agilent Hi-plex H色譜柱（7.7 mm×300 mm，8 mm），以4 mmol/L硫酸溶液為流動(dòng)相，柱溫50 ℃，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量5 mL進(jìn)行色譜分析。結(jié)果：標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為5.01～15.04 mmol/L，線性相關(guān)系數(shù)r為0.999 5；低、中、高3個(gè)濃度水平的平均回收率分別為104.0%、102.8%、97.6%，總平均回收率為101.5%（n=9），RSD為3.16%（n=9）；中間精密度RSD為0.75%（n=12）；耐用性比值為99.71%～100.49%。結(jié)論：該方法專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度、精密度、耐用性良好，適用于豬纖維蛋白原中枸櫞酸離子含量的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜法 豬纖維蛋白原 枸櫞酸離子 生物制品

中圖分類號(hào)：R973.1； R927.11 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2024）09-0127-04

引用本文 潘玲利， 丁天美， 張軍東. 高效液相色譜法測(cè)定豬纖維蛋白原中枸櫞酸離子含量[J]. 上海醫(yī)藥， 2024， 45（9）： 127-130； 135.

Determination of citrate ion content in porcine fibrinogen by high performance liquid chromatography

PAN Lingli， DING Tianmei， ZHANG Jundong

（Shanghai Li Kang Rui Biological Technology Co.， Ltd.， Shanghai 201707， China）

ABSTRACT Objective： To establish a method for the determination of citrate ion content in porcine fibrinogen of biological products by high performance liquid chromatography （HPLC）， and the method was validated. Methods： A refractive index detector and Agilent Hi-plex H column （7.7 mm×300 mm， 8 mm） were used and the HPLC was performed with 4 mmol/L sulfuric acid solution as mobile phase at column temperature 50 ℃， flow rate 0.8 mL/min， and sample volume 5 mL. Results： The standard curve was linear over the range of 5.01-15.04 mmol/L with linear correlation coefficient r 0.999 5. The average recoveries at low， medium and high concentrations were 104.0%， 102.8% and 97.6%， respectively and the overall average recovery was 101.5% （n=9）， and the overall relative standard deviation （RSD） was 3.16% （n=9）. The RSD obtained from the intermediate precision was only 0.75% （n=12） and the durability ratio was 99.71%-100.49%. Conclusion： This method has strong specificity， good accuracy， precision， and durability， and is suitable for the determination of citric acid ion content in porcine fibrinogen.

KEY WORDS HPLC； porcine fibrinogen； citrate ion； biological products

枸櫞酸鈉又名檸檬酸鈉，可作為穩(wěn)定劑添加在人凝血因子類產(chǎn)品中[1]，也可作為抗凝血?jiǎng)┖蜐B透壓調(diào)節(jié)劑添加在凝血因子類、血漿類、重組人促紅細(xì)胞生成素等血液制品中。豬纖維蛋白粘合劑是臨床上常用的輔助止血藥，由豬纖維蛋白原、豬凝血酶及相應(yīng)的稀釋劑組成。豬纖維蛋白原是由健康豬血漿，經(jīng)分離、提純并經(jīng)病毒滅活處理、凍干制成的生物制品，其中含有的枸櫞酸離子，在原料豬血漿的采集中作為豬血漿的抗凝劑和纖維蛋白原的生產(chǎn)工藝中引入，然后因其具有局部抗凝的作用[2]，從而可能會(huì)影響該藥的止血功效，因此枸櫞酸離子含量的準(zhǔn)確測(cè)定對(duì)纖維蛋白原的質(zhì)量控制具有重要的意義。枸櫞酸離子的含量測(cè)定，國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的方法有紫外-可見分光光度法[1]494-495、酸堿滴定法[3]、離子色譜法[4-6]、全自動(dòng)酶法[7]、高效液相色譜法[8-9]和離子交換-中和滴定法[10]等。本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC法，使用示差折光檢測(cè)器，采用定量分析和外標(biāo)工作曲線法，可以快速準(zhǔn)確測(cè)定本公司生產(chǎn)的豬纖維蛋白原制品中的枸櫞酸離子含量。本研究對(duì)該方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，從而為后續(xù)的產(chǎn)品質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

豬纖維蛋白原凍干粉（規(guī)格2.5 mL，批號(hào)20200502、20220806、20220907、20220908）由本公司生產(chǎn)。

枸櫞酸對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)100396-201603）；0.1 mol/L硫酸滴定液（上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院，批號(hào)201014）；磺基水楊酸（分析純，購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；純化水。

1.2 主要儀器

1260高效液相色譜儀、G1362A示差折光檢測(cè)器、Open LAB CDS數(shù)據(jù)處理工作站（安捷倫公司）；XSE電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；H1650型高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）。

1.3 色譜條件

采用Agilent PL Hi-plex H Guard 色譜柱（7.7 mm×50 mm，8 mm）為預(yù)柱和Agilent Hi-plex H色譜柱（7.7 mm×300 mm，8 mm）、以4 mmol/L硫酸溶液為流動(dòng)相，于柱溫50 ℃、流速0.8 mL/min、進(jìn)樣量5 mL條件下進(jìn)行HPLC分析。

1.4 溶液配制

1）4 mmol/L硫酸溶液 取80 mL 0.1 mol/L （1/2）硫酸滴定液加水定容至1 000 mL容量瓶中，搖勻即得。

2）1.5%磺基水楊酸溶液 稱取1.5 g磺基水楊酸加水溶解，定容至100 mL容量瓶中混勻即得。

3）磺基水楊酸溶液稀釋液 取1.5%磺基水楊酸溶液5 mL，用水定容至10 mL容量瓶中混勻即得。

4）對(duì)照品溶液 精密稱取經(jīng)105 ℃干燥2 h的枸櫞酸對(duì)照品約77 mg，置10 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，混勻得儲(chǔ)備液（7.7 mg/mL）；精密量取1.25 mL置于5 mL容量瓶，用水定容至刻度，混勻即得對(duì)照品溶液。

5）線性溶液 精密量取儲(chǔ)備液0.625、0.938、1.25、1.563、1.875 mL，分別置于5 mL容量瓶，用水定容至刻度，混勻。

6）供試品溶液 取外用豬纖維蛋白原成品凍干粉1支，用2.5 mL水溶解后作為供試品溶液。取該溶液1 mL置10 mL離心管中，加入1 mL水混勻后，精密加入1.5%磺基水楊酸溶液2 mL混勻，離心（室溫，12 000 r/min）10 min，上清液用0.45 mm孔徑的濾膜過濾，取濾液進(jìn)樣。

1.5 方法驗(yàn)證

1.5.1 專屬性

分別取空白溶劑（純化水）、對(duì)照品溶液、磺基水楊酸溶液稀釋液和供試品溶液，各取5 μL注入液相色譜儀中進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，考察方法的專屬性。

1.5.2 線性和范圍

分別精密量取線性溶液5 mL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以線性溶液的枸櫞酸離子的濃度對(duì)其相應(yīng)的峰面積作直線回歸，計(jì)算直線回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.5.3 準(zhǔn)確度

按1.4配制濃度約為10.8 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別精密量取該儲(chǔ)備液0.429、0.715、1.0 mL置離心管，各加供試品溶液1.0 mL，再精密分別加入水0.571、0.285、0 mL混勻；各取1 mL，分別精密加入1.5%磺基水楊酸溶液2 mL混勻，離心，上清液用0.45 mm孔徑的濾膜過濾，取濾液。每組平行配制3份，即得R60%-1～3、R100%-1～3、R140%-1～3的準(zhǔn)確度溶液。進(jìn)樣測(cè)定枸櫞酸離子含量，計(jì)算平均回收率和RSD。

1.5.4 精密度

重復(fù)性：甲實(shí)驗(yàn)員，按供試品處理方法平行配制6份溶液，記錄色譜圖，計(jì)算6份枸櫞酸離子含量結(jié)果的RSD。中間精密度：乙實(shí)驗(yàn)員在不同的日期，使用不同的系列溶液，按重復(fù)性下操作方法平行操作6次。計(jì)算6份樣品枸櫞酸離子含量的RSD，同時(shí)結(jié)合甲實(shí)驗(yàn)員的數(shù)據(jù)，計(jì)算12份樣品中枸櫞酸離子含量的RSD。

1.5.5 溶液穩(wěn)定性

取對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別于室溫放置0、24、48 h后進(jìn)樣分析，考察其穩(wěn)定性，計(jì)算溶液在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)后與0 h實(shí)測(cè)含量比值。

1.5.6 耐用性

在其他色譜條件不變條件下，分別調(diào)整離心轉(zhuǎn)速至方法規(guī)定的±500 r/min、柱流速至方法規(guī)定的±0.2 mL/min和柱溫至方法規(guī)定的±2℃，計(jì)算改變參數(shù)方法與正常方法所得含量之比，考察方法的耐用性。

2 結(jié)果

2.1 專屬性

空白溶劑和磺基水楊酸溶液在對(duì)照品溶液和樣品溶液中枸櫞酸的保留時(shí)間（約7.95 min）處沒有干擾（圖1），表明該方法專屬性良好。

2.2 系統(tǒng)適用性

起始5針對(duì)照溶液中枸櫞酸峰面積的RSD均≤1.0%。所有間插進(jìn)樣的對(duì)照品溶液中枸櫞酸峰面積與起始5針對(duì)照品溶液的對(duì)應(yīng)峰的平均峰面積的比值均在98.8%～100.6%之間，符合可接受標(biāo)準(zhǔn)（95.0%～105.0%）。

2.3 線性和范圍

線性方程為y=8 938.70x-1 509.41，線性范圍為5.01～15.04 mmol/L，相關(guān)系數(shù)r=0.999 5，符合可接受標(biāo)準(zhǔn)（r≥0.999）。

2.4 準(zhǔn)確度

3組不同濃度樣品的平均回收率分別為104.0%、102.8%、97.6%（n=3）。9組樣品的總平均回收率為101.5%（n=9），RSD為3.16%（n=9），滿足回收率的接受標(biāo)準(zhǔn)95.0%～105.0%和RSD的接受標(biāo)準(zhǔn)≤5.0%（表1）。

2.5 精密度（重復(fù)性、中間精密度）

甲、乙兩位實(shí)驗(yàn)員測(cè)得6份樣品的RSD分別為0.70%、0.42%，均滿足接受標(biāo)準(zhǔn)（RSD≤2.0%）；測(cè)得12份樣品中枸櫞酸離子含量的平均值為42.13 mmol/L，2.6 溶液穩(wěn)定性

供試品和對(duì)照品溶液在24、48 h時(shí)間點(diǎn)測(cè)得含量與0時(shí)間點(diǎn)測(cè)得含量之比為98.20%～99.97%，符合可接受標(biāo)準(zhǔn)95.0%～105.0%。

2.7 耐用性

各耐用性試驗(yàn)條件參數(shù)微調(diào)后測(cè)定的枸櫞酸離子含量與正常方法測(cè)定含量之比在99.71%～100.49%之間，符合可接受標(biāo)準(zhǔn)（95.0%～105.0%），說明該方法耐用性良好（表3）。

2.8 樣品測(cè)定

另取供試品3批（20220806、20220907、20220908）制備供試品溶液并進(jìn)樣測(cè)定，每批平行測(cè)定2次，根據(jù)隨行線性曲線計(jì)算供試品中枸櫞酸離子含量分別為41.16、40.68、42.18 mmol/L。3批結(jié)果穩(wěn)定，說明方法的適用性良好。

3 討論

本研究建立了高效液相色譜法定量測(cè)定豬纖維蛋白原中枸櫞酸離子含量，較常用的紫外-可見分光光度法所用試劑種類少且更安全，更易購買，更方便管理，同時(shí)具有操作簡便、自動(dòng)化程度高、精密度高、準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)[11]。較常規(guī)的HPLC法，本法中使用預(yù)柱，有效地阻攔容易損壞色譜柱的物質(zhì)，延長液相色譜柱使用壽命[12]。本法采用五點(diǎn)線性方程回歸法做標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線更加可靠。本法樣品制備過程中使用高速離心（12 000 r/min）沉淀蛋白質(zhì)，從而降低其對(duì)測(cè)定的干擾。

本研究方法具有操作簡單，專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度、精密度、耐用性好的優(yōu)勢(shì)，適用于豬纖維蛋白原中枸櫞酸離子含量的測(cè)定。本研究符合2020版中國藥典枸櫞酸離子測(cè)定法的要求[1] 494-495，也許未來有更便捷、準(zhǔn)確的方法，研究人員將繼續(xù)研究探索。

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