摘 要 黃連素是一種具有顯著抑菌作用的重要生物堿。利用柱層析對(duì)其合成中縮合/還原反應(yīng)甲基雜質(zhì)進(jìn)行分離，并用核磁氫譜1H-NMR、碳譜13C-NMR，二維核磁相關(guān)譜1H-1HCOSY、HSQC、HMBC以及DEPT135 o對(duì)分離的甲基雜質(zhì)進(jìn)行了結(jié)構(gòu)歸屬解析。

關(guān)鍵詞 黃連素 雜質(zhì) 柱層析 核磁共振二維譜解析

中圖分類號(hào)：O657.61； O623.738 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2024）09-0118-04

引用本文 張祥明， 趙宗敏， 張小金， 等. 黃連素合成中縮合/還原反應(yīng)甲基雜質(zhì)的分離與二維核磁解析[J]. 上海醫(yī)藥， 2024， 45（9）： 118-121.

Isolation and 2D-NMR analysis of methylation impurity formed in the condensation/reduction reaction in the synthesis of berberine

ZHANG Xiangming， ZHAO Zongmin， ZHANG Xiaojin， GU Zhiguo（Jiangxi Fushine Pharmaceutical Co.， Ltd.， Jingdezhen 333000， China）

ABSTRACT Berberine is an important alkaloid with significant antibacterial effects. The methyl impurity in the condensation/reduction reaction during its synthesis was isolated by column chromatography and analyzed by 1H-NMR， 13C-NMR， 1H-1HCOSY， HSQC， HMBC and DEPT135 o.

KEY WORDS berberine； impurity； column chromatography； 2D-NMR analysis

中藥黃連素是一種在我國(guó)應(yīng)用很久的重要生物堿，可從黃連、黃柏、三顆針等植物中提取。黃連素能對(duì)抗病原微生物，對(duì)多種細(xì)菌如痢疾桿菌、結(jié)核桿菌、肺炎球菌、傷寒桿菌及白喉?xiàng)U菌等都有抑制作用，其中對(duì)痢疾桿菌作用最強(qiáng)，常用來(lái)治療細(xì)菌性胃腸炎、痢疾等消化道疾病[1]，且其不良反應(yīng)較小。目前，黃連素生產(chǎn)有提取法[2-3]和化學(xué)合成法[4-5]，大部分的合成路線是以胺（化合物A）和2，3-二甲氧基苯甲醛（化合物B）為起始物料經(jīng)過(guò)縮合得到不分離的亞胺中間體C，再經(jīng)過(guò)還原、后處理成鹽得到胺鹽酸鹽D（圖1），本研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)最終胺鹽酸鹽D中有一個(gè)未知雜質(zhì)生成（后續(xù)經(jīng)過(guò)分析，產(chǎn)生原因可能是起始物料化合物B中殘留的雜質(zhì)甲醛繼續(xù)與產(chǎn)物D發(fā)生還原胺化反應(yīng)產(chǎn)生此甲基雜質(zhì)），此雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)確證對(duì)于產(chǎn)品質(zhì)量的控制具有重要意義。截止目前，未見(jiàn)該雜質(zhì)化合物的核磁結(jié)構(gòu)解析文獻(xiàn)報(bào)道。本研究利用柱層析對(duì)黃連素合成中縮合/還原反應(yīng)的甲基雜質(zhì)進(jìn)行分離，并用核磁氫譜1H-NMR、碳譜13C-NMR，二維核磁相關(guān)譜1H-1HCOSY、HSQC、HMBC以及DEPT135 o對(duì)分離的甲基雜質(zhì)進(jìn)行了歸屬解析。

1 儀器、試劑和實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器與試劑

400 MHz NMR核磁共振儀（Bruker公司）；UTP-313電子天平（上海花潮電器有限公司）；Xevo G2-XS Tof質(zhì)譜儀、E2695液相色譜（Waters公司）。

化合物A（上海柏際醫(yī)藥科技有限公司，98%）；化合物B（上海浙緣化工有限公司，98%）、還原劑雷尼鎳（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，≤150 mm，分散在水中）；片堿、甲苯、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、硅膠（粒徑50～74 mm）（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，溶劑級(jí)別均為分析純）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1H-NMR、13C-NMR、DEPT 135 o、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC均在Bruker公司400 MHz核磁共振波譜儀上測(cè)定。1H-NMR的觀測(cè)頻率為400 MHz，13C-NMR的觀測(cè)頻率為100 MHz。核磁共振實(shí)驗(yàn)采用5 mm直徑核磁管，一維、二維核磁實(shí)驗(yàn)均在控溫下進(jìn)行。

2 甲基雜質(zhì)的分離

參考專利[6]合成胺鹽酸鹽。取蒸干的26 g雜質(zhì)粗品約5 g，加甲醇25 mL溶解，搖勻，加硅膠15 g，攪拌均勻，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，使呈粉末態(tài)，備用。

取玻璃柱（直徑8.5 cm，柱長(zhǎng)110 cm），加入硅膠至約7/10柱體積。加入洗脫液，（正己烷-乙酸乙酯50∶1），至柱子中硅膠呈均一狀。然后，緩慢加入上述粉末，加入洗脫液開(kāi)始過(guò)柱，常壓過(guò)柱，收集洗脫液，液相檢測(cè)。收集含有甲基雜質(zhì)的料液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干可得純度較好的固體0.2 g。經(jīng)HPLC檢測(cè)其純度為98.2%（圖2，保留時(shí)間7.653 min的為甲基雜質(zhì)洗脫峰）；質(zhì)譜檢測(cè)其相對(duì)分子質(zhì)量為330（[M+H]+）（圖3）。

3 甲基雜質(zhì)的核磁共振解析

1H-NMR譜（圖4）中顯示分子中共有多組質(zhì)子信號(hào)，共23個(gè)質(zhì)子。δ4.89的質(zhì)子為溶劑質(zhì)子信號(hào)。13C-NMR（圖5）顯示樣品分子有多組C信號(hào)，分子中共含19個(gè)碳。DEPT135 o譜圖（圖6）顯示有4組仲碳、9組叔碳或伯碳，其余為季碳。依據(jù)HSQC譜圖（圖7）可以確認(rèn)各組碳與氫的連接關(guān)系。1H-NMR譜圖中，δ 2.28（s，3H）為單峰，且為3個(gè)質(zhì)子，根據(jù)甲基的出峰規(guī)律，歸屬為H10，對(duì)應(yīng)的HSQC譜圖（圖7）中δ 41.21歸屬為C10。

根據(jù)DEPT135 o譜圖，可知δ 100.67為仲碳，HSQC中對(duì)應(yīng)的質(zhì)子為δ 5.89（s，2H），根據(jù)氧原子鄰位出峰規(guī)律，可歸屬為C3/H3。結(jié)合1H-NMR譜圖以及DEPT135 o，2.74～2.78（m，2H）為CH2，根據(jù)一般烷基的出峰規(guī)律，可以歸屬為H8，HSQC中對(duì)應(yīng)的碳為δ 32.80。1H-1HCOSY圖（圖8）中2.58～2.63（m，2H）與H8相鄰，歸屬為H9，對(duì)應(yīng)的碳為δ 59.08。根據(jù)DEPT135o譜圖，δ 100.67，δ 32.80，δ 59.08，δ 54.74為仲碳，δ 100.67，δ 32.80，δ 59.08已分別歸屬為C3，C8，C9，因此δ 54.74歸屬為C11，對(duì)應(yīng)的質(zhì)子3.62（s，2H）歸屬為H11。

HMBC（圖9）中，與H11相關(guān)的低場(chǎng)碳有δ131.19，δ 122.71，δ 147.86，根據(jù)DEPT135 o譜圖δ131.19與δ 147.86為季碳，因此δ 122.71，歸屬為C13，對(duì)應(yīng)的質(zhì)子6.92～6.94（m，1H）歸屬為H13。

1H-NMR譜圖中，δ 3.86（s， 3H）與δ 3.79（s，3H）為單峰，且均為3個(gè)質(zhì)子，根據(jù)甲氧基的出峰規(guī)律，歸屬為H18或者H19，對(duì)應(yīng)的碳δ 54.88，δ 59.77歸屬為C18或者C19。HMBC中，季碳δ 147.86與H11和δ3.79（s，3H）有相關(guān)，因此季碳δ 147.86歸屬為C17，而δ 3.79（s，3H）歸屬為H18、3.86（s，3H）歸屬為H19、δ 54.88歸屬為C19、δ 59.77歸屬為C18，δ 152.78歸屬為C16。

HMBC中，H9即2.58～2.63（m，2H）與季碳δ134.03有相關(guān)，因此δ 134.03歸屬為C7。根據(jù)HMBC中苯環(huán)間位強(qiáng)相關(guān)規(guī)律，6.70～6.72（m，1H）歸屬為H5，對(duì)應(yīng)的δ 107.69歸屬為C5。1H-1HCOSY圖中，6.63～6.66（m，1H）歸屬為H6，對(duì)應(yīng)的δ 121.22歸屬為C6。HMBC中，C8與6.68～6.69（d，1H）和H6有相關(guān)，因此6.68～6.69（d，1H）歸屬為H1，對(duì)應(yīng)的108.70歸屬為C1。

HMBC中，δ 152.78即C16與δ 7.02～7.06（m，1H）有強(qiáng)相關(guān)，根據(jù)HMBC中苯環(huán)間位強(qiáng)相關(guān)規(guī)律，δ7.02～7.06（m，1H）歸屬為H14，對(duì)應(yīng)的δ 123.50歸屬為C14；1H-1HCOSY圖中，δ 6.95～6.96（m，1H）歸屬為H15，對(duì)應(yīng)的δ 111.60歸屬為C15。

HMBC中，與H11相關(guān)的低場(chǎng)碳有δ 131.19，C13，C17，因此δ 131.19，歸屬為C12。δ 145.89和δ 147.66與H3有相關(guān)，因此δ 145.89和δ 147.66歸屬為C2或者C4。

至此，甲基雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1、氫譜和碳譜歸屬結(jié)果見(jiàn)表1。

4 討論

本研究采用柱層析制備分離了黃連素合成過(guò)程中縮合/還原反應(yīng)產(chǎn)生的甲基雜質(zhì)并用一維核磁和二維核磁1H-NMR、13C-NMR、DEPT135 o、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC技術(shù)解析了此雜質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)此雜質(zhì)的氫譜和碳譜的全歸屬，后續(xù)可以對(duì)此雜質(zhì)的進(jìn)一步質(zhì)量控制等方面進(jìn)行研究。

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