摘要：目的 探討斑點追蹤技術(shù)在評估達(dá)格列凈改善蒽環(huán)類藥物所致小鼠心臟毒性的可行性。方法 將BALB/c雄性小鼠隨機(jī)分為對照組、表柔比星組和達(dá)格列凈干預(yù)組。達(dá)格列凈在表柔比星用藥前連續(xù)給藥3 d，然后每間隔1 d給藥1次，持續(xù)3周（給予10 mg/kg達(dá)格列凈，灌胃）。表柔比星（3 mg/kg，腹腔注射）或等體積0.9%氯化鈉溶液每4天注射1次，持續(xù)3周。分別于基線、第3周期化療后和最后一周期化療后1 d行常規(guī)超聲心動圖檢查和基于斑點追蹤技術(shù)左心室整體縱向應(yīng)變（global longitudinal strain，GLS）測量。實驗結(jié)束后，通過組織學(xué)分析評估心肌損傷。結(jié)果 與對照組和達(dá)格列凈干預(yù)組比較，表柔比星組表現(xiàn)出明顯的心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常，膠原蛋白含量和心肌細(xì)胞凋亡百分比增高。心臟功能方面，表柔比星組在第3周期注射后GLS顯著降低（P＜0.05），并且隨著累積劑量的增加，GLS持續(xù)下降（P＜0.05）；達(dá)格列凈干預(yù)組GLS只在最后一周期化療結(jié)束后表現(xiàn)為輕微減低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。此外，GLS與心肌病理損傷表現(xiàn)出良好的相關(guān)性，且與膠原蛋白含量相關(guān)性最高（rs=-0.637，P＜0.001）。結(jié)論 達(dá)格列凈干預(yù)治療后可明顯改善化療小鼠的心臟損傷；GLS在評估接受心臟保護(hù)性藥物后的心功能改善方面是可行的。

關(guān)鍵詞：斑點追蹤；達(dá)格列凈；蒽環(huán)類藥物；心臟毒性

DOI：10.3969/j.issn.1674490X.2024.02.001

中圖分類號：R969文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1674490X（2024）02-0001-08

Study on dapagliflozin in improving cardiotoxicity induced by anthracyclines in mice with speckle tracking technique

BI Liangliang1， ZHAO Hongmei2， LI Cheng3， LI Rui4， SHANG Lina1， DI Guixin1， ZHAO Jinhui1

（1.Department of Ultrasound Diagnosis， Affiliated Hospital of Hebei University，" "Baoding 071000， China; 2.Department of Geriatrics， Affiliated Hospital of Hebei University，" Baoding 071000， China; 3.Physical Examination Center， Affiliated Hospital of Hebei University，" "Baoding 071000， China; 4.Department of Obstetrics， Affiliated Hospital of Hebei University， Baoding 071000， China）

Abstract： Objective" To investigate the feasibility of speckle tracking technique in evaluating the improvement of cardiotoxicity induced by anthracyclines with dapagliflozin. Methods Male BALB/c mice were randomly divided into normal control group， epirubicin group and epirubicin plus dapagliflozin group. Dapagliflozin were administered at three consecutive days before epirubicin treatment， followed by once every other day for 3 weeks （10 mg/kg， p.o.）. Epirubicin （3 mg/kg， i.p.） or an equal volume of 0.9% sodium chloride solution were injected every 4 days for 3 weeks. Conventional echocardiography and measurement of left ventricular global longitudinal strain （GLS） based on speckle tracking technique were performed at baseline， one day after the third Epi dosage and one day after the last chemotherapy. Myocardial damage were evaluated by histological analysis at the end of experiment. Results Compared with control group and epirubicin plus dapagliflozin group， epirubicin group showed significant abnormalities in myocardial cell structure， and an increase in collagen content and percentage of myocardial cell apoptosis. In terms of cardiac function， GLS decreased significantly after the third injection in epirubicin group （Plt;0.05）， and GLS continued to decrease with increasing cumulative dose （Plt;0.05）. GLS only showed slight decrease in epirubicin plus dapagliflozin group after the last chemotherapy， but this difference was not statistically significant（Pgt;0.05）. In addition， there was a good correlation between GLS and myocardial pathological damage， with collagen content showing the highest correlation（rs=-0.637，Plt;0.001）. Conclusion Dapagliflozin can significantly improve the heart damage caused by epirubicin in the mouse model. GLS is feasible for evaluating heart function improvement after receiving cardioprotective drugs.

Key words： speckle tracking technique; dapagliflozin; anthracyclines; cardiotoxicity

作為蒽環(huán)類藥物的代表，表柔比星在抗腫瘤治療中應(yīng)用廣泛，但其產(chǎn)生的毒副作用也不容忽視，尤其是心肌損傷在很大程度上制約患者的長期生存［1］。如何合理地治療和預(yù)防腫瘤治療相關(guān)心臟毒性，目前仍缺乏循證醫(yī)學(xué)證據(jù)［2］。當(dāng)前，多數(shù)臨床研究仍著眼于抗心力衰竭的常規(guī)用藥在這些患者中的治療價值，如β受體阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑等［3-5］。研究［6-8］顯示，達(dá)格列凈作為一種新型降糖藥物，在有效控制血糖的同時，還能改善心肌損傷。然而，對于達(dá)格列凈保護(hù)抗腫瘤藥物誘導(dǎo)心功能不全的研究甚少；并且如何客觀地評價其心臟保護(hù)作用也一直存在爭議。本研究采用達(dá)格列凈作為保護(hù)藥物，通過二維斑點追蹤技術(shù)（two dimensional speckle tracking technology， 2D-STE）左心室整體縱向應(yīng)變（global longitudinal strain， GLS）檢測化療小鼠模型心功能改善情況。

1材料與方法

1.1實驗方案

根據(jù)《實驗動物管理與使用指南》飼養(yǎng)小鼠。實驗方案經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院動物護(hù)理和使用委員會批準(zhǔn)（2019MEC050）。

將30只9～11周的BALB/c雄性小鼠（20～25 g）置于恒溫室的鼠籠中，隨時取水和食物。1周后，將小鼠隨機(jī)分為3組：對照組（n=9）、表柔比星組（n=11）和達(dá)格列凈干預(yù)組（n=10）。達(dá)格列凈在表柔比星用藥前連續(xù)給藥3 d，然后每間隔1 d給藥1次，持續(xù)3周（給予10 mg/kg達(dá)格列凈，灌胃）［9］。表柔比星（3 mg/kg，腹腔注射）或等體積0.9%氯化鈉溶液每4天注射1次，持續(xù)3周［10］。在基線、第3周期化療后和最后一周期化療后1 d進(jìn)行超聲心動圖檢查。隨后采集血液樣本，尸檢中提取心、肝、腎等器官行進(jìn)一步分析。

1.2觀察指標(biāo)

1.2.1常規(guī)超聲心動圖指標(biāo)

每組小鼠依次采用3％異氟烷麻醉，并將其仰臥放置在加熱墊上（37 ℃）。通過肢體電極進(jìn)行心電監(jiān)測。檢查過程中，異氟烷的濃度降至1%～2％，以使心電圖顯示恒定且具有可比性的心率［11］。

采用小動物超聲診斷儀（Vevo 2100成像系統(tǒng)，配有MS400超高頻線陣換能器）評估小鼠心臟結(jié)構(gòu)及功能。采集胸骨旁左心室長軸切面后，將探頭旋轉(zhuǎn)90°，以獲取乳頭肌水平短軸切面。M模式用于獲取常規(guī)超聲心動圖參數(shù)：左心室前壁厚度（left ventricular thickness of the anterior wall， LVAW）、左心室后壁厚度（left ventricular thickness of the posterior wall， LVPW）、左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic diameter， LVIDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic diameter， LVIDs）、左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction， LVEF）、左心室短軸縮短率（left ventricular shortening fraction， LVFS）。連續(xù)采集3個心動周期的數(shù)據(jù)，計算平均值。

彩色多普勒用于確認(rèn)二尖瓣口的位置。脈沖多普勒用于測量二尖瓣前向血流頻譜E峰和A峰，計算E/A。

1.2.2斑點追蹤成像

使用VevoStrain軟件（Visual Sonics，加拿大，多倫多）進(jìn)行斑點追蹤脫機(jī)分析。胸骨旁左心室長軸切面，放置多個跟蹤點實現(xiàn)半自動跟蹤小鼠心內(nèi)膜及心外膜邊界，從而獲取GLS［12］。負(fù)值表示心肌纖維在縱向方向上的縮短（圖1）。

1.2.3血液樣本分析

經(jīng)小鼠眼球后靜脈采集血樣，并將其置于涂有EDTA試管中以進(jìn)行血液計數(shù)分析。

1.3組織學(xué)分析

1.3.1形態(tài)學(xué)檢查

將所有小鼠的心臟、肝臟、腎臟切除，洗凈后稱重。心臟固定于福爾馬林液中，石蠟包埋，切片（厚度為5 μm）。組織切片行蘇木精－伊紅染色，光學(xué)顯微鏡評估心肌病變情況。

1.3.2心臟纖維化分析

天狼星紅染色，顯微鏡下觀察小鼠心肌纖維化程度。膠原蛋白含量定義為天狼星紅染色的膠原蛋白纖維占總面積的百分比，可使用計算機(jī)輔助圖像分析系統(tǒng)自動計算得出。

1.3.3心肌細(xì)胞凋亡

使用TUNEL試劑盒判定是否存在心肌細(xì)胞凋亡。此方法可將凋亡細(xì)胞核染成深棕色。顯微鏡下計算TUNEL陽性心肌細(xì)胞的百分比。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)的正態(tài)分布檢驗通過Kolmogorov-Smirnov檢驗證明。接近正態(tài)分布的連續(xù)變量采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。偏度分布數(shù)據(jù)表示為中位數(shù)和四分位數(shù)。數(shù)據(jù)比較采用雙因素重復(fù)測量方差分析。首先判斷組間和時間是否存在交互作用，若二者間無交互作用，則比較處理因素的主效應(yīng)；若二者間存在交互作用，則分析時間和處理因素的單獨效應(yīng)。采用Spearman等級相關(guān)分析，以確定變量與病理改變之間的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1藥物治療的一般毒性

在第4周期和第5周期注射后，表柔比星組有2只小鼠死亡，它們的數(shù)據(jù)被排除在研究結(jié)果之外，其他小鼠均完成了實驗。與對照組和達(dá)格列凈干預(yù)組相比，表柔比星組小鼠的體質(zhì)量降低，見表1；心、肝、腎的器官質(zhì)量減少（圖2A）。然而，只有心臟的器官系數(shù)明顯下降，肝臟和腎臟的器官系數(shù)三組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這表明表柔比星對小鼠心臟的影響相對較大（圖2B）。

2.2血液樣本計數(shù)

與對照組和達(dá)格列凈干預(yù)組相比，表柔比星組小鼠的白細(xì)胞和紅細(xì)胞計數(shù)以及血紅蛋白和血細(xì)胞比容均降低。此外，表柔比星對小鼠血小板計數(shù)的影響更顯著：相對于對照組，表柔比星組小鼠血小板計數(shù)增加了約1.5倍（圖3）。

2.3組織學(xué)發(fā)現(xiàn)

蘇木精－伊紅染色顯示，對照組心臟組織未顯示任何病變跡象；表柔比星組有6只小鼠（67％）表現(xiàn)出心臟病變，如細(xì)胞質(zhì)空泡化和肌原纖維減少；而達(dá)格列凈干預(yù)組僅有2只小鼠（20％）表現(xiàn)出心臟損傷（圖4 A—D）。

天狼星紅染色表明，與對照組相比，表柔比星組動物心臟膠原含量顯著增加［對照組與表柔比星組分別為（2.4±0.7）％和（4.8±1.6）％，Plt;0.01］；而達(dá)格列凈干預(yù)組心肌組織纖維化程度明顯低于表柔比星組（圖4 E—H）。

TUNEL染色結(jié)果顯示，表柔比星組TUNEL陽性心肌細(xì)胞凋亡的百分比大大增加，而達(dá)格列凈干預(yù)組小鼠心肌細(xì)胞凋亡水平明顯降低（圖4 I—L）。

2.4表柔比星對常規(guī)心臟參數(shù)的影響

三組小鼠在基線時的超聲心動圖檢查指標(biāo)之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。實驗過程中LVAW和LVPW始終保持穩(wěn)定；表柔比星組LVIDd顯示微弱增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；LVIDs、LVEF和LVFS均未偏離基線。此外，表征舒張功能的指標(biāo)E/A在整個實驗過程中變化不明顯，見表1。

2.5斑點追蹤超聲心動圖

與對照組比較，表柔比星組在第3周期注射后GLS顯著降低，并且隨著累積劑量的增加，GLS持續(xù)下降。相比之下，達(dá)格列凈干預(yù)組GLS只在最后一周期化療結(jié)束后表現(xiàn)為輕微減低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

2.6心臟毒性評估

相關(guān)分析表明，上述超聲心動圖指標(biāo)中，只有GLS與心肌病理損傷表現(xiàn)良好的相關(guān)性，且與膠原蛋白含量相關(guān)性最高（rs=-0.637，P＜0.001），而其他參數(shù)均與病理結(jié)果無顯著相關(guān)，見表3。

3討論

本研究使用雄性小鼠，旨在排除雌激素對實驗的影響［13］。此外，超聲心動圖檢查過程中采用的是異氟烷吸入式輕度麻醉：不僅操作簡單安全，在檢查過程中，還可通過調(diào)整麻醉劑量獲取小鼠穩(wěn)定且可比的心率，這對成功獲取超聲心動圖參數(shù)至關(guān)重要［14］。本研究表明，在整個實驗過程中，小鼠的心率是穩(wěn)定的，未觀察到異氟烷對小鼠的不良影響。

蒽環(huán)類藥物在抗腫瘤治療中應(yīng)用廣泛，但其誘發(fā)的心臟損害已成為嚴(yán)重影響患者治療和生活質(zhì)量的重要因素。其中，心力衰竭被認(rèn)為是最常見的并發(fā)癥［15］。因此，早期干預(yù)、客觀評估心臟功能具有重要的臨床意義。達(dá)格列凈是一類新型降糖藥物，并且具有改善心肌損傷的作用［8］。有研究［8，16］報道，達(dá)格列凈短期內(nèi)能有效抑制心力衰竭的炎癥反應(yīng)，降低炎癥因子水平，緩解心肌纖維化。本研究中，達(dá)格列凈的干預(yù)成功地降低了表柔比星所誘發(fā)的心肌損傷。達(dá)格列凈干預(yù)組出現(xiàn)心肌細(xì)胞質(zhì)空泡化的發(fā)生率明顯低于表柔比星組；心肌組織纖維化的程度與表柔比星組之間也存在顯著差異；TUNEL染色還證實了達(dá)格列凈對于心肌細(xì)胞凋亡起保護(hù)作用。

超聲心動圖技術(shù)中表征收縮功能的指標(biāo)LVEF在臨床中應(yīng)用廣泛。然而研究［17］表明，利用LVEF評價蒽環(huán)類藥物所致心臟毒性存在一定的局限性，其不能早期發(fā)現(xiàn)心臟損傷，一旦出現(xiàn)LVEF明顯下降，心功能損害往往難以逆轉(zhuǎn)。本實驗中，表柔比星組小鼠的LVEF和LVFS在化療期間和化療結(jié)束后均無明顯變化，與先前的研究結(jié)果一致［9］。舒張功能參數(shù)E/A僅表現(xiàn)出輕微的降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。此外，上述指標(biāo)在表柔比星組和達(dá)格列凈干預(yù)組之間無顯著差異。2D-STE是一種用于評估心臟功能靈敏、無創(chuàng)且可重復(fù)性高的檢查方法［18］。在基于STE的參數(shù)中，GLS的優(yōu)勢最為突出，不僅靈敏性和特異性高，對于心肌損傷還具有良好的預(yù)測價值［19］。本研究中，表柔比星組GLS隨著累積劑量的增加而持續(xù)下降；而達(dá)格列凈干預(yù)組的GLS只在最后一周期化療結(jié)束后表現(xiàn)為輕微減低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在隨后的相關(guān)分析中，GLS與表柔比星組和達(dá)格列凈干預(yù)組小鼠心肌組織的病理改變表現(xiàn)出良好的相關(guān)性，這說明GLS能夠早期發(fā)現(xiàn)接受心臟保護(hù)性藥物后的心功能改善。

綜上所述，達(dá)格列凈干預(yù)治療后可明顯改善化療小鼠的心臟損傷，減少細(xì)胞質(zhì)空泡化，緩解心肌纖維化和凋亡程度，對心臟組織起到一定的保護(hù)作用。此外，基于2D-STE的左心室GLS在評估接受心臟保護(hù)性藥物后的心功能改善方面是可行的。

參考文獻(xiàn)：

［1］CURIGLIANO G， LENIHAN D， FRADLEY M， et al. Management of cardiac disease in cancer patients throughout oncological treatment： ESMO consensus recommendations［J］. Ann Oncol， 2020， 31（2）： 171-190. DOI： 10.1016/j.annonc.2019.10.023.

［2］趙睿，程蕾蕾.超聲斑點追蹤顯像在腫瘤心臟病學(xué)中的應(yīng)用［J］.心血管病學(xué)進(jìn)展， 2018， 39（2）： 138-143. DOI： 10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2018.02.002.

［3］王媚，張楠，徐柳月，等.β受體阻滯劑對蒽環(huán)類藥物所致亞臨床心臟毒性療效的meta分析［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生， 2021， 37（17）： 2937-2942. DOI： 10.3969/j.issn.1009-5519.2021.17.014.

［4］ZHAN T， DANIYAL M， LI J， et al. Preventive use of carvedilol for anthracycline-induced cardiotoxicity： asystematic review and meta-analysis of randomized controlled trials［J］. Herz， 2020， 45（Suppl 1）： 1-14. DOI： 10.1007/s00059-018-4779-y.

［5］MEATTINI I， CURIGLIANO G， TERZIANI F， et al. Safe trial： an ongoing randomized clinical study to assess the role of cardiotoxicity prevention in breast cancer patients treated with anthracyclines with or without trastuzumab［J］. Med Oncol， 2017， 34（5）： 75. DOI： 10.1007/s12032-017-0938-x.

［6］周潔，吳新華，嚴(yán)妍，等.達(dá)格列凈對血糖控制不佳的2型糖尿病伴肥胖患者胰島功能的影響［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報， 2022， 19（33）： 75-78. DOI： 10.20047/j.issn1673-7210.2022.33.16.

［7］高燕，朱慶穎，欒明亞，等.托伐普坦聯(lián)合達(dá)格列凈對心衰大鼠心肌纖維化的影響［J］.山東大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版）， 2022， 60（12）： 13-18， 25. DOI： 10.6040/j.issn.1671-7554.0.2022.0564.

［8］WANG C Q， QIN Y T， ZHANG X J， et al. Effect of dapagliflozin on indicators of myocardial fibrosis and levels of inflammatory factors in heart failure patients［J］. Dis Markers， 2022， 2022： 5834218. DOI： 10.1155/2022/5834218.

［9］張雪嬌，劉潔婷，李魯新，等.達(dá)格列凈對1型糖尿病小鼠心肌損傷的影響及機(jī)制研究［J］.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)， 2023， 28（3）： 257-265. DOI： 10.12092/j.issn.1009-2501.2023.03.003.

［10］OHLIG J， HENNINGER C， ZANDER S， et al. Rac1-mediated cardiac damage causes diastolic dysfunction in a mouse model of subacute doxorubicin-induced cardiotoxicity［J］. Arch Toxicol， 2018， 92（1）： 441-453. DOI： 10.1007/s00204-017-2017-7.

［11］POON Y Y， TSAI C Y， HUANG Y H， et al. Disproportional cardiovascular depressive effects of isoflurane： serendipitous findings from a comprehensive re-visit in mice［J］. Lab Anim， 2021， 50（1）： 26-31. DOI： 10.1038/s41684-020-00684-w.

［12］BEYHOFF N， BRIX S， BETZ I R， et al. Application of speckle-tracking echocardiography in an experimental model of isolated subendocardial damage［J］. J Am Soc Echocardiogr， 2017， 30（12）： 1239-1250.e2. DOI： 10.1016/j.echo.2017.08.006.

［13］YAN H， YANG W B， ZHOU F H， et al. Estrogen protects cardiac function and energy metabolism in dilated cardiomyopathy induced by loss of cardiac IRS1 and IRS2［J］. Circ Heart Fail， 2022， 15（6）： e008758. DOI： 10.1161/CIRCHEARTFAILURE.121.008758.

［14］TOMSITS P， VOLZ L， XIA R B， et al. Medetomidine/midazolam/fentanyl narcosis alters cardiac autonomic tone leading to conduction disorders and arrhythmias in mice［J］. Lab Anim， 2023， 52（4）： 85-92. DOI： 10.1038/s41684-023-01141-0.

［15］TOCCHETTI C G， CADEDDU C， LISI D D， et al. From molecular mechanisms to clinical management of antineoplastic drug-induced cardiovascular toxicity： a translational overview［J］. Antioxid Redox Signal， 2019， 30（18）： 2110-2153. DOI： 10.1089/ars.2016.6930.

［16］BUTT J H， DEWAN P， DEFILIPPIS E M， et al. Effects of dapagliflozin according to the heart failure collaboratory medical therapy score： insights from DAPA-HF［J］. JACC Heart Fail， 2022， 10（8）： 543-555. DOI： 10.1016/j.jchf.2022.03.009.

［17］PLANA J C， GALDERISI M， BARAC A， et al. Expert consensus for multimodality imaging evaluation of adult patients during and after cancer therapy： a report from the American Society of Echocardiography and the European Association of Cardiovascular Imaging［J］. Eur Heart J Cardiovasc Imaging， 2014， 15（10）： 1063-1093. DOI： 10.1093/ehjci/jeu192.

［18］GHERBESI E， BERGAMASCHI L， CUSMANO I， et al. The usefulness of speckle tracking echocardiography in identifying subclinical myocardial dysfunction in young adults recovered from mild COVID-19［J］. Echocardiography， 2022， 39（9）： 1190-1197. DOI： 10.1111/echo.15431.

［19］GMEZ-OCHOA S A， ROJAS L Z， HERNNDEZ-VARGAS J A， et al. Longitudinal speckle tracking strain abnormalities in chagas disease： a systematic review and meta-analysis［J］. J Clin Med， 2022， 11（3）： 769. DOI： 10.3390/jcm11030769.

（責(zé)任編輯：劉俊華）