摘" " 要：為獲得制備益生菌制劑的優(yōu)良菌株，滿足不同階段飼用益生菌的需求，采用簡便有效的飼用益生菌益生特性的指標評價體系，對20株不同來源的益生菌菌種的產(chǎn)酸能力、抑菌效果、溶血性、抗生素敏感性、膽鹽耐受性、耐高溫能力，以及模擬胃液中的存活能力進行比較篩選。結(jié)果表明：7種益生菌的體外益生特性與飼用益生菌的益生作用相一致，其中，枯草芽孢桿菌CICC10089產(chǎn)酸和抑菌效果均較好，ZWRB和干酪-P具有強抑菌能力，SL和ZW具有較弱產(chǎn)酸能力，ZP和NG2具有較強產(chǎn)酸能力。綜上，本試驗研究了飼用益生菌的評價方法，建立了飼用益生菌評價指標，可為后續(xù)飼用益生菌的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：益生菌制劑；枯草芽孢桿菌；抑菌能力；評價方法

中圖分類號：S943" " " " "文獻標識碼：A" " " " DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2024.03.012

The Screening and Effect Evaluation of Probiotics for Breeding

ZHANG Xinqing，ZHANG Xiaoxiao，F(xiàn)U Yingxun，GUO Nannan，GUO Zhongrui，MA Ghunfeng

（Chambroad Chemical Industry Research Institute Company Limited，" Binzhou， Shandong 256500， China）

Abstract： In order to obtain excellent strains for preparation of probiotics and meet the needs of feeding probiotics at different stages， a simple and effective index evaluation system for probiotics was established. Twenty strains of probiotics from different sources were compared and screened in terms of acid production， antibacterial effect， hemolysis， antibiotic sensitivity， bile salt tolerance， high temperature tolerance and survival ability in simulated gastric juices. The results showed that the probiotic properties of 7 kinds of probiotics in vitro were consistent with those of feed probiotics. In which， the Bacillus subtilis CICC10089 showed good acid-producing and bacteriostatic effects， ZWRB and Lactobacillus casei-P had strong antibacterial ability. SL and ZW had weak acid production capacity，" ZP and NG2 had strong acid production capacity. From the experimen， the evaluation methods of feed probiotics and evaluation indicators for feed probiotics wer established， which could provide reference for the subsequent industrial production of feeding probiotics.

Key words： probiotic preparation; Bacillus subtilis; bacteriostasis; evaluation method

隨著人們生活水平的提高，高質(zhì)量的健康食品是大眾的追求與要求，食品質(zhì)量安全備受人們關(guān)注。我國現(xiàn)已全面限制使用抗生素，這對傳統(tǒng)畜牧行業(yè)產(chǎn)生了較大的影響。研究表明，利用益生菌制劑調(diào)整動物腸道菌群平衡可大大減少抗生素的使用。隨著人們對抗生素耐藥性及殘留性等安全問題的重視，益生菌作為一種無毒、無害和無抗藥性的飼料添加劑，受到業(yè)界的推崇與關(guān)注[1-3]。自20世紀80年代以來，人們在益生菌的菌種篩選、菌種抑菌活性、動物腸道菌群平衡、益生菌制劑工業(yè)化應(yīng)用等方面進行了大量研究，目前飼用益生菌已經(jīng)成為抗生素有效的替代產(chǎn)品之一，受到了人們的廣泛關(guān)注[4-8]。經(jīng)過多年研究表明，益生菌在抑制腸道病原微生物的定植、促進腸道健康等方面起到了舉足輕重的作用[9-12]。美國食品與藥物安全管理局和美國飼料管理協(xié)會公布可以飼喂的微生物一共有43種。在我國，農(nóng)業(yè)部2006年第658號公告中允許使用的飼料微生物添加劑一共有16種[13]。常見的為乳酸桿菌屬（Lactobacillus），腸球菌屬（Enterococcus），芽孢桿菌屬（Bacillus）等。目前，世界上研究的功能最強大的飼用益生菌產(chǎn)品主要是以上各類微生物組成的復(fù)合活性益生菌，其廣泛應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)，以及生命健康領(lǐng)域[14-16]。本試驗以20株不同益生菌為材料，比較研究其產(chǎn)酸能力、抑菌效果、溶血性、抗生素敏感性、膽鹽耐受性、耐高溫能力，以及模擬胃液中的存活能力進行比較篩選，篩選出具有良好益生作用的候選菌株，為益生菌制劑的制備提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用培養(yǎng)基[17]" " ①LB培養(yǎng)基（1 L）：氯化鈉10 g、蛋白胨10 g、酵母粉5 g，攪拌至完全溶解后定容至1 000 mL，固體加入1.8%～2%瓊脂粉，121 ℃滅菌20 min。②MRS培養(yǎng)基（1 L）：蛋白陳10 g、牛肉粉5 g、酵母粉4 g、葡萄糖2 g、吐溫80 1 mL、磷酸氫二鉀2 g、乙酸鈉5 g、檸檬酸三銨2 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.05 g，攪拌至完全溶解后定容至1 000 mL，固體加入1.8%～2%瓊脂粉，裝入三角瓶內(nèi)并用紗布封口，121 ℃滅菌20 min。

1.1.2 主要設(shè)備 XSP-BM系列生物顯微鏡；SHP-150型智能生化培養(yǎng)箱；SW-CJ-2F 超凈工作臺；上海旻泉MQD-B3R組合式全溫震蕩培養(yǎng)箱；TG-16WS臺式高速離心機；752紫外可見分光光度計。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化 稱取1 g待分離樣品于100 mL無菌水中，于35 ℃搖床震蕩30 min，按照10-1、10-2、10-3…10-7進行梯度稀釋，選取合適濃度的稀釋液涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，35 ℃燭缸培養(yǎng)1～2 d。觀察產(chǎn)酸菌在固體培養(yǎng)基上的生長情況，根據(jù)產(chǎn)生的透明圈大小、菌落形態(tài)選擇目的菌，盡量選取目的菌周圍無明顯雜菌的單菌落進行劃線，初步得到目的菌；對目的菌進行重復(fù)劃線3～4代，直至獲得純培養(yǎng)物為止。根據(jù)產(chǎn)酸菌的來源不同，進行命名。目前在畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中常用的飼用微生物種類主要有乳酸菌、芽胞桿菌和酵母菌，其中乳酸菌和芽胞桿菌應(yīng)用較廣泛。

1.2.2 飼料用產(chǎn)酸菌的產(chǎn)酸能力評價 將滅菌的液體MRS培養(yǎng)基，分裝于20 mm×200 mm的棉塞試管內(nèi)，每根試管分裝10 mL，用接種針挑取單菌落接種于10 mL MRS液體培養(yǎng)基內(nèi)，置于35 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24 h，待培養(yǎng)液渾濁后，進行pH檢測。

1.2.3 抑菌能力評價 ①平板制備。將融化的固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基在平板底部倒置薄薄的一層，使其恰好覆蓋平板底部，待其凝固后，每個平板以等邊三角形3個頂點位置放置牛津杯，每個平板再倒入15～20 mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待其凝固后，將牛津杯取出備用。

②致病菌涂布。取100 μL甘油管保藏的大腸桿菌、金黃葡萄球菌和沙門氏傷寒，分別加入到10 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、" 170 r·min-1過夜培養(yǎng)；將大腸桿菌、金黃葡萄球菌、沙門氏傷寒稀釋至合適倍數(shù)，取100 μL稀釋液涂布于制備的牛津杯平板上。

③抑菌性試驗。將活化后的待測菌液各取150 μL，分別加入上述涂布致病菌平板的孔內(nèi)，正面向上于35 ℃靜置培養(yǎng)過夜，測量抑菌圈直徑大小，比較菌劑的抑菌能力。

1.2.3 溶血性評價 ①血平板培養(yǎng)基制備。所用血平板為購買的血平板。

②將待測菌株的菌液接種在血平板上，35 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察溶血情況，出現(xiàn)透明溶血環(huán)為溶血表型陽性。

③溶血類型[18-20]。具有溶血能力的細菌在血瓊脂平板上會產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，稱為部分溶血（α溶血）、完全溶血（β溶血）和不溶血（γ溶血）。

α溶血：菌落周圍有1～2 mm寬的草綠色溶血環(huán)，環(huán)內(nèi)紅細胞未溶解，血紅蛋白變成綠色這類鏈球菌亦稱為草綠色鏈球菌，也稱甲型溶血。此類細菌致病力不強，多為條件致病菌。

β溶血：菌落周圍形成一個2～4 mm寬、界限分明、完全透明的無色溶血環(huán)，也稱乙型溶血，因而這類菌亦稱為溶血性鏈球菌。該菌致病力強，常引起人類和動物的多種疾病。

γ溶血：不產(chǎn)生溶血素，菌落周圍無溶血環(huán)，也稱為丙型或不溶血性鏈球菌（Streptococcus non-hemolytics）。該菌無致病性，常存在于乳類和糞便中，偶爾也引起感染。

1.2.4 乳酸含量檢測 乳酸含量檢測選用南京建成乳酸檢測試劑盒完成[18-20]。

1.2.5 乳酸含量檢測 將過夜培養(yǎng)的菌液稀釋至合適倍數(shù)，取100 μL均勻涂布于MRS固體平板上，35 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，待菌液完全吸收后，用鑷子將藥敏紙片均勻鋪在瓊脂上，然后置于生化培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng)48 h，觀察抑菌情況并測量抑菌圈直徑。

本次購買的藥敏紙片為青霉素、氨芐青霉素、頭孢曲松、頭孢拉定、四環(huán)素、強力霉素、紅霉素、諾氟沙星、萬古霉素、氯霉素、環(huán)丙沙星共11種抗生素紙片；

判斷標準：抑菌直徑＞17 nm為抗生素敏感；抑菌直徑＜10 nm為抗生素耐藥；10 nm≤抑菌直徑≤10 nm中間為中界。

1.2.6 膽鹽耐受性試驗 將待測菌株的發(fā)酵液稀釋至OD600為0.25～0.3，便于菌落統(tǒng)計計數(shù)。按1%接種量分別接種于10 mL豬膽鹽濃度為0.2%、0.3%、0.4%、 0.5%、0.6% 的MRS中 ，稀釋100倍后，取100 μL測量初始菌量。35 ℃靜置培養(yǎng)24 h后測定各菌液的菌量，通過判斷不同菌株在不同膽鹽中的存活率，判斷各菌株對膽鹽的耐受能力。

1.2.7 模擬胃腸道生存試驗 在無菌條件下將待測菌液調(diào)節(jié)OD600至0.25～0.3，按1%接種量接種于模擬的人工胃液中，稀釋100倍，取100 μL涂布平板，初始菌量計數(shù)；放置35 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 h，取出后，震蕩均勻，稀釋100倍后，吸取100 μL進行涂布，同時將反應(yīng)體系于10 000 r·min-1離心15 min，去掉上清，加入等量的人工腸液，震蕩均勻后，稀釋100倍，吸取100 μL涂布平板計數(shù)（腸液初始值），放于35 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 h后，平板計數(shù)，計算與0 h菌量對比，計算存活率。

上述配制方法為：①人工胃液。用1 mol·L-1HCl調(diào)節(jié)水的pH值至2.0，加入0.5%NaCl，及按比例胃蛋白酶（1∶3 000），用0.22 μm濾膜過濾滅菌后備用。

②人工腸液。1 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)水pH值至8.0，加入0.5%NaCl，0.3%豬膽鹽，按比例加入胰蛋白酶（1∶300），用0.22 μm濾膜過濾滅菌后備用。

1.2.8 高溫耐受性試驗 將待測菌液調(diào)節(jié)OD600至0.25～0.3，按 1% 接種量分別接種于MRS肉湯中，分別置于50、60、70 ℃水浴鍋中處理 5 min，每隔30 s進行1次渦旋震蕩，使其受熱均勻。設(shè)置不進行高溫處理為對照組，將處理樣品稀釋100倍后，吸取100 μL進行涂布，通過菌量變化，判定各菌株對溫度的耐受性。

存活率=處理后菌量/初始菌量×100%

1.2.9 菌體疏水性試驗 用BATH 方法，將待檢菌株活化，離心（10 000 r·min-1 2 min），棄去上清并用無菌 PBS 沖洗沉淀物 2 次，再重新懸浮于 PBS 中，吸取 200 μL 菌懸液于600 nm處，利用分光光度計測其 OD600值，即為其初始吸光度A0；再取 3 mL 菌懸液加入1 mL二甲苯，室溫培養(yǎng)10 min，利用漩渦震蕩儀混合 2 min，室溫靜止15 min，分層后，吸取下層水相，以無菌 PBS 為空白對照，在 600 nm處測量其最終吸光度 A；最后按下列公式計算益生菌細胞表面疏水性。每個試驗設(shè)3個平行試驗[18-20]。

細胞表面疏水性H=（A0-A）/A0×100%

式中，A0和A分別為與二甲苯混合前、混合后菌液在 600 nm下測得的 A 值。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料用產(chǎn)酸菌的產(chǎn)酸能力評價

由表1、表2可知，2種菌培養(yǎng)24 h后，乳酸桿菌培養(yǎng)液pH值為3.5～4.5，芽孢桿菌培養(yǎng)液pH值為4.0～5.5。

2.2 抑菌能力評價

由表3、圖1可知，SL、ZW、干酪-P、ZWRB、ZP、NG2 6株乳酸桿菌對3種致病菌都有抑制效果，細菌TU3、GF4對3種致病菌均有抑制效果，枯草CICC10089對2種致病菌均有較好地抑制效果。

2.3 溶血性評價

由圖2可知，對前期篩選得到的產(chǎn)酸和抑菌效果較好的菌株進行溶血性評價，培養(yǎng)48 h后，6種乳桿菌（SL、ZW、干酪-P、ZWRB、NG2、ZP）和枯草CICC10089沒有溶血圈，為γ溶血；4種細菌（TU3、KD2、WY2、GF4、）具有溶血圈，為β溶血。因此，后期繼續(xù)對SL、ZW、干酪-P、ZWRB、NG2、ZP和枯草CICC10089進行評價。

2.4 乳酸含量檢測

由表4可知，從檢測結(jié)果來看，SL和干酪-P的產(chǎn)乳酸能力較強，其次為ZW，產(chǎn)乳酸含量也能達到130 mmol·L-1以上。

2.5 抗生素敏感性試驗

選擇現(xiàn)在常用的抗生素種類如青霉素、氨芐西林、頭孢曲松、頭孢他啶、四環(huán)素、強力霉素、紅霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、萬古霉素、氯霉素等共計11種，進行抗生素敏感性試驗，篩選對抗生素較為敏感的菌株。通過表5中各菌株的抑菌直徑數(shù)據(jù)分析，得到表6中不同菌株的敏感效果：枯草CICC10089對11種抗生素均敏感，6株乳桿菌對8種抗生素敏感，耐藥性最少的為SL和ZW，僅對1種抗生素耐藥，ZWRB、干酪-P和NG2對3種抗生素耐藥，ZP對2種抗生素耐藥。具體耐藥效果統(tǒng)計數(shù)據(jù)見表7。

2.6 膽鹽耐受性試驗

由表8可知，在膽鹽濃度高達0.5%時，ZP、ZWRB、NG2仍然能夠生長，說明3株乳酸桿菌的膽鹽耐受性非常好；而SL、干酪-P、ZW能夠耐受0.1%膽鹽濃度，膽鹽濃度提高至0.2%時，菌株無法存活；枯草CICC10089不具有膽鹽耐受性，當膽鹽濃度降低至0.06%時，存活率仍然為0。

2.7 模擬胃腸道生存試驗

由表9可知，從胃液耐受來看，耐受性由高到低排序分別為SL、ZW、ZP、枯草CICC10089、ZWRB。其中，SL的存活率可高達28.46%，其次為ZW，存活率為15.92%，而干酪-P和NG2無胃液耐受性。

從腸液耐受來看，ZP的腸液耐受性最高，4 h存活率能夠達到74.44%，其次為ZWRB，存活率為69.23%，NG2的存活率 為5.41%，而ZW、干酪-P、SL的存活率為0。枯草對腸液的耐受性一般，4 h存活率為14.64%，說明對腸液具有耐受性，但不如ZP、ZWRB的強。綜合胃液耐受性和腸液耐受性，ZP、ZWRB、NG2、枯草CICC10089能夠在小腸內(nèi)存活，而干酪-P、ZW、SL 能夠在胃液中存活。

2.8 高溫耐受性試驗

試驗設(shè)置溫度為50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃。由表10可知，在50 ℃條件下，ZW、ZWRB、SL、干酪-P、NG1的存活率均為100%，ZP和NG2略有降低，存活率仍在50%以上；在60 ℃條件下，耐受性由高到低依次為ZW、NG1、SL、干酪-P、ZP、NG2、ZWRB，且減少后的菌量仍然與初始菌量在同一數(shù)量級，說明以上菌株都可耐受60 ℃的溫度，但ZWRB相對較差?？莶軨ICC10089能夠耐受60 ℃、70 ℃、80 ℃的溫度。

2.9 菌體疏水性試驗

細胞疏水性越強，菌株的粘附性越強。由表11可知，ZP，ZW，ZWRB，NG1菌株疏水性弱，枯草CICC10089疏水性為4.31%，NG2疏水性為6.79%，ZWRB疏水性為18.22%，干酪-P疏水性為37.33%，干酪-P的疏水性最高。

3 討論與結(jié)論

目前畜牧生產(chǎn)中，由于濫用抗生素出現(xiàn)破壞動物胃腸道正常微生物菌群、增加細菌耐藥性等問題，而益生菌制劑則具有無毒害、無污染、無殘留、無副作用等優(yōu)點，成為綠色的動物飼料添加劑與合適的抗生素替代物。但國內(nèi)一些產(chǎn)品由于基礎(chǔ)研究不足，沒有優(yōu)良菌株，功能不明顯，或者產(chǎn)品中的有益微生物未經(jīng)過科學(xué)全面的評價，從而直接影響益生效果的發(fā)揮。因此，益生菌菌株從選育到應(yīng)用是一個復(fù)雜的過程，如何快速有效地篩選安全有效的益生菌成為研究熱點。有研究表明，菌株的抑菌效果和產(chǎn)酸能力是判斷菌株功能的指標，通過體外抑菌評估能夠表明該評估體系運用到飼用益生菌的效果驗證。

本研究采用簡便有效的飼用益生菌益生特性的指標評價體系，通過對20株不同來源的益生菌菌種的產(chǎn)酸能力、抑菌效果、溶血性、抗生素敏感性、膽鹽耐受性、耐高溫能力，以及模擬胃液中的存活能力進行篩選與評價，初步篩選出7種益生菌，分別具備良好的產(chǎn)酸能力、抑菌性、耐受性等體外益生特性，與飼用益生菌的益生作用相一致，可以作為候選菌株在復(fù)配、制劑與動物試驗等方面進一步研究，為益生菌制劑的制備提供基礎(chǔ)。本試驗還研究了飼用益生菌的評價方法，建立了飼用益生菌評價指標，可為后續(xù)飼用益生菌的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。動物微生態(tài)系統(tǒng)是一個復(fù)雜的系統(tǒng)，飼用微生物制劑雖然在動物養(yǎng)殖中的效果得到了廣泛應(yīng)用，但研究深度和廣度仍顯不足，缺乏對益生菌菌株的基礎(chǔ)性研究，尤其是潛在的變異所引發(fā)的安全性和有效性問題，今后應(yīng)加強飼用微生物添加劑量、配伍方法、作用機制、評價與準入等方面的研究，使飼用微生物的應(yīng)用更加廣泛。

參考文獻

[1] 簡志銀， 劉鏡， 張曉可， 等. 生物飼料研究應(yīng)用進展[J]. 貴州畜牧獸醫(yī)， 2021， 45（1）： 4-8.

[2] 宋立立， 劉志偉， 劉曉潔. 微生物發(fā)酵蛋白飼料研究進展[J]. 飼料研究， 2020， 43（9）： 153-156.

[3] 張美娟. 復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料的研制及應(yīng)用[D]. 大連： 大連工業(yè)大學(xué)， 2020.

[4] 孫笑非， 王文娟， 孫冬巖， 等. 益生菌在家禽飼料中應(yīng)用的研究進展[J]. 飼料研究， 2021， 44（4）： 107-110.

[5] 劉政， 高愛琴， 張鐵鷹， 等. 益生菌制劑作為動物飼料添加劑的研究進展[J]. 飼料研究， 2020， 43（8）： 148-151.

[6] 張日俊. 動物微生態(tài)制劑（益生菌）的標準、評價規(guī)程、功能和發(fā)展趨勢[J]. 飼料工業(yè)， 2015， 36（4）： 1-7.

[7] 王蘊， 李克克， 馮利菲， 等. 凝結(jié)芽孢桿菌的作用及其應(yīng)用[J]. 飼料研究， 2020， 43（5）： 139-142.

[8] 嚴濤， 朱建國， 姜甜， 等. 一株凝結(jié)芽孢桿菌的分離篩選及產(chǎn)孢條件優(yōu)化[J]. 微生物學(xué)通報， 2018， 45（2）： 238-249.

[9] 陳祈磊， 胡又佳. 動物微生態(tài)制劑研究應(yīng)用進展[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志， 2009， 21（9）： 857-859.

[10] 譚才鄧， 廖延智， 朱美娟， 等. 一株飼料乳酸菌的選育及特性研究[J]. 飼料與畜牧， 2019（7）： 66-71.

[11] 杜丹， 王斌， 陳丙波， 等. 兩株乳酸桿菌益生菌特性的研究[J]. 氨基酸和生物資源， 2005， 27（1）： 60-64.

[12] 郝生宏， 楊榮芳， 佟建明， 等. 飼用益生菌在研究和應(yīng)用中存在的問題[J]. 中國飼料， 2005（12）： 17-18.

[13] 張璐. 飼用芽孢桿菌產(chǎn)品益生特性的體外評價研究[D]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 2008.

[14] 李健雄， 鄺哲師， 田興山. 動物微生態(tài)制劑的研究與應(yīng)用進展[J]. 廣東畜牧獸醫(yī)科技， 2004， 29（4）： 15-17.

[15] 潘康成， 王振華， 張鈞利， 等. 枯草芽孢桿菌制劑對肉雞生長性能的影響研究[J]. 飼料廣角， 2004（21）： 33-35.

[16] 楊承劍， 黃興國. 微生態(tài)制劑及其在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用[J]. 飼料博覽， 2006（2）： 9-12.

[17] 張心青， 田杰偉， 馬娜娜， 等. 一種高效溶磷解鉀微生物菌劑的篩選及應(yīng)用研究[J]. 天津農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2022， 28（8）： 8-13.

[18] 楊慧潔. 紅甜菜鮮汁榨取工藝的優(yōu)化和紅甜菜鮮汁中甜菜堿的抗疲勞作用研究[D]. 哈爾濱： 東北林業(yè)大學(xué)， 2011.

[19] 付舒倩. 共軛亞油酸與中草藥提取物減肥及緩解體力疲勞功能研究[D]. 濟南： 山東大學(xué)， 2012.

[20] 熊媛媛. 豬源益生腸球菌的分離鑒定和篩選[D]. 武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2010.