張小田 任獻國

基金項目：江蘇省自然科學基金項目（M2020022）

作者單位：南京醫(yī)科大學附屬逸夫醫(yī)院兒科（郵編211112）

作者簡介：張小田（1986），女，主治醫(yī)師，主要從事兒童腎臟疾病方面研究。E-mail：zxt870818@163.com

△通信作者 E-mail：renxianguo@126.com

摘要：目的 探索細胞中TFAP2A對局灶節(jié)段性腎小球硬化（FSGS）相關基因含aarF結構域的激酶4（ADCK4）的轉錄調控機制及TFAP2A與ADCK4是否存在特定的結合區(qū)域。方法 生物信息學分析腎小球硬化基因火山圖，ADCK4及TFAP2A表達水平的關系。JASPAR數據庫預測ADCK4基因轉錄起始位點-464 bp/+206 bp區(qū)域包含TFAP2A轉錄因子結合位點；TFAP2A siRNA濃度分別為5、10、15 μmol/L，TFAP2A過表達質粒質量濃度分別為50、100、300 ?g/L，通過雙螢光素酶報告基因實驗驗證TFAP2A對ADCK4基因啟動子水平的調控作用。TFAP2A siRNA及TFAP2A過表達質粒轉染細胞，實時熒光定量PCR檢測TFAP2A、ADCK4 mRNA表達，蛋白免疫印跡實驗檢測TFAP2A、ADCK4蛋白表達。染色質免疫沉淀試驗驗證TFAP2A與ADCK4啟動子的特定區(qū)域結合。結果 生物信息學分析顯示FSGS腎組織中RNA-Seq RNA表達上調的基因273個，表達下調的基因219個；ADCK4與TFAP2A表達水平呈正相關（P＜0.01）。雙螢光素酶報告基因實驗證明TFAP2A siRNA濃度為10、15 μmol/L的ADCK4啟動子相對螢光素酶活性增強，TFAP2A過表達質粒質量濃度為100、300 ?g/L的ADCK4啟動子螢光素酶活性降低（P＜0.05）。與對照組相比，實驗組ADCK4 mRNA和蛋白表達水平升高；過表達實驗中，與對照組比較，實驗組ADCK4 mRNA和蛋白表達水平降低（P＜0.05）。染色質免疫沉淀試驗發(fā)現(xiàn)TFAP2A能與ADCK4啟動子的特定區(qū)域結合。結論 轉錄因子TFAP2A負向調控ADCK4基因表達，增加了調控足細胞重要基因的轉錄因子成員。

關鍵詞：腎小球硬化癥，局灶節(jié)段性；轉錄因子AP-2；啟動區(qū)，遺傳；轉錄調控；含aarF結構域的激酶4

中圖分類號：R726.92 文獻標志碼：A DOI：10.11958/20231028

Transcriptional regulation of TFAP2A on glomerulosclerosis-related gene ADCK4

ZHANG Xiaotian， REN Xianguo△

Department of Pediatrics， Sir Run Run Hospital， Nanjing Medical University， Nanjing 211112， China

△Corresponding Author E-mail： renxianguo@126.com

Abstract： Objective To exploring the mechanism of transcriptional regulation of TFAP2A on? glomerulosclerosis-related gene aarF structural domain-containing kinase 4 （ADCK4） in cells and the specific binding region between TFAP2A and ADCK4. Methods Bioinformatics was used to analyze volcano map of glomerulosclerosis genes， and the relationship between ADCK4 and TFAP2A expression levels. JASPAR database was used to predict that ADCK4 gene transcription start site -464 bp/+206 bp region containing TFAP2A transcription factor binding site. TFAP2A siRNA concentrations were 5， 10 and 15 μmol/L， and the mass concentrations of TFAP2A overexpression plasmid were 50， 100 and 300 ?g/L， respectively. The regulatory effect of TFAP2A on the promoter level of the ADCK4 gene was verified by dual-luciferase reporter gene assay. TFAP2A siRNA and TFAP2A overexpression plasmid were used to transfect cells. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect TFAP2A and ADCK4 mRNA expression. Protein immunoblotting assay was used to detect TFAP2A and ADCK4 protein expression. Chromatin immunoprecipitation assay was used to confirm TFAP2A binding to a specific region of the ADCK4 promoter. Results Bioinformatics analysis showed that 273 genes were up-regulated and 219 genes were down-regulated. The expression levels of ADCK4 and TFAP2A were positively correlated （P＜0.01）. Dual luciferase reporter gene assay demonstrated that the relative luciferase activity of ADCK4 promoter was enhanced with TFAP2A siRNA concentrations of 10 and 15 μmol/L， and that the luciferase activity of ADCK4 promoter was reduced when TFAP2A overexpression plasmid mass concentrations of 100 and 300 ?g/L （P < 0.05）. ADCK4 mRNA and protein expression levels were increased in the TFAP2A siRNA group compared with the control siRNA group. ADCK4 mRNA and protein expression levels were decreased in the TFAP2A overexpression plasmid group compared with the pENTER plasmid group （P＜0.05）. Chromatin immunoprecipitation assay revealed that TFAP2A can bind to specific regions of? ADCK4 promoter. Conclusion Negative regulation of ADCK4 gene expression by the transcription factor TFAP2A increases the number of transcription factor members that regulate genes important for podocytes.

Key words： glomerulosclerosis， focal segmental; transcription factor AP-2; promoter region， genetic; transcriptional regulation; aarF structural domain-containing kinase 4

局灶節(jié)段性腎小球硬化（FSGS）在腎小球疾病中所占比例逐年上升，在兒童腎小球疾病病理中FSGS占20%［1］。病理類型為FSGS的患者中激素耐藥的比例達36%［2］。FSGS終末期腎病的發(fā)生率約為50%［3］，F(xiàn)SGS是腎功能衰竭的主要原因［4］。目前FSGS的發(fā)病機制尚未完全明確，30%的激素耐藥腎病綜合征患兒是由單基因病引起［5］。目前認為多種足細胞骨架蛋白損傷均可能導致FSGS，例如含aarF結構域的激酶4（ADCK4）、肌動蛋白α4（ACTN4）、瞬態(tài)受體電位陽離子通道C亞家族成員6（TRPC6）及倒轉形成蛋白2（INF2）等，其中ADCK4定位在線粒體和足細胞足突上，與輔酶Q6（COQ6）發(fā)生內源性相互作用［6］。目前嚴重腎病綜合征和快速進展患者的治療方法仍有限［7］。對原發(fā)性FSGS發(fā)病機制的研究仍鮮見，其中基因編輯及轉錄調控機制研究甚少。激活蛋白2（AP-2）轉錄因子于1987年首次從HeLa細胞中純化出來［8］，AP-2轉錄因子蛋白家族包括TFAP2A、TFAP2B、TFAP2C、TFAP2D和TFAP2E。已有研究表明TFAP2A是腎臟發(fā)育過程中腎單位分化的新型分子［9］，其在遠曲小管分化中起到關鍵作用［10］，抑制TFAP2A活性可調節(jié)腎單位節(jié)段發(fā)育［11］，促進細胞凋亡［12］。然而，TFAP2A對FSGS的影響及作用機制研究鮮見。本研究通過探究TFAP2A能否調控ADCK4表達，TFAP2A與ADCK4啟動子是否存在特異性結合區(qū)域，為FSGS的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人胚腎293T細胞系（HEK-293T）、螢光素酶報告基因質粒pGL3-Basic、pTFAP2A質粒及pENTER對照質粒為本實驗室保存；載有ADCK4啟動子-464 bp/+206 bp的pGL3-Basic購自上海捷瑞工程有限公司；實時熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑盒（美國Bimake）；胎牛血清（美國Gibco）；LipofectamineTM3000轉染試劑（美國Invitrogen）；雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒（美國Promega）；總蛋白提取試劑盒（南京凱基生物技術股份有限公司）；GAPDH抗體（美國Proteintech）；Total RNA Kit Ⅰ（美國ABI）；轉染試劑p3000（美國Invitrogen）；TFAP2A siRNA及其對照control siRNA（上海吉瑪制藥技術有限公司）。GAPDH、TFAP2A及ADCK4均為人源基因。兔TFAP2A抗體（美國Abcam），兔ADCK4抗體（美國Affinity公司）。辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（上海碧云天生物技術有限公司）。PVDF膜（美國Schleicher and Schuell Bioscience）。OMEGA plasmid mini kit Ⅰ（美國Omega公司小量質粒提取試劑盒）。PCR熱循環(huán)儀（美國PE，PE-2400型）；熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems，PRISM7500）；伯樂凝膠成像儀（伯樂ChemiDocXRS，美國）。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析 利用生物信息學（Gene Expression Omnibus，GEO）數據庫，在GSE108113高通量數據集中分析FSGS高表達及低表達基因火山圖，Gene Expression Profiling Interactive Analysis（GEPIA）數據庫中分析腎透明細胞癌中ADCK4及TFAP2A表達水平的關系。使用JASPAR數據庫（http：//jaspar2018.genereg.net/）預測ADCK4基因轉錄起始位點上游-464 bp/+206 bp區(qū)域包含TFAP2A轉錄因子結合位點。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及實驗分組 從-70 ℃冰箱中取出凍存的HEK-293T細胞，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，按照1∶3比例傳代。實驗分為對照組和實驗組，siRNA實驗對照組用control siRNA，實驗組用TFAP2A siRNA轉染細胞，檢測螢光素酶活性、mRNA及蛋白質表達情況；過表達對照組用pENTER，過表達實驗組用TFAP2A過表達質粒，檢測螢光素酶活性、mRNA及蛋白質表達情況。siRNA序列見表1。

1.2.3 真核細胞瞬時轉染及雙螢光素酶報告基因實驗 將HEK-293T細胞接種于96孔板中，按LipofectamineTM3000使用說明書進行質粒轉染。TFAP2A siRNA（濃度分別為5、10、15 μmol/L）、對照control siRNA及pGL3-464 bp/+206 bp質粒轉染至HKE-293T細胞中。過表達實驗TFAP2A過表達質粒（質量濃度分別為50、100、300 ?g/L），對照空載過表達質粒pENTER及pGL3-464 bp/+206 bp質粒轉染至HEK-293T細胞中，轉染24 h后多功能酶標儀進行雙螢光素酶報告基因實驗驗證TFAP2A對ADCK4基因啟動子的調控作用。

1.2.4 qRT-PCR檢測細胞中TFAP2A和ADCK4 mRNA的表達 按Total RNA kitⅠ試劑盒說明書提取12孔板中處理過的HEK-293T細胞總RNA，并逆轉錄成cDNA。逆轉錄條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，所得產物4 ℃保存。按照美國Applied Biosystems公司PRISM7500熒光定量PCR說明書配好反應體系（20 ?L）：2×SYBR Green qRCR Master Mix 10 ?L，cDNA 2 ?L，上、下游引物各1 ?L，ROX Reference Dye 0.4 ?L，ddH2O 5.6 ?L。擴增反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 min，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。引物序列見表2。

1.2.5 蛋白免疫印跡實驗（Western blot）檢測TFAP2A和ADCK4蛋白的表達 將1×105個細胞接種至6孔板，貼壁后分別用siRNA或過表達處理細胞48 h后收集細胞，樣本經10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（100 V）恒壓分離，然后按照凝膠面積以0.65 mA/cm2橫流電轉移1.5 h將蛋白自凝膠轉印至PVDF膜，PVDF膜經5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加ADCK4（1∶2 000）、TFAP2A（1∶5 000）和GAPDH抗體（1∶2 000），免疫雜交過夜（12～16 h）；TBST漂洗后加入適量辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（1∶2 000）后封膜，37 ℃搖床2 h；TBST漂洗，伯樂凝膠成像儀曝光，以GAPDH為內參，實驗重復3次。

1.2.6 染色質免疫沉淀（ChIP）擴增含有TFAP2A結合位點的ADCK4啟動子序列 使用EZ-Magna ChIPTM試劑盒（17-10086）進行ChIP檢測，待細胞生長至1×107個，加37%甲醛固定，超聲打斷細胞DNA至DNA片段在200～1 000 bp，用2%瓊脂糖凝膠對10 ?L DNA產物進行電泳，紫外燈下可見大部分DNA片段位于200～1 000 bp，DNA-Protein交聯(lián)，解交聯(lián)DNA-Protein合物，進行DNA純化。PCR反應體系：DNA 2.0 ?L、ddH2O 12.6 ?L、10×PCR Buffer 2.0 ?L、MgCl2（50 mmol/L）0.6 ?L、2.5 mmol/L dNTP 1.6 ?L、Control Primers/ADCK4 ChIP primers 0.8 ?L、Taq（5 U/?L）0.4 ?L、Total Volume 20 ?L，震蕩混合均勻短暫離心。PCR反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性20 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)32次；72 ℃延伸2 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行電泳。用紫外線對電泳后的瓊脂糖凝膠進行拍照。與全染色體為模板的對照（Input）相比，TFAP2A抗體特異性結合DNA，產物條帶亮度略淡，陰性對照則無特異性DNA條帶。引物序列見表2。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad prism 6.0軟件進行數據分析。計量資料以[[x] ±s

]表示，2組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗。線性相關分析采用Pearson法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 生物信息學分析腎小球硬化基因表達火山圖及TFAP2A與ADCK4的關系 GEO數據庫中，GSE108113高通量數據集為FSGS腎組織中RNA-Seq RNA相對表達量的檢測結果，表達上調的基因273個，表達下調的基因219個；GEPIA數據庫分析證明腎透明細胞癌中TFAP2A與ADCK4表達水平呈正相關（r=0.600，P＜0.01），見圖1。

2.2 JASPAR數據庫預測TFAP2A轉錄因子結合位點 JASPAR數據庫預測ADCK4基因轉錄起始位點上游-464 bp/+206 bp區(qū)域包含2個TFAP2A轉錄因子結合位點，第1個結合位點位于-428 bp～-418 bp，第2個結合位點位于-171 bp～-163 bp，見圖2。

2.3 TFAP2A下調ADCK4啟動子活性 雙螢光素酶報告基因實驗結果顯示，與陰性對照相比，含ADCK4基因5'側翼序列的-464 bp/+206 bp區(qū)域螢光素酶報告基因表達載體螢光素酶活性明顯升高（t=14.650，P＜0.01）。siRNA實驗結果顯示，10、15 ?mol/L實驗組的ADCK4啟動子相對螢光素酶活性增強（F=11.420，P＜0.05），5 ?mol/L實驗組的ADCK4啟動子相對螢光素酶活性無明顯改變（P＞0.05），見圖3。過表達實驗結果顯示，100、300 ?g/L實驗組的TFAP2A過表達質粒ADCK4啟動子螢光素酶活性降低（F=4.973，P＜0.05），50 ?g/L實驗組的TFAP2A過表達質粒ADCK4啟動子螢光素酶活性無明顯改變（P＞0.05），見圖4。

2.4 TFAP2A下調ADCK4 mRNA表達 與對照組相比，實驗組TFAP2A mRNA表達水平降低，ADCK4 mRNA表達水平升高（P＜0.05），見圖5。過表達實驗中，與對照組比較，實驗組TFAP2A mRNA表達水平升高，ADCK4 mRNA表達水平降低（P＜0.05），見圖6。

2.5 TFAP2A下調ADCK4蛋白表達 與對照組相比，實驗組TFAP2A蛋白表達水平降低，ADCK4蛋白表達水平升高（P＜0.05）；過表達實驗中，與對照組比較，實驗組TFAP2A蛋白表達水平升高，ADCK4蛋白表達水平降低（P＜0.05），見圖7、表3。

2.6 TFAP2A與ADCK4啟動子區(qū)域直接結合 ChIP實驗結果顯示，用TFAP2A抗體下拉TFAP2A蛋白與細胞核內基因相結合的片段，IgG抗體下拉細胞中蛋白與基因片段時，未發(fā)現(xiàn)非特異性IgG的結合。結果證明TFAP2A可在體內與ADCK4啟動子基因特異性結合，見圖8。

3 討論

FSGS的發(fā)病機制主要集中在原發(fā)性、遺傳性和繼發(fā)性，后者包括適應不良、病毒相關和藥物誘發(fā)的FSGS［7］，針對原發(fā)性FSGS具體發(fā)病機制的研究尚少見。原發(fā)性FSGS患者腎移植后的復發(fā)率仍達30%～80%［13］，但基因治療后極少復發(fā)，且可減少免疫抑制劑的用量及不良反應的發(fā)生［14］。有研究表明，AQP1啟動子變異可影響腹膜中水通道的表達，且對腎功能衰竭患者腹膜透析治療過程中水的運輸產生影響［15］。系統(tǒng)性紅斑狼瘡中自身抗體和干擾素α（IFN-α）可促進環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白α（CREMα）的核易位及其與中性粒細胞中谷胱甘肽過氧化物酶4（Gpx4）啟動子的結合，從而抑制Gpx4表達，誘發(fā)鐵死亡［16］。因此，關于FSGS的啟動子及轉錄調控研究可為疾病治療提供理論基礎。

本課題組前期研究已確定ADCK4核心啟動子區(qū)［17］，通過構建ADCK4啟動子螢光素酶基因報告重組質粒，瞬時轉染、螢光素酶活性檢測，證實構建的ADCK4啟動子具有啟動子活性，提示ADCK4基因的5'側翼序列的-464 bp/+206 bp區(qū)域是一個有功能的啟動子。mRNA轉錄調控通過不同的啟動子活性和5'UTR序列賦予物種特異性的轉錄和翻譯調節(jié)功能［18］。本研究通過JASPAR軟件預測ADCK4啟動子區(qū)含有TFAP2A轉錄因子結合位點，并在啟動子、mRNA和蛋白水平驗證轉錄因子TFAP2A對ADCK4具有負向調控作用；ChIP實驗確定TFAP2A與ADCK4啟動子區(qū)域特異結合。啟動子區(qū)的確定及啟動子的轉錄調控機制是疾病基因治療的基礎，已有文獻報道采用成簇規(guī)則間隔短回文重復序列/相關蛋白9（CRISPR/Cas9）技術糾正啟動子區(qū)的基因變異來治療有關疾病，局部注射由小向導RNA（sgRNA）指引的CRISPR相關蛋白9融合腺嘌呤剪輯編輯器CjABE的腺病毒，可抑制帶有TRET啟動子突變的神經膠質瘤的生長［19］。CRISPR介導的啟動子或增強子激活可挽救由單倍體不足引起的肥胖［20］。本研究證明轉錄因子TFAP2A可以調控足細胞相關基因ADCK4的表達，增加了調控足細胞重要基因的轉錄因子成員。

ADCK4啟動子范圍的確定有利于解釋二代測序基因上游非編碼啟動子區(qū)發(fā)生突變的臨床意義，為生物信息學分析數據集提供了有功能意義的新數據，對于開發(fā)新型靶向基因治療方法具有重要意義。但TFAP2A調控ADCK4表達對鐵死亡、細胞凋亡及細胞焦亡的影響及其機制尚待進一步深入研究。

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（2023-09-19收稿 2024-01-11修回）

（本文編輯 陳麗潔）