初吉燕 田競 付笛語 郭琳 孫蕊 李萍

基金項(xiàng)目：遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2019-MS-350）；聯(lián)勤保障部隊(duì)重點(diǎn)項(xiàng)目（19LBJ1003B）

作者單位：1中國人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院風(fēng)濕免疫科（郵編110001）；2大連醫(yī)科大學(xué)研究生院；3中國人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院骨科

作者簡介：初吉燕（1997），女，碩士在讀，主要從事風(fēng)濕免疫病學(xué)方面研究。E-mail：3490809936@qq.com

△通信作者 E-mail：graceli008@sohu.com

摘要：目的 探討黑素瘤缺乏因子2（AIM2）、胱天蛋白酶-1（Caspase-1）和焦孔素D（GSDMD）在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（AGA）中的表達(dá)及意義。方法 選取30例AGA患者（AGA組）和30例男性健康體檢者（HC組），血細(xì)胞分析儀檢測血清白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、血紅蛋白（Hb）、血小板計(jì)數(shù)（PLT），自動(dòng)生化分析儀檢測空腹血糖（FBG）、血尿酸（UA）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、肌酐清除率（Ccr）、紅細(xì)胞沉降率（ESR）和C-反應(yīng)蛋白（CRP）水平。熒光定量法檢測2組樣本血清雙鏈DNA（dsDNA）水平；Western blot法檢測2組外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）中AIM2、Caspase-1、GSDMD、白細(xì)胞介素（IL）-1β和IL-18蛋白表達(dá)水平；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測血清IL-1β和IL-18表達(dá)水平。結(jié)果 與HC組比較，AGA組WBC、PLT、ESR、CRP、UA、TC、TG、Scr、Ccr水平增加，血清中dsDNA、IL-1β、IL-18相對表達(dá)水平增加，PBMCs中AIM2、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白相對表達(dá)水平均增加（P＜0.05）。PBMCs中，AIM2蛋白的表達(dá)水平與Caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)水平均呈正相關(guān)（r或rs分別為0.965、0.986、0.928及0.737，均P＜0.01）。結(jié)論 AIM2炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡通路相關(guān)分子（AIM2/Caspase-1/GSDMD）在AGA中表達(dá)增高，其可能參與AGA的免疫炎癥反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：關(guān)節(jié)炎，痛風(fēng)性；細(xì)胞焦亡；胱天蛋白酶-1；黑素瘤缺乏因子2；焦孔素D

中圖分類號：R684.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.11958/20231205

Expression and significance of AIM2 inflammasome in patients with acute gouty arthritis

CHU Jiyan1， 2， TIAN Jing3， FU Diyu1， 2， GUO Lin1， SUN Rui1， LI Ping1△

1 Department of Rheumatology， the General Hospital of Northern Theater Command of the Chinese Peoples Liberation Army， Shenyang 110001， China; 2 Graduate School， Dalian Medical University; 3 Department of Orthopedics， the General

Hospital of Northern Theater Command of the Chinese Peoples Liberation Army

△Corresponding Author E-mail： graceli008@sohu.com

Abstract： Objective To investigate the expression and role of melanoma 2 （AIM2）， Caspase-1 and gasdermin D （GSDMD） in the pathogenesis of acute gouty arthritis （AGA）. Methods Clinical data， biochemical indices and blood samples were collected from 30 patients with AGA （the AGA group） and 30 healthy volunteers （the HC group）. Blood cell analyzer was used to detect serum white blood cell count （WBC）， hemoglobin （Hb） and platelet count （PLT）. Automatic biochemical analyzer was used to detect fasting blood glucose （FBG）， blood uric acid （UA）， triacylglycerol （TG）， total cholesterol （TC）， alaine transaminase （ALT）， aspartate transaminase （AST）， serum creatinine （Scr）， blood urea nitrogen （BUN）， creatinine clearance rate （Ccr）， erythrocyte sedimentation rate （ESR） and C-reactive protein （CRP） levels. Fluorescence quantitative assay was used to measure serum level of double-stranded DNA （dsDNA）. Western blot was performed to detect the relative protein expression levels of AIM2， Caspase-1， GSDMD， interleukin-1β （IL-1β） and IL-18 in peripheral blood mononuclear cells （PBMCs）. Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to measure serum levels of IL-1β and IL-18. Results Compared with the HC group， the AGA group showed increased levels of blood biochemical indicators， including WBC， PLT， ESR， CRP， UA， TC， TG， Scr and Ccr （P＜0.05）. The serum levels of dsDNA， IL-1β and IL-18 were also increased in the AGA group. Furthermore， the relative protein expression levels of AIM2， Caspase-1， GSDMD， IL-1β and IL-18 in PBMCs were all increased （P＜0.05）. In PBMCs， the protein expression level of AIM2 was positively correlated with that of Caspase-1， GSDMD， IL-1β and IL-18 （r or rs values were 0.965， 0.986， 0.928 and 0.737， respectively， all P＜0.01）. Conclusion The expression of AIM2 inflammasome-mediated pyroptosis pathway related molecules （AIM2/Caspase-1/GSDMD） is increased in AGA， which may be involved in the immune inflammatory response of AGA.

Key words： arthritis， gouty; pyroptosis; caspase-1; melanoma deficiency factor 2; pyroporosin D

痛風(fēng)已成為全球高發(fā)疾病，并呈現(xiàn)年輕化趨勢［1-2］。急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（acute gout arthritis，AGA）是一種自身炎癥性疾病，其特征是高尿酸血癥和單尿酸鈉（monosodium urate，MSU）晶體在關(guān)節(jié)和組織中沉積，發(fā)作時(shí)關(guān)節(jié)局部會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的紅腫熱痛。如果長期不治療，痛風(fēng)可能會(huì)引發(fā)心血管疾病和腎功能受損［2-3］。目前對AGA的治療缺乏安全有效的藥物，因此有必要深入研究AGA的發(fā)病機(jī)制。細(xì)胞焦亡是一種新型的炎性細(xì)胞死亡形式，其核心是由模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR）、銜接蛋白和胱天蛋白酶-1（Caspase-1）組成的炎癥小體。痛風(fēng)作為一種自身炎癥性疾病，該病患者的機(jī)體可通過內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）和外源性病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）來識(shí)別MSU，從而激活固有免疫細(xì)胞內(nèi)的炎癥小體，參與免疫應(yīng)答［4］。目前，臨床上已發(fā)現(xiàn)了10余種炎癥小體。其中，黑素瘤缺乏因子2（AIM2）炎癥小體屬于PHYIN蛋白家族，它在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中表達(dá)，并參與炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞焦亡。AIM2是細(xì)胞內(nèi)唯一能識(shí)別胞漿雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA）的炎癥小體［4］。研究發(fā)現(xiàn)，AIM2參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）［5］、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）［6］和干燥綜合征［7］等多種自身免疫性疾病的發(fā)病過程。然而，關(guān)于AIM2炎癥小體在AGA方面的作用鮮見報(bào)道。本研究通過檢測AGA患者和健康對照者的外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中AIM2炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡相關(guān)分子以及血清炎性因子白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-18的表達(dá)，探究AIM2炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡途徑在AGA發(fā)病中的作用，為痛風(fēng)治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2022年1月—6月于中國人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院就診的AGA患者（AGA組）30例，均為男性，平均年齡（34.83±11.19）歲，平均體質(zhì)量指數(shù)（BMI）為（28.17±2.93）kg/m2。AGA診斷根據(jù)1977年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)制定的痛風(fēng)分類標(biāo)準(zhǔn)、2015年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)和歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟共同制定的痛風(fēng)分類標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～70歲；入院前1個(gè)月內(nèi)未使用過治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的藥物；精神狀態(tài)良好，能夠理解研究內(nèi)容并接受相應(yīng)處理。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴感染性關(guān)節(jié)炎、創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎、結(jié)締組織病或其他晶體相關(guān)性疾病者；繼發(fā)性痛風(fēng)者；存在心腦血管疾病者；存在出血系統(tǒng)病變或腫瘤者。另選30例男性健康查體者為對照（HC）組，年齡34.50（28.75，46.50）歲。2組年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=1.191，P＞0.05）。本研究已經(jīng)獲得北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)［倫審Y（2021）148］號。

1.2 主要儀器與試劑 Quant-iT? PicoGreen? dsDNA Assay Kit購自美國Invitrogen公司；人外周血淋巴細(xì)胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司；蛋白提取試劑盒購自中國愛必信（上海）生物科技有限公司；IL-1β和IL-18酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測試劑盒購自中國江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司；Anti-AIM2抗體購自中國愛必信（上海）生物科技有限公司；Anti-Caspase-1、Anti-IL-1β、Anti-IL-18抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；Anti-GSDMD抗體購自中國博奧森公司；Anti-GAPDH抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自中國武漢賽維爾生物科技有限公司；一步法PAGE凝膠快速制備試劑盒購自中國上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；BioTek Synergy2多功能酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司；Rayto RT-6100酶標(biāo)分析儀購自美國Rayto公司；NanoDrop 2000分光光度計(jì)、電泳儀購自美國BIO-RAD公司；GE AI 680超靈敏多功能成像儀購自美國Cytiva公司。

1.3 研究方法

1.3.1 血常規(guī)和生化指標(biāo)檢測 收集受試者外周靜脈血8 mL，血細(xì)胞分析儀檢測血清白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、血紅蛋白（Hb）、血小板計(jì)數(shù)（PLT），自動(dòng)生化分析儀檢測空腹血糖（FBG）、血尿酸（UA）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、肌酐清除率（Ccr）、紅細(xì)胞沉降率（ESR）和C-反應(yīng)蛋白（CRP）水平。

1.3.2 熒光定量法檢測血清dsDNA水平 96孔板內(nèi)每孔加入90 ?L TE緩沖液后加入10 ?L血清，每孔再加入100 ?L用TE緩沖液稀釋200倍后的PicoGreen稀釋液，常溫避光孵育10 min，BioTek Synergy2多功能酶標(biāo)儀于激發(fā)光480 nm、發(fā)射光520 nm波長條件下檢測并計(jì)算dsDNA濃度。

1.3.3 Western blot法檢測AIM2、Caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18蛋白相對表達(dá)水平 取外周靜脈血并加入肝素抗凝，于離心機(jī)1 500 r/min離心10 min，用尖頭吸管吸取白膜狀細(xì)胞層，加入聚蔗糖—泛影葡胺分層液，離心棄上清并重復(fù)操作2次，加入RPMI-1640培養(yǎng)液，4 ℃保存?zhèn)溆谩＜尤隬estern/IP裂解液裂解不同組別的PBMCs，BCA定量法進(jìn)行蛋白濃度測定，并以最低蛋白濃度進(jìn)行調(diào)整，根據(jù)蛋白分子質(zhì)量大小選擇6%、10%的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳。分離蛋白質(zhì)后轉(zhuǎn)移到0.45 ?m PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉2 h，用1×TBST洗膜，5 min/次×3次，于4 ℃搖床分別過夜孵育AIM2（1∶500）、Caspase-1（1∶1 000）、GSDMD（1∶500）、IL-1β（1∶1 000）、IL-18（1∶1 000）和GAPDH（1∶2 000）抗體；1×TBST充分洗滌后，用HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體室溫?fù)u床孵育2 h，通過ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，GE AI 680超靈敏多功能成像儀獲取條帶圖像，Image J軟件分析條帶灰度值并計(jì)算相對表達(dá)水平。

1.3.4 ELISA檢測血清炎性因子水平 參照ELISA試劑盒說明書，Rayto RT-6100酶標(biāo)分析儀在450 nm波長處測量受試者外周血血清的光密度（OD）值，計(jì)算IL-1β和IL-18水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0和GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)用[x] ±s表示，2組間比較用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的以M（P25，P75）表示，組間比較用秩和檢驗(yàn)。相關(guān)分析用Pearson或Spearman相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組血常規(guī)和生化指標(biāo)比較 2組Hb、FBG、ALT和AST比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與HC組比較，AGA組WBC、PLT、ESR、CRP、UA、TC、TG、Scr和Ccr水平增加（P＜0.05），見表1。

2.2 2組受試者血清中dsDNA水平比較 AGA組血清dsDNA水平［56.12（50.70，61.83）mg/L］高于HC組［44.09（40.61，48.28）mg/L］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=4.487，P＜0.01）。

2.3 2組PBMCs中相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 與HC組比較，AGA組PBMCs中AIM2、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18的蛋白相對表達(dá)水平均增加（P＜0.01），見圖1、表2。

2.4 2組血清中IL-1β、IL-18表達(dá)水平比較 AGA組血清IL-1β、IL-18水平高于HC組（P＜0.01），見表3。

2.5 AIM2炎癥小體成分之間的相關(guān)性分析 在PBMCs中，AIM2蛋白的表達(dá)水平與Caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)水平均呈正相關(guān)（r或rs分別為0.965、0.986、0.928及0.737，均P＜0.01）。

3 討論

AGA的發(fā)病是一個(gè)復(fù)雜的“代謝-免疫-炎癥”網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)過程，其中不同的炎癥因子相互作用，導(dǎo)致疾病的發(fā)生和發(fā)展［8］。在正常生理情況下，關(guān)節(jié)腔內(nèi)沒有或只有少量中性粒細(xì)胞，AGA時(shí)大量中性粒細(xì)胞被招募到晶體沉積部位。這些中性粒細(xì)胞不僅會(huì)吞噬MSU晶體，還會(huì)釋放IL-1β和IL-18等炎癥介質(zhì)，從而引發(fā)局部急性炎癥反應(yīng)。此外，活化的IL-1β還會(huì)吸引中性粒細(xì)胞釋放大量由DNA、組蛋白和中性粒細(xì)胞顆粒等成分組成的中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）。中小劑量的NETs以核內(nèi)或線粒體內(nèi)DNA為骨架，并負(fù)載水解酶形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這些NETs包裹及消滅MSU晶體，抑制炎癥反應(yīng)，從而緩解痛風(fēng)發(fā)作，但如果NETs過度形成或未能及時(shí)清除，釋放的DAMPs會(huì)刺激固有免疫系統(tǒng)的活化，引發(fā)炎癥反應(yīng)［9］。在痛風(fēng)患者的關(guān)節(jié)滑液中，可以觀察到染色的dsDNA［10］。本研究結(jié)果顯示，AGA組患者血清中dsDNA水平顯著升高。因此，識(shí)別和清除dsDNA片段可能成為AGA研究的新靶點(diǎn)。

當(dāng)AIM2炎癥小體受到dsDNA刺激時(shí)，激活Caspase-1會(huì)生成和釋放IL-1β和IL-18，并通過剪切GSDMD誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡［4，11］。在固有免疫中，輕中度的細(xì)胞焦亡可清除機(jī)體內(nèi)的危險(xiǎn)因子，發(fā)揮保護(hù)作用。然而，高水平的細(xì)胞焦亡會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞過度死亡，從而引起機(jī)體損傷［12］。既往研究發(fā)現(xiàn)，干燥綜合征患者的導(dǎo)管組織中和非腫瘤性導(dǎo)管唾液腺上皮細(xì)胞系的DNase1表達(dá)和活性受損，導(dǎo)致dsDNA降解缺陷，引發(fā)上皮細(xì)胞AIM2的持續(xù)性激活［7］。SLE患者外周血中的dsDNA水平和PBMCs中AIM2 mRNA表達(dá)水平明顯增高，并且其水平與腎臟受累和疾病活動(dòng)度相關(guān)［13］。在小鼠SLE模型中，抑制AIM2的表達(dá)可以顯著減輕SLE癥狀［5］。在RA患者的外周血PBMCs和中性粒細(xì)胞中，AIM2炎癥小體的表達(dá)上調(diào)，并與其下游的靶基因ASC、Caspase-1及病情嚴(yán)重程度相關(guān)［6］。本研究發(fā)現(xiàn)，在AGA患者的PBMCs中，AIM2蛋白的表達(dá)水平明顯增加，提示在AGA的發(fā)生發(fā)展過程中機(jī)體可能會(huì)產(chǎn)生大量dsDNA，從而激活A(yù)IM2的表達(dá)。

Caspase-1是經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑中炎癥小體復(fù)合物的重要組分。當(dāng)它被激活后，不僅會(huì)裂解pro-IL-1β和pro-IL-18，生成成熟的促炎因子IL-1β和IL-18，還會(huì)裂解GSDMD［14］。既往研究表明，在AGA患者的PBMCs和AGA大鼠模型的關(guān)節(jié)滑膜中，Caspase-1蛋白的表達(dá)水平均明顯增加［14］。本研究結(jié)果亦顯示，AGA患者的PBMCs中Caspase-1蛋白水平升高，并且該水平與AIM2蛋白水平呈正相關(guān)，提示Caspase-1的表達(dá)可能與AIM2炎癥小體的激活有關(guān)，共同參與了AGA的發(fā)生過程。

GSDMD是細(xì)胞焦亡的最終效應(yīng)執(zhí)行者。在Caspase-1的作用下，GSDMD-N從GSDMD-C的抑制狀態(tài)中釋放出來，在細(xì)胞膜上形成直徑為10～20 nm的孔道，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外流，水逆滲透壓內(nèi)流，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂和細(xì)胞焦亡發(fā)生［11，15］。本研究結(jié)果顯示，AGA患者GSDMD蛋白的表達(dá)水平顯著增加。既往研究也有類似的結(jié)果，但是其中一些報(bào)道認(rèn)為GSDMD表達(dá)水平增加是由NLR家族的另一個(gè)成員NLRP3炎癥小體介導(dǎo)［8，16-17］。本研究發(fā)現(xiàn)，GSDMD蛋白的表達(dá)水平與AIM2和Caspase-1蛋白的表達(dá)水平均呈正相關(guān)，提示GSDMD可能參與了AIM2炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡。

IL-1β和IL-18是IL-1家族中常見的促炎因子。IL-1β主要由活化的巨噬細(xì)胞分泌，通過與IL-1β受體結(jié)合觸發(fā)下游促炎細(xì)胞因子和趨化因子的級聯(lián)信號，從而招募中性粒細(xì)胞和其他細(xì)胞到晶體沉積處，引發(fā)和加重局部炎癥反應(yīng)。IL-18存在于健康人體血液的單核細(xì)胞以及胃腸道的上皮細(xì)胞中，其分泌主要與Caspase-1有關(guān)，在炎癥和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，痛風(fēng)患者的血清和鼠模型滑膜中尿酸水平與IL-1β及IL-18的水平呈正相關(guān)，而IL-1β阻斷劑可以顯著改善痛風(fēng)癥狀［18-20］。本研究亦發(fā)現(xiàn)，AGA患者的PBMCs血清中IL-1β及IL-18濃度顯著提高，并且PBMCs中AIM2蛋白的表達(dá)水平與IL-1β和IL-18表達(dá)呈正相關(guān)。

綜上，AIM2炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡在AGA發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可能為AGA治療藥物的新靶點(diǎn)。然而，由于本研究樣本量少、單中心以及可能存在選擇偏倚等因素，AIM2炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡通路在AGA中的具體作用仍需要進(jìn)一步探索。

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（2023-08-10收稿 2023-10-30修回）

（本文編輯 陸榮展）