李燕玲,陳淵泉,謝明杰,周倫江,陳秋勇,連春紅,李 健,王隆柏*

(1.福建農(nóng)林大學 福建省獸醫(yī)中藥與動物保健重點實驗室,福建福州 350002;2.福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所/福建省畜禽疫病防治工程技術研究中心,福建福州 350013;3.仙游縣畜牧獸醫(yī)局,福建莆田 351299)

葡萄球菌(Staphylococcus)為革蘭氏陽性菌,無莢膜和芽孢,其對環(huán)境有較強的抵抗力,致病性高,尤其當動物機體的免疫力減弱或皮膚受損時,病原可乘虛而入,產(chǎn)生腸毒素、皮膚壞死毒素、凝固酶等多種毒力因子造成動物感染[1-2]。豬葡萄球菌病是由于豬感染金黃色葡萄球菌或葡萄球菌而引發(fā)的細菌性疾病[3],感染前者會導致豬乳腺炎、乳房膿皰病和壞死性葡萄球菌皮炎[4-5];感染后者的臨床癥狀通常以皮膚疾病為主,育成豬或哺乳母豬感染后病癥較輕[6-7]。仔豬常發(fā)生葡萄球菌感染,以出生5～10 d的仔豬最為常見[8],臨床癥狀為滲出性皮炎[9],故又稱仔豬油皮病[10-11];其他階段的豬也會感染該病。該病發(fā)生無明顯季節(jié)性,呈散發(fā)性,傳染源是帶菌豬,通過接觸傳播,當廄舍內(nèi)細菌達到一定濃度時還可通過空氣傳播[12-13]。葡萄球菌病在豬場已經(jīng)成為一種常發(fā)疾病,病死率較高,若仔豬感染未死,除了出現(xiàn)皮膚癥狀外,還會影響其生長發(fā)育[14]。

在我國飼料端禁抗的背景下,2022年10月,福建某規(guī)?；i場出現(xiàn)了以高溫、顫抖不止和皮膚結痂致脫落、出血為主要癥狀的發(fā)病豬。后經(jīng)實驗室細菌分離,結果分離到1株細菌,通過對該分離菌的生物學特性、致病性以及其耐藥性進行一系列研究,最后鑒定分離菌為致病性葡萄球菌,試驗結果可為該病的防控提供理論參考和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 肝臟、脾臟、淋巴結等組織病料采自福建某規(guī)模豬場的發(fā)病豬只,病料經(jīng)豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒等病原檢測為陰性。

1.1.2 試驗用動物 健康的25日齡仔豬,購自福建福州某規(guī)模豬場。

1.1.3 主要試劑 革蘭氏染液、血瓊脂平板、乳糖、甘露醇、硝酸鹽肉湯等微量生化發(fā)酵管,青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司產(chǎn)品;細菌基因組DNA提取試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品;青霉素、頭孢曲松、四環(huán)素等30種藥敏片,常德比克曼科技有限公司產(chǎn)品;車前草、五味子、艾草等24種中藥,廣東合百草制藥有限公司產(chǎn)品;單寧酸和五信子多酚2種中草藥提取物,西安小草植物科技有限責任公司產(chǎn)品;百毒殺,上海派斯德生化有限公司產(chǎn)品;84消毒液,新潔爾滅,甲酚皂,山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司產(chǎn)品;月芐三甲氯銨,復合酚,成都民生消毒劑有限責任公司產(chǎn)品;戊二醛癸甲溴銨,洛陽享爾生物科技有限公司產(chǎn)品;聚維酮碘,上海全宇生物科技(駐馬店)動物藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 超凈工作臺(DL-CJ-ZNDI),北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司產(chǎn)品;全溫培養(yǎng)搖床(QYC-200),上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司產(chǎn)品;培養(yǎng)箱(9080),上海精宏實驗設備有限公司產(chǎn)品;梯度PCR儀(TaKaRa TP600國產(chǎn)),北京寶日醫(yī)生物技術有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化 將病料用一次性接種環(huán)劃線接種于血瓊脂平板上,置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24～48 h,挑取單個完整的菌落進行純化培養(yǎng)后,革蘭氏染色鏡檢。

1.2.2 生化試驗 將純化好的菌落分別按照說明書的方法和步驟接種于乳糖、甘露醇、硝酸鹽肉湯等17種微量生化發(fā)酵管中,置37℃培養(yǎng)18～48 h后觀察結果。

1.2.3 PCR鑒定 按照文獻[15]進行。細菌基因組DNA提取按照試劑盒操作說明進行,根據(jù)豬葡萄球菌16SrRNA基因序列設計引物,擴增片段長度995 bp,PCR擴增產(chǎn)物送至鉑尚生物技術(上海)有限公司測序。反應體系(25 μL):Master Mix 2X 12.5 μL,H2O 7.5 μL,上、下游引物各1 μL,模板3 μL。PCR反應程序:94℃ 5 min;94℃ 40 s,54℃ 40 s,72℃ 40 s,35個循環(huán);72℃延伸10 min。測序結果進行Blast比對,用MegAlign、MEGA軟件進行同源性分析。

1.2.4 藥敏試驗 對分離到的細菌進行藥物敏感性試驗。藥物敏感性判定標準為:抑菌圈直徑≥15 mm為+++,表明細菌對該藥物高度敏感;10 mm≤抑菌圈直徑<15 mm為++,表明細菌對該藥物中度敏感;0 mm<抑菌圈直徑<10 mm為+,表明細菌對該藥物低度敏感;抑菌圈直徑=0 mm為-,表明細菌對該藥物不敏感或耐藥。

1.2.4.1 西藥藥敏試驗 將純化菌落均勻涂布于血瓊脂平板表面,選取青霉素、慶大霉素、四環(huán)素等30種西藥藥敏片貼到已涂布好細菌的平板表面,一個平板貼6種藥敏片,于37℃培養(yǎng)18 h后,觀察測量抑菌圈的大小。

1.2.4.2 中藥藥敏試驗 中藥藥敏片的制備:26種中草藥各取50 g加蒸餾水250～500 mL室溫浸泡1 h后煎沸,沸后文火煎煮至50 mL左右后倒出,再加250～500 mL蒸餾水熬煮至大約50 mL后倒出,合并兩次所得濾液再次熬煮濃縮至50 mL后,裝入已煮沸消毒過的瓶中,于4℃冰箱中保存?zhèn)溆肹16-17]。將空白藥敏紙片分別浸泡于藥液中,保證每片藥敏片均浸泡于藥液中,期間不時翻動藥敏片,浸泡約2 h后,置烘箱烘干,期間反復翻轉藥敏片,烘好后裝入已消毒的瓶中,于4℃冰箱中保存?zhèn)溆肹18]。

將純化好的菌落均勻涂布于血瓊脂平板表面,選取車前草、五味子和單寧酸等26種中藥藥敏片貼到已經(jīng)涂布好細菌的平板表面,一個平板貼6種藥敏片,于37℃培養(yǎng)18 h后,觀察測量抑菌圈的大小。

1.2.5 消毒劑消殺試驗

1.2.5.1 菌液的制備 挑取純化好后的單菌落于TSB溶液中,在220 r/min、37℃恒溫振蕩培養(yǎng)16～24 h即制得菌懸液,再用麥氏比濁管計算出菌液濃度,最后調(diào)整其濃度為108CFU/mL。

1.2.5.2 消毒劑消殺試驗 百毒殺按照1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶5 000、1∶10 000稀釋;84消毒液按照1∶200、1∶300、1∶400、1∶500、1∶1 000稀釋;月芐三甲氯銨按1∶20、1∶30、1∶100、1∶150、1∶300稀釋;復合酚按1∶30、1∶60、1∶90、1∶300、1∶600稀釋;戊二醛癸甲溴銨按1∶500、1∶1 000、1∶1 500、1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000稀釋;聚維酮碘按1∶10、1∶20、1∶100、1∶200、1∶1 000稀釋。以上6種消毒液稀釋后與菌液以9∶1混勻作用20 min;新潔爾滅按照1∶10、1∶15、1∶30、1∶50稀釋后與菌液以9∶1混勻作用2～3 min;甲酚皂按照1∶2、1∶3、1∶5、1∶10、1∶20,1∶30稀釋后與菌液以9∶1混勻作用30 min。作用結束后用劃線法接種在平板上,于37℃培養(yǎng)18 h后,觀察菌落生長情況。

1.2.6 耐藥基因檢測 參照文獻[19]合成引物(cfr、tetM、floR、mcr-1、blaNDM-1、optrA)見表1,細菌基因組DNA提取步驟及擴增程序同1.2.3。擴增產(chǎn)物使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

表1 葡萄球菌耐藥基因引物序列

1.2.7 動物攻毒試驗 將10頭25日齡的仔豬按照每組5頭隨機分成2組,分別為試驗組和對照組,試驗組以菌液濃度2×107CFU/mL進行頸部肌肉注射1 mL,對照組注射同等劑量的生理鹽水,觀察攻毒后96h內(nèi)仔豬的臨床癥狀并記錄仔豬體溫、精神狀態(tài)和采食情況等。

2 結果

2.1 病原菌的分離純化結果

從病料分離到1株細菌(圖1A),分離純化后在血瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到單個呈圓形、中等大小、直徑為0.8～1.0 μm的菌落,不透明,呈乳白色到金黃色之間。經(jīng)革蘭氏染色后呈藍紫色,顯微鏡下觀察為葡萄串樣排列的球形菌體(圖1B)。

A.血瓊脂培養(yǎng)基菌落形態(tài);B.革蘭氏染色鏡檢結果(10×100)

2.2 生化試驗結果

經(jīng)17項生化試驗發(fā)現(xiàn)該分離菌可分解麥芽糖、果糖、葡萄糖、蔗糖,不能分解乳糖和甘露醇,硝酸鹽肉湯、明膠、淀粉水解、MR、尿素酶、過氧化氫酶反應為陽性,硫化氫、蛋白胨、西蒙氏枸櫞酸鹽、VP、氧化酶試紙反應為陰性。結果與葡萄球菌的生化特征一致。部分結果見圖2。

A.尿素酶陽性;B.葡萄糖陽性;C.西蒙氏枸櫞酸鹽陰性;D.乳糖發(fā)酵陰性

2.3 PCR鑒定結果

分離菌PCR擴增結果如圖3所示,獲得大約970 bp大小的目的條帶。用MegAlign軟件進行同源性分析結果如圖4所示,該分離株與8株葡萄球菌屬同源性在98.9%～99.3%之間,由MEGA軟件構建的系統(tǒng)進化樹如圖5,表明該分離株與葡萄球菌在同一大分支上,與MW341442最為相似。綜上可進一步說明該分離菌株為葡萄球菌。

1.被檢樣本;2、3.陽性對照;4.陰性對照;M.DNA標準DL 2 000

圖4 分離菌同源性分析結果

圖5 分離菌株系統(tǒng)進化樹的構建

2.4 藥敏試驗

2.4.1 西藥藥敏試驗結果 由表2可見,該葡萄球菌對苯唑西林、6種頭孢類藥物、米諾環(huán)素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氯霉素、左氧氟沙星、亞胺培南和強力霉素等14種藥物高度敏感,對阿米卡星、慶大霉素、四環(huán)素、萬古霉素和氟苯尼考等5種藥物中度敏感,但對其他11種藥物表現(xiàn)出一定的耐藥性。

表2 藥敏試驗結果

2.4.2 中藥藥敏試驗結果 該菌對單寧酸高度敏感,對五味子、五信子多酚中度敏感,對葉下珠、厚樸、虎杖低度敏感,對半邊蓮、鐵莧菜、三葉草、魚腥草、使君子、桔梗、辛夷、穿心蓮、姜黃、枳殼、蒲公英、車前草、艾葉、重樓、澤瀉、黃精、鐵莧菜粉、博落回散、抗毒先鋒(VA、VE、Vk3、VB6、VB12、生物活性物)等20種中藥不敏感。

2.5 消毒劑消殺試驗結果

84消毒液對該菌的消殺效果差,在1∶200～1∶1 000稀釋濃度內(nèi)均無消殺效果;甲酚皂在1∶2和1∶3稀釋濃度對該菌有消殺效果,1∶5～1∶30稀釋濃度對該菌無消殺效果;聚維酮碘在1∶10和1∶20稀釋濃度對該菌有消殺效果,1∶100～1∶1 000稀釋濃度對該菌無消殺效果;百毒殺在1∶10 000稀釋濃度對該菌無消殺效果,在1∶500～1∶5 000稀釋濃度對該菌均有消殺效果;戊二醛癸甲溴銨在1∶500～1∶2 000稀釋濃度對該菌有良好消殺效果,在1∶3 000和1∶4 000稀釋濃度對該菌無消殺效果;新潔爾滅在1∶10～1∶50稀釋、月芐三甲氯銨在1∶20～1∶300稀釋、復合酚在1∶30～1∶600稀釋濃度對該菌都有消殺效果。

2.6 耐藥基因檢測結果

耐藥基因檢測結果為陰性,說明分離菌株不攜帶cfr、tetM、floR、mcr-1、blaNDM-1和optrA耐藥基因。

2.7 動物攻毒試驗結果

2.7.1 臨床癥狀 攻毒后24 h,葡萄球菌攻毒組全部仔豬體溫升高,均在40.5℃左右,出現(xiàn)精神萎靡、食欲減退,個別嘔吐,1頭死亡;攻毒后72 h,葡萄球菌攻毒組有2頭仔豬出現(xiàn)全身結痂、滲出性皮炎、體溫升高的現(xiàn)象;攻毒后96 h,葡萄球菌攻毒組仔豬體溫回歸正常,但都出現(xiàn)有皮膚結痂現(xiàn)象。對照組仔豬的精神狀態(tài)及采食情況都正常,也未出現(xiàn)結痂現(xiàn)象。試驗表明分離葡萄球菌對仔豬具有致病性。

2.7.2 病理切片結果 由結果可得,發(fā)病仔豬的脾臟可見白髓、紅髓和小梁結構,其中紅髓區(qū)域可見輕度至中度淤血,間質(zhì)見中量急性炎癥細胞(圖6B),對照組正常(圖6A);發(fā)病仔豬的肺臟包括各級支氣管、肺泡等結構,肺泡上皮輕度增生,肺泡間隔增寬,肺泡腔內(nèi)見紅細胞滲出及少量粉染的滲出物(圖6D),對照組正常(圖6C)。

A.脾臟對照組;B.脾臟攻毒組;C.肺臟對照組;D.肺臟攻毒組

3 討論

2021年7月1日開始,我國在養(yǎng)殖飼料端全面禁止添加抗生素,給畜禽養(yǎng)殖防控細菌病的發(fā)生增加了難度。本研究從疑似發(fā)生仔豬滲出性皮炎的仔豬中分離到1株細菌,通過對分離菌株進行的細菌形態(tài)結構、菌落特征、革蘭氏染色鏡檢、生化試驗、PCR鑒定、動物攻毒試驗臨床特征等試驗結果,分離的細菌為葡萄球菌,且能導致仔豬發(fā)病死亡,對仔豬具有高致病性。通過中、西藥兩類藥敏試驗顯示,該菌對30種臨床常用抗生素中的頭孢類、諾氟沙星、亞胺培南、氯霉素等14種藥物高度敏感,對四環(huán)素、萬古霉素、阿米卡星等5種藥物呈現(xiàn)中度敏感,對其他11種藥物表現(xiàn)為一定的耐藥性,不存在cfr、tetM、floR、mcr-1、blaNDM-1、optrA等6種耐藥基因。根據(jù)26種中藥藥敏試驗結果顯示,該菌對單寧酸高度敏感,對五味子、五信子多酚中度敏感,對葉下珠、厚樸、虎杖低度敏感,對其余20種中藥不敏感。本試驗發(fā)病豬場采用研究藥敏結果進行緊急防控,7 d后疫情得到很好的控制,獲得良好的防治效果。鑒此,對于如何有效防治該病的發(fā)生,筆者認為,一是在豬群疫病防控的管理過程中,要堅持“以預防為主,治療為輔”的原則,對發(fā)病豬群要做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、快治療;二是加強豬群的飼養(yǎng)管理措施,包括對豬舍溫度、濕度和通風的管理,以提高豬群的免疫功能;三是要強化生物安全防控措,做好“人、車、豬、物、料”的消毒管控工作,切斷病原傳播途徑,降低養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟損失。本研究結果可為今后生豬養(yǎng)殖場在臨床上防治豬葡萄球菌病提供理論依據(jù)和技術支撐。