王 芳 李建婷 謝 秋 張 霆

神經(jīng)管畸形(neural tube defects, NTDs) 是由于胚胎發(fā)育過程中神經(jīng)管閉合不全引起的出生缺陷,主要表現(xiàn)為無腦兒、脊柱裂及腦膨出。NTDs發(fā)生率高,后果嚴(yán)重。流行病學(xué)研究表明,母親在孕期和圍孕期補(bǔ)充葉酸可以降低后代患NTDs的風(fēng)險(xiǎn)[1,2]。實(shí)驗(yàn)研究證明,葉酸缺乏可通過影響胚胎表觀遺傳修飾的改變導(dǎo)致NTDs的發(fā)生,然而機(jī)制還不完全清楚[3,4]。小鼠的神經(jīng)管閉合過程在細(xì)胞、組織、基因及代謝水平上與人類相似,是被用于研究NTDs的最廣泛的模式動物。本研究擬在前期建立的低葉酸聯(lián)合甲氨喋呤誘導(dǎo)NTDs小鼠模型的基礎(chǔ)上,檢測小鼠胚胎神經(jīng)發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期(受孕9.5天)腦組織和脊髓組織基因的表達(dá)變化,分析尋找差異表達(dá)基因及可能影響神經(jīng)發(fā)育的差異轉(zhuǎn)錄因子基因,為進(jìn)一步闡明葉酸預(yù)防NTDs的機(jī)制提供理論依據(jù)[5]。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料:采用物體特定病原體(SPF)級、6～8周齡的健康雌性ICR小鼠(體質(zhì)量為18～22g)及健康雄性ICR小鼠(體質(zhì)量為20～22g),均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。低葉酸飼料及正常飼料購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司,甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)購自美國Sigma公司,0.9%氯化鈉溶液購自中國大冢制藥有限公司,磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution,PBS)購自美國Gibco公司,RNA文庫制備試劑盒(TruSeq RNA sample Preparation kit V2)購自美國Illumina生物技術(shù)公司,核酸片段篩選試劑盒(Agencourt SPRIselect Reagent Kit)和核酸純化試劑盒(Agencourt AMPure XP)購自美國Beckman Coulter公司,反轉(zhuǎn)錄酶(SuperScriptⅣ)購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

2.NTDs胎鼠模型制備:將雌性小鼠分為正常飼喂組(對照組)與低葉酸聯(lián)合MTX誘導(dǎo)NTDs組(低葉酸聯(lián)合MTX實(shí)驗(yàn)組),對照組的雌性小鼠及全部雄性小鼠均提供正常繁殖飼料喂養(yǎng),低葉酸聯(lián)合MTX實(shí)驗(yàn)組小鼠采用特制低葉酸飼料。小鼠喂養(yǎng)4周后,按雌雄比例2∶1交配過夜,于次日8:00時(shí)觀察到陰道栓,指定為受孕0.5天;受孕7.5天時(shí)以1.5mg/kg用量對低葉酸聯(lián)合MTX實(shí)驗(yàn)組雌性小鼠腹腔注射MTX,對照組雌性小鼠使用等劑量0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行腹腔注射;至受孕9.5天,對妊娠小鼠實(shí)施頸椎脫白處死,取出胎鼠,詳細(xì)NTDs胎鼠模型建立方法參考課題組既往報(bào)道[5]。

3.組織樣本收集:取出胎鼠后置于預(yù)冷的PBS中,其中對照組選取發(fā)育正常胎鼠,低葉酸聯(lián)合MTX實(shí)驗(yàn)組選取NTDs表型明顯的胎鼠,解剖其神經(jīng)組織,自前腦嘴端至后腦微端,盡可能地分離中胚層或非神經(jīng)組織,胎腦、脊髓組織分別收集于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

4.總RNA提取:采用TRIzol法提取總RNA,用DnaseⅠ消化DNA,瓊脂糖凝膠電泳檢測和Agilent 2100檢測RNA完整度;Nanodrop檢測RNA的濃度和純度。瓊脂糖凝膠電泳圖3條rRNA帶清晰可見,RNA完整性RIN≥6.5,RNA濃度≥100ng/μl,總量≥2μg,A260/A280為1.8～2.2。則RNA質(zhì)量滿足建庫要求。提取的RNA于-80℃凍存,用于后續(xù)文庫制備和測序。

圖1 對照組和低葉酸聯(lián)合MTX實(shí)驗(yàn)組受孕9.5天胎鼠外觀

圖2 低葉酸聯(lián)合MTX實(shí)驗(yàn)組NTDs胎鼠腦組織DEGs

圖3 低葉酸聯(lián)合MTX實(shí)驗(yàn)組NTDs胎鼠脊髓組織差異表達(dá)基因

5.文庫制備與測序:文庫制備以及測序由安諾優(yōu)達(dá)基因科技(北京)有限公司完成。cDNA文庫的構(gòu)建方法參照美國Illumina生物技術(shù)公司的樣品制備試劑盒說明書,文庫構(gòu)建完成后使用Qubit3.0和Agilent 2100分別檢測文庫濃度與文庫片段長度。濃度>5ng/μl,且片段長度集中為300～400bp,為庫檢合格。利用Illumina HiSeq2500平臺,以2×150bp雙端測序模式進(jìn)行高通量測序,并使用TrimGalore法對原始測序數(shù)據(jù)過濾,得到高質(zhì)量的Clean Data。使用HISAT2軟件將過濾和質(zhì)量控制后的序列和參考基因組進(jìn)行比對,利用FPKM(Fragments per Kilobase per Million Mapped Fragments)方法對已知的基因和轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行表達(dá)定量。

6.差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs)分析:采用DESeq軟件分析低葉酸聯(lián)合MTX實(shí)驗(yàn)組與對照組的差異表達(dá)基因。Type為篩選結(jié)果,滿足P<0.05且|log2(fold change)|>1的為差異基因。其中l(wèi)og2(fold change) >1標(biāo)記為上調(diào)基因(up);log2(fold change)<-1標(biāo)記為下調(diào)基因(down),不滿足上述條件的為非顯著差異表達(dá)基因。

7.差異表達(dá)基因的GO (gene ontology)分析:基于篩選出的DEGs,采用R包 cluster Profiler對差異表達(dá)基因進(jìn)行基因功能分類分析,來全面描述生物體中基因和基因產(chǎn)物的屬性。GO是國際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能分類體系,GO總共有3類,分別描述基因的生物學(xué)過程(biological process, BP)、細(xì)胞組分(cellular component, CC)、分子功能(molecular function, MF)。本研究按照此3類對差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選。

8.差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因分析:轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor,TF)是一群能與基因5′-端上游特定序列專一性結(jié)合,從而保證目的基因以特定的強(qiáng)度在特定的時(shí)間與空間表達(dá)的蛋白質(zhì)分子。選取篩選出的DEGs,通過與動物物種AnimalTFDB(Animal Transcription Factor DataBase)比較,預(yù)測DEGs是否是差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因,以及所屬的轉(zhuǎn)錄因子家族。

9.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.低葉酸聯(lián)合MTX誘導(dǎo)小鼠NTDs模型構(gòu)建情況:通過對適齡母鼠喂養(yǎng)低葉酸飼料,并在受孕7.5天時(shí)對母鼠進(jìn)行腹腔注射MTX,可成功誘導(dǎo)出具有明顯NTDs表型的胎鼠。受孕9.5天取出胎鼠,通過體式顯微鏡觀察可見:對照組胎鼠外觀上較為飽滿圓潤,各腦室發(fā)育良好,神經(jīng)管已完全閉合;低葉酸聯(lián)合MTX實(shí)驗(yàn)組表現(xiàn)出脊柱裂、腦裂等,提示NTDs的表型,詳見圖1。

2.低葉酸聯(lián)合MTX實(shí)驗(yàn)組NTDs胎鼠的腦組織基因表達(dá)分析:對低葉酸聯(lián)合MTX實(shí)驗(yàn)組和對照組的胎鼠腦組織轉(zhuǎn)錄組分別進(jìn)行測序、分析,使用DESeq軟件確定DEGs。結(jié)果顯示,低葉酸聯(lián)合MTX實(shí)驗(yàn)組與對照組比較,共有939個(gè)DEGs,其中406個(gè)顯著上調(diào),533個(gè)顯著下調(diào),P<0.05,DEGs火山圖詳見圖2A。

從BP、CC和MF 3類對差異表達(dá)的上調(diào)和下調(diào)基因進(jìn)行篩選、分析,結(jié)果顯示按CC分類,上調(diào)的基因主要是細(xì)胞、細(xì)胞器及蛋白復(fù)合物的基因,下調(diào)的基因主要是細(xì)胞、細(xì)胞器及細(xì)胞膜的基因,下調(diào)的基因和上調(diào)的基因在該分類基本一致;按BP分類,上調(diào)的基因主要是細(xì)胞過程、生物調(diào)節(jié)、發(fā)育過程及代謝過程的基因,下調(diào)的基因和上調(diào)的基因在該分類基本一致;按MF分類,上調(diào)的基因主要是蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性、分子功能調(diào)節(jié)因子及催化活性的基因,下調(diào)的基因和上調(diào)的基因在該分類一致,詳見圖2B。

差異轉(zhuǎn)錄因子分析顯示,篩選出的DEGs,通過與Animal TFDB數(shù)據(jù)庫比較,預(yù)測腦組織中有191個(gè)基因?qū)儆诓町惐磉_(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因,其中104個(gè)顯著上調(diào),87個(gè)顯著下調(diào),P<0.05,通過與蛋白家族比對,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子主要聚焦在Homeobox、zf-C2H2、bHLH、STAT等家族,結(jié)果詳見圖2C。

3.低葉酸聯(lián)合MTX實(shí)驗(yàn)組NTDs胎鼠的脊髓組織基因表達(dá)分析:對低葉酸聯(lián)合MTX實(shí)驗(yàn)組和對照組的胎鼠脊髓組織轉(zhuǎn)錄組分別進(jìn)行測序、分析,使用DESeq軟件確定DEGs。結(jié)果顯示,低葉酸聯(lián)合MTX實(shí)驗(yàn)組與對照組比較,共有879個(gè)DEGs,其中268個(gè)顯著上調(diào),611個(gè)顯著下調(diào),P<0.05,DEGs火山圖詳見圖3A。

從BP、CC和MF3類對差異表達(dá)的上調(diào)和下調(diào)基因進(jìn)行篩選、分析,結(jié)果顯示按CC分類,上調(diào)和下調(diào)的基因主要是細(xì)胞、細(xì)胞器及蛋白復(fù)合物等的基因;按BP分類,上調(diào)和下調(diào)的基因主要是細(xì)胞過程、生物調(diào)節(jié)及發(fā)育過程的基因;按MF分類,上調(diào)和下調(diào)的基因主要是蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性、分子功能調(diào)節(jié)因子及催化活性的基因。脊髓組織DEGs與腦組織的基本一致,詳細(xì)結(jié)果詳見圖3B。

差異轉(zhuǎn)錄因子分析顯示,脊髓組織中有195個(gè)基因?qū)儆诓町惐磉_(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因,其中41個(gè)顯著上調(diào),154個(gè)顯著下調(diào),P<0.05,通過與蛋白家族比對,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子主要聚焦在zf-C2H2、bHLH、Homeobox、STAT等家族,結(jié)果詳見圖3C。

4.低葉酸聯(lián)合MTX實(shí)驗(yàn)組NTDs胎鼠的腦和脊髓組織DEGs比較分析:比較兩種組織中的DEGs發(fā)現(xiàn),9.5天的NTDs胎鼠的腦組織和脊髓組織的DEGs分別有939、879個(gè),其中有185個(gè)DEGs同時(shí)在腦組織和脊髓組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)受到影響。對比兩種組織中預(yù)測的差異轉(zhuǎn)錄因子發(fā)現(xiàn),在腦組織和脊髓組織中分別有的191、195個(gè)差異轉(zhuǎn)錄因子中,有31個(gè)為相同的轉(zhuǎn)錄因子,結(jié)果詳見圖4。

圖4 低葉酸聯(lián)合MTX實(shí)驗(yàn)組NTDs胎鼠的腦和脊髓組織DEGs對比圖

討 論

葉酸在體內(nèi)經(jīng)酶催化生成活性的四氫葉酸,四氫葉酸作為一碳基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶的輔酶,參與堿基的合成、氨基酸之間的相互轉(zhuǎn)化以及DNA和蛋白質(zhì)等多種物質(zhì)的甲基化,進(jìn)而影響體內(nèi)多種與發(fā)育相關(guān)的基因和通路的調(diào)控。胎兒早期生長發(fā)育中,對核酸和蛋白質(zhì)的合成需求最為旺盛,這一階段如果葉酸缺乏,對胎兒發(fā)育的影響更為嚴(yán)重。

MTX作為抗葉酸類抗代謝藥,可抑制有生理活性的四氫葉酸合成。本研究使用的小鼠模型采用低葉酸飲食喂養(yǎng),模擬動物體內(nèi)低葉酸的生理環(huán)境,神經(jīng)管閉合關(guān)鍵期在孕鼠腹腔注射MTX,既排除了單純?nèi)~酸缺乏飼喂并不能導(dǎo)致小鼠NTDs的不足,又排除了單純NTX誘導(dǎo)小鼠NTDs不能更好模擬體內(nèi)葉酸缺乏生理狀態(tài)的缺陷[5]。因此在該動物模型基礎(chǔ)上檢測胚胎神經(jīng)發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期腦組織和脊髓組織基因的表達(dá)變化,對推論低葉酸環(huán)境可能影響人胚胎期神經(jīng)組織發(fā)育的功能基因及轉(zhuǎn)錄因子的參考意義較大。

本研究選取受孕9.5天胎鼠腦組織和脊髓組織,轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果直接反映了神經(jīng)管發(fā)育當(dāng)時(shí)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化,而不是神經(jīng)管發(fā)育完成狀態(tài)下的情況。通常小鼠神經(jīng)管發(fā)育時(shí)期為7.5～10.5天。從受孕7.5天開始出現(xiàn)神經(jīng)板;受孕8天,后腦和頸部交界的第一閉合點(diǎn)以拉鏈方式同時(shí)向頭側(cè)方向和尾側(cè)方向進(jìn)行,分別形成將來的腦和脊髓;受孕9天,位于中前腦和中腦的第二閉合點(diǎn)向頭尾兩端閉合;位于前腦喙末端的第三閉合點(diǎn)單向閉合[6]。本研究在受孕7.5天通過腹腔注射MTX進(jìn)行誘導(dǎo)NTDs,并在受孕9.5天可以觀察到神經(jīng)管正常完整發(fā)育外觀以及畸形外觀時(shí)取材,能更準(zhǔn)確反映發(fā)育階段的即時(shí)情況。與同類型畸形胎鼠研究取材時(shí)間10.5、11.5、13.5天比較,能更好地反映發(fā)育當(dāng)時(shí)的情況[4,7,8]。

RNA-seq結(jié)果顯示,低葉酸聯(lián)合MTX實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)錄組學(xué)發(fā)生明顯改變,DEGs功能主要與神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)有關(guān)。腦組織DEGs功能不論是按BP、CC還是MF進(jìn)行分類,DEGs的上調(diào)和下調(diào)基因出現(xiàn)同時(shí)富集在同一生物學(xué)功能的情況,說明該生物學(xué)功能的基因出現(xiàn)了表達(dá)的紊亂。脊髓組織DEGs功能在各分類中結(jié)果與腦組織的相似。該結(jié)果反映出低葉酸聯(lián)合MTX同時(shí)影響胎鼠腦組織和脊髓組織的發(fā)育,并且產(chǎn)生了相似的影響。

葉酸代謝對細(xì)胞中發(fā)生的甲基化反應(yīng)至關(guān)重要,包括DNA和組蛋白甲基化。DNA甲基化是由葉酸代謝產(chǎn)生的一碳基團(tuán)作為甲基供體來源,可以調(diào)控基因的表達(dá)及沉默,參與胚胎發(fā)育及多種疾病的進(jìn)展,是表觀遺傳修飾研究中最廣泛、最具特征的一類。組蛋白甲基化也是葉酸代謝產(chǎn)生的一碳基團(tuán)作為甲基供體來源,研究表明大量與組蛋白H3第79位賴氨酸二甲基化(H3K79me2)相結(jié)合的基因處于轉(zhuǎn)錄激活的狀態(tài),H3K79me2對基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控發(fā)揮著激活作用[9]。在全基因組范圍內(nèi)有280個(gè)發(fā)育相關(guān)的基因在人胚胎干細(xì)胞中接受H3K79me2的調(diào)控。研究還表明,葉酸還可以影響組蛋白乙酰化水平,從而影響下游基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[10]。因此葉酸通過表觀遺傳修飾作用對基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的影響相當(dāng)廣泛。在本實(shí)驗(yàn)研究中,實(shí)驗(yàn)組與對照組比較,腦、脊髓組織基因轉(zhuǎn)錄組分別有939、879個(gè)DEGs,受影響的基因數(shù)量較多。其中分別有191、195個(gè)基因?qū)儆诓町惐磉_(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因。

在腦組織和脊髓組織的差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因中,通過與蛋白家族比較,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子主要聚焦在zf-C2H2、bHLH、Homeobox、STAT等轉(zhuǎn)錄因子家族。因轉(zhuǎn)錄因子家族涉及到轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量較多,還需要后續(xù)進(jìn)一步深入的研究。課題組的另一項(xiàng)通過抑制葉酸代謝物參與DNA合成誘導(dǎo)小鼠NTDs的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),bHLH 家族的一員Hes3表達(dá)異常,同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn),該轉(zhuǎn)錄因子與神經(jīng)管的發(fā)育密切相關(guān)[11,12]。本研究僅是在低葉酸飼喂聯(lián)合MTX誘導(dǎo)的小鼠NTDs模型的基礎(chǔ)上,對可能影響的神經(jīng)組織發(fā)育的功能基因及轉(zhuǎn)錄因子的初步探索,可為NTDs發(fā)生機(jī)制的研究提供思路。

綜上所述,低葉酸聯(lián)合MTX能夠引起胎鼠神經(jīng)組織基因組的轉(zhuǎn)錄改變,DEGs主要是以神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因?yàn)橹?葉酸可能通過調(diào)節(jié)功能相關(guān)基因的表達(dá)來影響胚胎神經(jīng)組織的發(fā)育,但其具體機(jī)制尚有待于進(jìn)一步探討。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。