劉雅靜 李亞男 李冰玉 王 蘇 劉 戀

鐵作為機(jī)體必不可少的微量元素之一,對生命活動(dòng)具有十分重要的意義。適量鐵離子可參與細(xì)胞能量代謝,而過多的鐵離子又可抑制機(jī)體自我修復(fù)功能進(jìn)而啟動(dòng)鐵死亡加重?fù)p傷[1]。研究證實(shí),細(xì)胞對鐵穩(wěn)態(tài)有著嚴(yán)格的調(diào)控機(jī)制卻沒有適當(dāng)?shù)那宄龣C(jī)制,機(jī)體中鐵的儲存量增多,可引起氧化還原失衡,最終導(dǎo)致組織向不可逆的細(xì)胞死亡方向進(jìn)展[2]。已有研究證實(shí),鐵離子是神經(jīng)元損傷和死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,缺血腦組織中鐵代謝相關(guān)蛋白發(fā)生改變會導(dǎo)致鐵離子聚集,而過量的鐵離子可通過芬頓反應(yīng)催化生成大量羥自由基,誘導(dǎo)細(xì)胞損傷,加重急性缺血期受損組織的損害并減少再灌注帶來的有益效果[3,4]。

研究發(fā)現(xiàn)富含鳥嘌呤序列的結(jié)合因子1(guanine-rich sequence-binding factor 1,GRSF1)在胚胎發(fā)育過程中可上調(diào)磷脂谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase 4,GPX4)的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)腦發(fā)育,而GPX4作為抑制鐵死亡的重要因子,有報(bào)道稱其可通過GRSF1/GPX4軸抑制鐵離子的聚集、改善心肌氧化應(yīng)激進(jìn)而減輕損傷[5,6]。然而GRSF1/GPX4軸是否可以通過調(diào)控鐵代謝進(jìn)而改善腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)目前尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究旨在探討GRSF1/GPX4軸調(diào)控的鐵代謝紊亂在CIRI中的作用,以期為改善CIRI的預(yù)后提供新思路。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組:清潔級健康雄性C57BL/6小鼠18只,湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,動(dòng)物許可證號:SYXK(湘)2019-0004。本研究已獲得筆者醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會審批[倫理學(xué)審批號:WDRM動(dòng)(福)第20200303號]。隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦缺血再灌注組、腦缺血再灌注+GRSF1過表達(dá)組。腦缺血再灌注組及腦缺血再灌注+GRSF1過表達(dá)組采用線栓法制備小鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型,缺血60min再灌注24h;腦缺血再灌注+GRSF1過表達(dá)組造模前7天予以腦組織內(nèi)注射GRSF1過表達(dá)慢病毒(上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司)。

2.主要材料:BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司;GRSF1抗體(貨號:A18227)、GPX4抗體(貨號:A1933)、TfR1抗體(貨號:A5865)購自武漢愛博泰克生物科技有限公司,IRP2抗體(貨號:23829-1-AP)、鐵蛋白抗體(貨號:10727-1-AP)購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,β-actin抗體(貨號:GB11001)購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

3.腦室注射慢病毒:0.3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠,固定小鼠頭部于鼠腦立體定位架,消毒后沿頭部正中線切皮暴露頭骨。參考課題組既往研究進(jìn)行定位后用微量注射泵垂直顱骨刺入,向小鼠側(cè)腦室緩慢注射2μl的GRSF1過表達(dá)慢病毒懸液。

4.動(dòng)物模型制備:麻醉小鼠后在小鼠頸部墊枕仰臥位固定,消毒后于頸部正中切口,顯微鏡下暴露并分離左側(cè)頸總動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈分支,分別結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端及頸外動(dòng)脈,利用動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端阻斷血流,盡可能靠近頸總動(dòng)脈結(jié)扎處剪一小口,插入線栓通過動(dòng)脈分叉處繼續(xù)向前推進(jìn),稍感阻力則停止,固定線栓并縫合切口。線栓置入60min后拔出恢復(fù)灌注。再灌注24h后行神經(jīng)功能評分,小鼠不能自主活動(dòng)或死亡記4分,行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒記3分,向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈記2分,提尾時(shí)對側(cè)前肢不能伸直記1分,無異常記0分。

5.TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡:4%多聚甲醛固定24h,脫水包埋后切片,脫蠟水化,滴加蛋白酶K工作液,37℃水浴鍋孵育30min,隨后破膜室溫孵育10min,浸入TUNEL混合液37℃孵育60min,PBS漂洗后滴加DAPI染液,室溫避光孵育,最后用抗熒光淬滅封片劑封片,顯微鏡下觀察拍照,使用Image J軟件進(jìn)行定量分析。

6.Western blot法檢測GRSF1、GPX4、鐵調(diào)節(jié)蛋白(iron regulatory protein 2,IRP2)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(transferrin receptor 1,TfR1)、鐵蛋白:根據(jù)樣品順序依次上樣,電泳儀恒壓80V 30min,觀察溴酚藍(lán)通過濃縮膠后調(diào)整為恒壓120V繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)將到底部。PVDF膜經(jīng)甲醇激活,電轉(zhuǎn)儀恒流200mA 120min進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,快速封閉液封閉后TBST洗膜1次,隨后一抗孵育4℃過夜,TBST洗滌,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗孵育1h,TBST洗滌后使用ECL顯影液避光孵育及利用顯影儀顯影,利用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

結(jié) 果

1．小鼠神經(jīng)功能評分和凋亡率的比較:與假手術(shù)組比較,腦缺血再灌注組小鼠神經(jīng)功能評分升高,大腦皮質(zhì)缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元凋亡率升高(P<0.05);與腦缺血再灌注組比較,腦缺血再灌注+GRSF1過表達(dá)組神經(jīng)功能評分減小,各區(qū)域神經(jīng)元凋亡率降低(P<0.05),詳見表1、圖1。

圖1 TUNEL染色觀察各組神經(jīng)元凋亡情況

表1 小鼠神經(jīng)功能評分及神經(jīng)元凋亡率的比較

2.小鼠GRSF1/GPX4軸的表達(dá)變化:與假手術(shù)組比較,腦缺血再灌注組小鼠GRSF1、GPX4降低(P<0.05);與腦缺血再灌注組比較,腦缺血再灌注+GRSF1過表達(dá)組GRSF1、GPX4升高(P<0.05),詳見表2、圖2。

圖2 小鼠GRSF1/GPX4軸的表達(dá)變化及Western blot法條帶圖

表2 小鼠GRSF1/GPX4軸的表達(dá)變化

3.小鼠鐵代謝水平的表達(dá)變化:與假手術(shù)組比較,腦缺血再灌注組小鼠IRP2、TfR1、鐵蛋白升高(P<0.05);與腦缺血再灌注組比較,腦缺血再灌注+GRSF1過表達(dá)組IRP2、TfR1、鐵蛋白降低(P<0.05),詳見表3、圖3。

圖3 小鼠鐵代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的Western blot法條帶圖及灰度值統(tǒng)計(jì)圖

表3 小鼠鐵代謝水平的變化比較

討 論

大腦中鐵代謝緩慢,鐵離子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的累積遠(yuǎn)超其他組織,因此深入探究鐵代謝及其涉及的信號通路在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的發(fā)病機(jī)制具有重要價(jià)值。研究證實(shí)鐵離子增加可觸發(fā)氧化應(yīng)激損傷和炎性介質(zhì)的積累進(jìn)而導(dǎo)致大腦長期處于應(yīng)激與炎性狀態(tài),加劇細(xì)胞發(fā)生死亡的風(fēng)險(xiǎn)[7]。近年來有研究指出,即使是正常周齡的小鼠發(fā)生腦缺血再灌注損傷后也會出現(xiàn)衰老細(xì)胞增多,鐵離子蓄積的現(xiàn)象[8]。而作為機(jī)體內(nèi)重要的抗衰老因子,研究發(fā)現(xiàn),GRSF1沉默后細(xì)胞內(nèi)鐵離子及TfR1表達(dá)增加,GPX4表達(dá)下降[6]。因此有研究認(rèn)為,GRSF1耗竭誘導(dǎo)的鐵代謝紊亂可能是腦缺血再灌注損傷的關(guān)鍵機(jī)制之一。

然而在腦缺血再灌注損傷進(jìn)程中GRSF1誘導(dǎo)鐵代謝紊亂的具體機(jī)制又是如何?GPX4作為體內(nèi)重要的抗氧化酶,可通過谷胱甘肽作為輔助因子催化脂質(zhì)過氧化物減少,抑制GPX4則會導(dǎo)致不飽和脂肪酸氧化和脂肪酸自由基的生成,進(jìn)一步增加神經(jīng)元對缺血缺氧的敏感度,促進(jìn)鐵死亡的發(fā)生[9]。研究發(fā)現(xiàn),在小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞中GRSF1可直接靶向調(diào)控GPX4進(jìn)而調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞的分化,同時(shí)在胚胎腦發(fā)育中GRSF1與GPX4共表達(dá),GRSF1可上調(diào)GPX4的水平,大鼠心肌細(xì)胞沉默GRSF1后會引起GPX4下降,鐵離子增多進(jìn)而加重?fù)p傷[5,6,10]。本研究參考課題組既往報(bào)道建立小鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型,筆者發(fā)現(xiàn),與假手術(shù)組比較,腦缺血再灌注組中GRSF1及GPX4表達(dá)減少,小鼠神經(jīng)功能評分與細(xì)胞凋亡率升高[11];而過表達(dá)GRSF1可顯著增加GPX4的表達(dá),減輕腦損傷。

鐵蛋白、TfR1、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(ferroportin1,FPN1)等,作為調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵離子代謝的相關(guān)蛋白,鐵離子經(jīng)小腸吸收后通過TfR1進(jìn)入細(xì)胞,并在體內(nèi)還原為二價(jià)鐵,胞內(nèi)鐵離子會以直接或間接的形式維持細(xì)胞的正常生理功能并參與生理活動(dòng),同時(shí)IRP2還可通過與其mRNAs非翻譯區(qū)內(nèi)的鐵反應(yīng)元件(iron-responsive elements,IREs)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)鐵蛋白、TfR1的表達(dá)參與鐵代謝[12]。

生理?xiàng)l件下血-腦脊液屏障可保護(hù)大腦免受全身鐵離子濃度波動(dòng)的影響,但在病理?xiàng)l件下,如CIRI會嚴(yán)重抑制神經(jīng)元鐵外流相關(guān)蛋白的表達(dá),從而導(dǎo)致鐵堆積[13]。此外,缺血還可增加細(xì)胞因子的表達(dá),上調(diào)鐵代謝調(diào)節(jié)肽導(dǎo)致FPNl減少,抑制鐵釋放;同時(shí)缺血后TfR1及Dmt1表達(dá)增加,促進(jìn)缺血性腦卒中鐵超載的發(fā)生,并且過量的鐵離子還可進(jìn)一步誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和鐵死亡對大腦產(chǎn)生再次損傷,是加重CIRI的關(guān)鍵機(jī)制[14]。

已有實(shí)驗(yàn)表明,鐵超載后IRP2與IRE解離進(jìn)而IRP2增多,同時(shí)TfR1表達(dá)升高,促使鐵離子向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)并以鐵蛋白的形式儲存[15]。此外Wang等[16]研究發(fā)現(xiàn),在大鼠缺氧缺血性腦損傷模型中可見IRP2及TfR1增多。本研究結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,腦缺血再灌注組鐵代謝相關(guān)分子IRP2、TfR1及鐵蛋白升高;過表達(dá)GRSF1后IRP2、TfR1及鐵蛋白降低,提示鐵代謝紊亂誘導(dǎo)的鐵死亡是參與CIRI的重要細(xì)胞死亡形式,通過調(diào)控GRSF1/GPX4軸可有效減輕鐵離子超載進(jìn)而改善腦損傷。

綜上所述,在腦缺血再灌注期間機(jī)體鐵代謝紊亂進(jìn)而誘導(dǎo)鐵死亡發(fā)生是加重腦損傷的關(guān)鍵機(jī)制,通過GRSF1/GPX4軸改善鐵代謝紊亂進(jìn)而抑制鐵死亡減輕CIRI,可能是臨床防治腦缺血再灌注損傷的新思路。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。