摘要：目的 研究不同咀嚼壓力對(duì)大鼠正畸移動(dòng)牙壓力側(cè)牙槽骨改建的影響。方法 選取8周齡雄性SD大鼠45只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為基線組5只、軟食組20只和硬食組20只?；€組大鼠在實(shí)驗(yàn)初始處死、取材。軟食組和硬食組建立上頜右側(cè)第一磨牙近中移動(dòng)模型，左側(cè)不加力作為對(duì)照。各組喂以相應(yīng)飲食，分別于加力后第3、5、7、14天各處死5只大鼠，取雙側(cè)上頜骨。Micro CT測(cè)量加力磨牙近中移動(dòng)距離及壓力側(cè)牙槽骨骨體積/組織體積（BV/TV）、骨小梁分離度（Tb.Sp）和骨小梁厚度（Tb.Th）?？咕剖崴嵝粤姿崦福═RAP）染色計(jì)數(shù)破骨細(xì)胞數(shù)量；原位雜交染色觀察細(xì)胞核因子-κB受體活化因子配體（RANKL）和骨保護(hù)素（OPG）mRNA表達(dá)隨時(shí)間變化情況。結(jié)果 第14天時(shí)軟食加力組牙齒移動(dòng)距離小于硬食加力組（P＜0.05）。軟食加力組與硬食加力組壓力側(cè)牙槽骨BV/TV、Tb.Sp、Tb.Th差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞計(jì)數(shù)和原位雜交結(jié)果顯示，在第5、7天，軟食加力組的破骨細(xì)胞數(shù)量和RANKL/OPG比值均低于硬食加力組（P＜0.05）。結(jié)論 較小的咀嚼壓力會(huì)減低大鼠正畸牙壓力側(cè)牙槽骨中的破骨活動(dòng)，減小牙齒移動(dòng)距離。

關(guān)鍵詞：咀嚼；壓力；牙齒移動(dòng)技術(shù)；正畸學(xué)；破骨細(xì)胞；骨保護(hù)素；細(xì)胞核因子-κB受體活化因子配體

中圖分類號(hào)：R783.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.11958/20230630

Effects of different masticatory pressures on alveolar bone remodeling in the pressure side during orthodontic tooth movement in rats

TIAN Jing1， WANG Zilong2， XIAO Danna1， FAN Xiangfei1

1 Department of Orthodontics， Tianjin Stomatological Hospital， Tianjin 300041， China;"2 School of Medicine， Nankai University

Corresponding Author E-mail： 1259815407@qq.com

Abstract： Objective To study the effect of different masticatory pressures on alveolar bone remodeling in rats with orthodontic moving teeth. Methods Forty-five male SD rats aged 8 weeks were randomly divided into 3 groups： the baseline group （n=5）， the soft diet group （n=20） and the hard diet group （n=20）. Rats in the baseline group were sacrificed at the beginning of the experiment. The experimental rat models of right upper first molar movement were established in the soft diet group and the hard diet group. Left side of the maxillary was used as the control group. Each group was fed with corresponding diet. Five rats were sacrificed in each group on the day 3， day 5， day 7 and day 14 after orthodontic treatment respectively. Micro CT was used to measure the mesial movement distance of molar， bone volume/tissue volume （BV/TV）， trabecular separation （Tb.Sp） and trabecular thickness （Tb.Th） of the alveolar bone on the pressure side. The number of osteoclasts in alveolar bone was counted after TRAP staining. In situ hybridization was used to detect the expression of RANKL and OPG. Results The amount of tooth movement was smaller on day 14 in the soft diet group than that of the hard diet group （P＜0.05）. There were no significant differences in BV/TV， Tb.SP and Tb.Th between the soft diet group and the hard diet group. TRAP staining and in situ hybridization showed that the number of osteoclasts and the RANKL/OPG ratio on day 5 and day 7 were lower in the soft diet group" than those of the hard diet group （P＜0.05）. Conclusion The osteoclast activity in the alveolar bone on the pressure side of the orthodontic tooth is decreased and the tooth movement is inhibited under lower masticatory pressure.

Key words： mastication; pressure; tooth movement techniques; orthodontics; osteoclasts; osteoprotegerin; RANKL

在正畸治療中，矯治力通過(guò)牙齒傳遞至牙周膜和牙槽骨，引起牙周組織一系列適應(yīng)性變化，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)牙齒移動(dòng)。此時(shí)牙槽骨內(nèi)破骨和成骨活動(dòng)處于高度活躍狀態(tài)，多種細(xì)胞因子、激素和機(jī)械應(yīng)力均調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨吸收過(guò)程［1］。牙齒移動(dòng)過(guò)程中，牙槽骨在受到矯治力作用的同時(shí)還間接受到咀嚼壓力的影響。研究表明咀嚼壓力改變不僅會(huì)對(duì)顱頜面部骨骼形態(tài)［2-4］和咀嚼肌功能運(yùn)動(dòng)［5-6］產(chǎn)生影響，也參與到牙槽骨代謝的破骨過(guò)程中［7］。以往研究多集中于牙周組織對(duì)矯治力的應(yīng)答［8-9］，對(duì)咀嚼壓力在口腔正畸中發(fā)揮的作用關(guān)注較少。探索咀嚼壓力對(duì)正畸移動(dòng)牙牙周組織中破骨活動(dòng)和牙槽骨微結(jié)構(gòu)的影響，以利于更科學(xué)地為患者提供正畸期間飲食指導(dǎo)，安全有效地縮短矯治時(shí)間十分必要。咀嚼壓力是一種多方向、持續(xù)時(shí)間短且反復(fù)加載在牙齒上的力［10］，難以用人為施加的機(jī)械力模擬。故本研究在大鼠正畸牙移動(dòng)模型的基礎(chǔ)上，通過(guò)改變食物硬度模擬不同咀嚼壓力［11-12］，以初步探索不同咀嚼壓力和正畸力共同作用下壓力側(cè)牙槽骨的改建差異。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 45只8周齡清潔級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量（300±20）g，購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所（天津）動(dòng)物中心飼養(yǎng)，室溫20～26 ℃，濕度55%，12 h/12 h明暗循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)天津市口腔醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)（批號(hào)PA2020-B-009）。

1.2 試劑與儀器 正畸結(jié)扎絲（直徑0.02 mm，長(zhǎng)沙市天天齒科器材有限公司）；正畸恒力鎳鈦拉簧（50 g，深圳市速航科技發(fā)展有限公司）；光固化流體樹(shù)脂（Z350XT，美國(guó)3M公司）；全封閉組織脫水機(jī)（ASP300）、組織包埋機(jī)（EC350-1）、石蠟切片機(jī)（RM2135）均購(gòu)自德國(guó)徠卡微系統(tǒng)有限公司；抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色試劑盒（南京建成科技有限公司）；細(xì)胞核因子-κB受體活化因子配體（receptor-activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）、骨保護(hù)素（osteoprogerin，OPG）mRNA原位雜交檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；尼康光學(xué)顯微鏡（Ni-U型，日本尼康）；Micro CT（Skyscan1276型，比利時(shí)Skyscan）。

1.3 分組及模型建立 45只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為基線組（5只）、軟食組（20只）和硬食組（20只）。其中硬食組喂以短顆粒狀常規(guī)大鼠飼料，軟食組喂以與硬食組成分相同但研磨為粉末狀的大鼠飼料。所有大鼠經(jīng)3%異氟烷混合氧氣吸入麻醉?；€組大鼠在實(shí)驗(yàn)初始即在麻醉狀態(tài)下處死，取雙側(cè)上頜骨，記為第0天標(biāo)本。其余各組分別在大鼠上頜右側(cè)第一磨牙和左右上門齒牙冠頸1/3區(qū)制備水平淺溝。用結(jié)扎絲將鎳鈦拉簧一端進(jìn)入淺溝固定在上頜右側(cè)第一磨牙，另一端進(jìn)入淺溝固定在上門齒并用流體樹(shù)脂粘接加固。上頜的左側(cè)不加力作為對(duì)照。各組大鼠喂以相應(yīng)軟、硬質(zhì)飼料，自由飲水。術(shù)后對(duì)大鼠加力裝置、進(jìn)食等一般情況進(jìn)行觀察。各組分別于加力后第3、5、7、14天處死5只大鼠，取雙側(cè)上頜骨。左側(cè)上頜骨樣本對(duì)應(yīng)記為軟食對(duì)照組和硬食對(duì)照組，右側(cè)上頜骨樣本對(duì)應(yīng)記為軟食加力組和硬食加力組。所有標(biāo)本放入4%多聚甲醛中，4 ℃固定24 h待后續(xù)處理。

1.4 Micro CT掃描及分析 將各組第14天的上頜骨樣本進(jìn)行Micro CT掃描，掃描電壓70 kV，電流141 μA，掃描層厚10 μm。在矢狀面上測(cè)量右側(cè)上頜第一磨牙牙冠遠(yuǎn)中面與第二磨牙牙冠近中面間的最短水平距離并作為牙齒移動(dòng)距離。在上頜第一磨牙根分叉壓力區(qū)選擇300 μm′300 μm′400 μm的長(zhǎng)方體為感興趣區(qū)，三維重建后測(cè)量該部位松質(zhì)骨的骨體積分?jǐn)?shù)即骨體積/組織體積（bone volume/tissue volume，BV/TV）、骨小梁分離度（trabecular separatio，Tb.Sp）和骨小梁厚度（trabecular thicknes，Tb.Th）。

1.5 制作石蠟切片 各組所取上頜骨組織經(jīng)固定、脫鈣、脫水透明、石蠟包埋后，切片機(jī)沿牙齒近、遠(yuǎn)中方向切取4 μm厚組織切片。

1.6 TRAP染色 按TRAP染色試劑盒說(shuō)明書染色，光學(xué)顯微鏡下在各組大鼠上頜第一磨牙壓力側(cè)牙槽骨隨機(jī)抽取3個(gè)非重疊視野拍照，計(jì)數(shù)TRAP染色呈陽(yáng)性的破骨細(xì)胞。

1.7 原位雜交染色 按照RANKL、OPG mRNA原位雜交檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書行原位雜交。分別以預(yù)雜交液代替雜交液、RNA酶預(yù)處理標(biāo)本作為陰性對(duì)照。光學(xué)顯微鏡下在第一磨牙牙槽骨壓力區(qū)隨機(jī)選取3個(gè)非重疊視野拍照，使用Image Pro Plus 6.0軟件對(duì)圖像進(jìn)行半定量分析，以積分光密度/面積計(jì)算RANKL、OPG平均光密度（mean optical density，MOD），并計(jì)算RANKL/OPG比值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以[[x] ±s

]表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較使用單因素方差分析，破骨細(xì)胞數(shù)量、RANKL mRNA MOD、OPG mRNA MOD和RANKL/OPG比值多組間比較使用多因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Micro CT測(cè)量結(jié)果 第14天時(shí)軟食加力組牙齒移動(dòng)距離（mm）小于硬食加力組（0.284[±]0.027 vs. 0.324[±]0.026，n=5，t=2.382，P＜0.05），見(jiàn)圖1。軟食加力組與軟食對(duì)照組相比、硬食加力組與硬食對(duì)照組相比BV/TV均減小（P＜0.05），Tb.Sp、Tb.Th差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；軟食加力組與硬食加力組間BV/TV、Tb.Sp、Tb.Th差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

2.2 壓力側(cè)破骨細(xì)胞數(shù)量變化 TRAP染色可見(jiàn)軟食對(duì)照組與硬食對(duì)照組牙周纖維排列整齊、形態(tài)舒展；軟食加力組與硬食加力組牙周纖維呈壓縮狀態(tài)，破骨細(xì)胞多位于壓力側(cè)牙槽骨表面，胞漿深染呈酒紅色。各組第7天TRAP染色結(jié)果見(jiàn)圖2。軟食對(duì)照組與硬食對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)的破骨細(xì)胞數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；軟食加力組、硬食加力組破骨細(xì)胞數(shù)量隨加力時(shí)間延長(zhǎng)呈先升高再降低趨勢(shì)，第7天達(dá)到峰值（P＜0.05）；軟食加力組與硬食加力組的破骨細(xì)胞數(shù)量在第5、7、14天時(shí)均高于各自對(duì)照組（P＜0.05）；在第5、7天時(shí)，軟食加力組破骨細(xì)胞數(shù)量少于硬食加力組（P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.3 壓力側(cè)RANKL和OPG mRNA表達(dá)量變化 原位雜交染色顯示，RANKL 和OPG mRNA主要表達(dá)于靠近牙槽骨表面的牙周膜內(nèi)，各組第7天原位雜交染色結(jié)果見(jiàn)圖3。軟食對(duì)照組與硬食對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)的RANKL mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；軟食加力組與硬食加力組的RANKL mRNA 表達(dá)水平隨加力時(shí)間延長(zhǎng)呈先升高再降低趨勢(shì)，第7天達(dá)到最高（P＜0.05）；軟食加力組與硬食加力組的RANKL mRNA 表達(dá)水平在第5、7、14天時(shí)均高于各自對(duì)照組（P＜0.05）；在第5、7天時(shí)，軟食加力組RANKL mRNA表達(dá)水平低于硬食加力組（P＜0.05），見(jiàn)表3。軟食對(duì)照組與硬食對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)的OPG mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；軟食加力組與硬食加力組OPG mRNA表達(dá)水平隨加力時(shí)間延長(zhǎng)呈逐漸升高趨勢(shì)；軟食加力組與硬食加力組的OPG mRNA表達(dá)水平在第5、7、14天時(shí)均高于各自對(duì)照組（P＜0.05）；軟食加力組與硬食加力組各時(shí)間點(diǎn)OPG mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表4。軟食對(duì)照組與硬食對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)的RANKL/OPG比值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；軟食加力組與硬食加力組RANKL/OPG比值隨加力時(shí)間延長(zhǎng)呈先升高再降低趨勢(shì)，第7天達(dá)到最高（P＜0.05）；軟食加力組與硬食加力組的RANKL/OPG比值在第3、5、7、14天時(shí)均高于各自對(duì)照組（P＜0.05）；在第5、7天時(shí)，軟食加力組的RANKL/OPG比值低于硬食加力組（P＜0.05），見(jiàn)表5。

3 討論

3.1 咀嚼壓力對(duì)移動(dòng)牙壓力側(cè)牙周組織中破骨細(xì)胞、RANKL和OPG表達(dá)的影響 當(dāng)機(jī)械力通過(guò)牙周韌帶作用于牙槽骨時(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞、骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞都可以感知機(jī)械信號(hào)并作出應(yīng)答，通過(guò)相互作用調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的募集、增殖和分化［13-14］。其中RANKL/RANK/OPG信號(hào)通路是成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞相互調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［15-17］。成骨細(xì)胞表達(dá)的RANKL與破骨前體細(xì)胞表面的RANK結(jié)合，能夠誘導(dǎo)破骨細(xì)胞增殖分化，促進(jìn)骨吸收過(guò)程。而由基質(zhì)和成骨細(xì)胞譜系分泌的OPG會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性地與RANKL結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞活化［18］。RANKL/OPG比值是破骨細(xì)胞分化成熟和功能表達(dá)的決定因素［19］。

本研究結(jié)果顯示，軟食加力組和硬食加力組RANKL/OPG比值均呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，與以往研究結(jié)果類似［20-21］。軟食加力組與硬食加力組的RANKL mRNA表達(dá)水平在第5、7、14天時(shí)均高于各自對(duì)照組，證明矯治力可以上調(diào)壓力側(cè)牙周組織內(nèi)RANKL的表達(dá)量，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化成熟，引起壓力側(cè)牙槽骨吸收［22］；而在加力后期，隨著牙齒移動(dòng)、矯治力逐漸減小，RANKL/OPG比值降低，活化的破骨細(xì)胞數(shù)量減少、破骨活動(dòng)隨之減弱。本研究中，加力14 d內(nèi)不同的咀嚼壓力并未對(duì)正畸過(guò)程中RANKL和OPG mRNA表達(dá)量和破骨細(xì)胞數(shù)量的整體變化趨勢(shì)造成影響，但在第5、7天時(shí)軟食加力組破骨細(xì)胞數(shù)量、RANKL mRNA表達(dá)量及RANKL/OPG比值均低于硬食加力組，提示咀嚼壓力也可以刺激參與骨改建細(xì)胞細(xì)胞膜上的機(jī)械感受器，引發(fā)下游RANKL/RANK/OPG信號(hào)通路的激活，進(jìn)而調(diào)控牙槽骨改建過(guò)程。在牙槽骨代謝活躍時(shí)，咀嚼壓力減小會(huì)引起牙周組織中RANKL mRNA表達(dá)量減少，抑制破骨細(xì)胞分化，減慢骨吸收過(guò)程。在加力后期，壓力側(cè)牙槽骨破骨活動(dòng)減低，咀嚼壓力對(duì)骨改建的影響變小，軟食加力組與硬食加力組間差異不再明顯。本研究中，軟食與硬食加力組牙周組織中OPG mRNA的表達(dá)量無(wú)明顯差異，分析原因可能是加力組各時(shí)間點(diǎn)的RANKL/OPG比值均高于基線水平，壓力側(cè)破骨活動(dòng)占優(yōu)勢(shì)，成骨活動(dòng)較弱，咀嚼壓力對(duì)成骨活動(dòng)尚未充分表達(dá)。

3.2 咀嚼壓力對(duì)牙槽骨微結(jié)構(gòu)的影響 牙槽骨是體內(nèi)代謝最為活躍的骨組織，咀嚼壓力和正畸矯治力都可以引起其微結(jié)構(gòu)的變化。鄒昭琪等［23］選擇23日齡的SD大鼠分組進(jìn)行軟、硬食喂養(yǎng)，2周后發(fā)現(xiàn)軟食組與硬食組相比下頜第一磨牙根分叉區(qū)松質(zhì)骨BV/TV減小、Tb.Sp增高、Tb.Th無(wú)明顯差別。Wei等［24］用不銹鋼方絲在8周齡SD大鼠上頜第一磨牙加載垂直向矯治力，14 d后發(fā)現(xiàn)磨牙根分叉區(qū)松質(zhì)骨BV/TV減小、Tb.Sp增加、Tb.Th無(wú)明顯變化。本研究中第14天時(shí)軟食加力組、硬食加力組相比各自對(duì)照組的BV/TV減小，Tb.Sp、Tb.Th均無(wú)明顯差異，表明正畸加力會(huì)造成牙根壓力側(cè)松質(zhì)骨內(nèi)骨量降低，但骨小梁微結(jié)構(gòu)無(wú)明顯變化。而軟食加力組與硬食加力組的BV/TV、Tb.Sp、Tb.Th均無(wú)明顯差異。這可能是破骨細(xì)胞及相關(guān)因子多集中在壓力側(cè)牙槽骨表面的皮質(zhì)骨，而在松質(zhì)骨內(nèi)的分布較少，故軟、硬食加力組間松質(zhì)骨微結(jié)構(gòu)的差異尚無(wú)法在影像學(xué)上檢測(cè)到。

綜上，本研究初步證實(shí)正畸過(guò)程中較小咀嚼壓力會(huì)減低壓力側(cè)牙槽骨中的破骨活動(dòng)，減小牙齒移動(dòng)距離，提示在正畸牙齒移動(dòng)時(shí)不宜長(zhǎng)期保持硬度過(guò)軟的飲食，否則可能降低牙齒移動(dòng)速率、延長(zhǎng)治療時(shí)間。但在本研究14 d的加力周期內(nèi)，不同咀嚼壓力尚未引起牙槽骨微結(jié)構(gòu)變化出現(xiàn)差異，后續(xù)可延長(zhǎng)觀察時(shí)間，保持正畸加力裝置穩(wěn)固性，更完整地探索正畸矯治力及不同咀嚼壓力共同作用下牙槽骨改建的差異。

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基金項(xiàng)目：天津市衛(wèi)生健康科技項(xiàng)目（ZC20002）

作者單位：1天津市口腔醫(yī)院正畸科（郵編300041）；2南開(kāi)大學(xué)醫(yī)學(xué)院

作者簡(jiǎn)介：田靜（1987），女，主治醫(yī)師，主要從事口腔正畸方面研究。E-mail：tianjing0225@163.com

通信作者 E-mail：1259815407@qq.com

（本文編輯 李志蕓）