梁嬋華?莫麗?田重陽?唐玉涵

摘 要：目的：探討姜黃素聯(lián)合富硒酵母對急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用。方法：將60只C57B6L/J小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、姜黃素組（33.33 mg·kg-1 bw）、富硒酵母組（7.50 mg·kg-1 bw）和聯(lián)合組（姜黃素33.33 mg·kg-1 bw+富硒酵母7.50 mg·kg-1 bw），每組12只；干預(yù)30 d后，一次性灌胃50%乙醇溶液（12 mL·kg-1 bw）建立急性酒精性肝損傷模型；觀察小鼠體重、攝食、行為變化；檢測小鼠肝臟指數(shù)與丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）和甘油三酯（Triglyceride，TG）水平；油紅染色觀察小鼠肝臟組織病理學(xué)變化。結(jié)果：與空白組比較，模型組小鼠表現(xiàn)出肝臟腫大、肝細(xì)胞中脂滴大量堆積病理損傷，肝臟組織MDA和TG水平顯著升高（P＜0.05）；姜黃素聯(lián)合富硒酵母能顯著降低小鼠肝臟中MDA和TG表達(dá)，提高GSH水平（P＜0.05），減輕小鼠肝臟脂肪沉積。結(jié)論：姜黃素聯(lián)合富硒酵母能夠改善急性酒精灌胃誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)異常堆積，減輕氧化應(yīng)激水平，對急性酒精性肝損傷具有良好的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：姜黃素；富硒酵母；急性酒精性肝損傷

Protective Effect of Curcumin and Selenium-Rich Yeast on Acute Alcoholic Hepatic Injury in Mice

Abstract： Objective： Exploring the protective effect of curcumin combined with selenium-rich yeast on acute alcoholic liver injury. Method： 60 C57B6L/J mice were randomly divided into blank group， model group， curcumin group （33.33 mg·kg-1 bw）， selenium-rich yeast group （7.50 mg·kg-1 bw） and combination group （curcumin?33.33 mg·kg-1 bw+selenium-rich yeast 7.50 mg·kg-1 bw）， 12 mice in each group; 30 days after the intervention， a model of acute alcoholic liver injury was established by one-time gavage 50% ethanol solution （12 mL·kg-1 bw）; the weight， feeding and behavior changes of mice were observed; liver index and the levels of malondialdehyde （MDA）， glutathione （GSH） and triglyceride （TG） were detected， and the histopathological changes of the liver were observed by oil red staining. Result： Compared to control group， the model mice showed liver enlargement， massive accumulation of lipid droplets in liver cells， and significantly increased MDA and TG levels （P＜0.05） in liver tissues， while curcumin combined with selenium-rich yeast could significantly reduce the expression of MDA and TG in the liver， increase the level of GSH （P＜0.05）， and reduce the fat deposition in the liver. Conclusion： Curcumin combined with selenium-rich yeast can improve abnormal accumulation of liver lipids induced by acute alcohol gavage， reduce the level of oxidative stress， and have a good protective effect against acute alcoholic liver injury.

Keywords： curcumin; selenium-rich yeast; acute alcoholic liver injury

酒精性肝?。ˋlcoholic Liver Disease，ALD）是由于長期大量攝入酒精引起的一系列肝臟疾病，包括以甘油三酯積聚為特征的酒精性脂肪肝，以肝細(xì)胞損傷、氣球樣變、炎癥為主要病理改變的酒精性慢性肝炎，最終發(fā)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌[1]。隨著居民消費(fèi)水平的不斷提高，酒精的消費(fèi)量不斷增加，世界衛(wèi)生組織報(bào)告，全世界每年有300萬人因過度攝入酒精而死亡，有害使用酒精分別占全球男性和女性疾病負(fù)擔(dān)的7.1%和2.2%[2]。目前，酒精性肝損傷的治療方法主要為營養(yǎng)支持和對癥治療，但長期用藥會帶來不良副作用。因此，需要探尋有效預(yù)防和治療酒精誘導(dǎo)肝損傷的方法。

姜黃素（Curcumin）是一種從姜黃根莖中提取，具有二酮結(jié)構(gòu)的天然多酚化合物[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、保護(hù)急性酒精性肝損傷[4]和改善非酒精性脂肪肝病等生物學(xué)和藥理學(xué)作用[3]。硒（Selenium，Se）是人體必需的微量元素，是谷胱甘肽過氧化物酶或硫氧蛋白還原酶等多種酶的輔因子。與無機(jī)硒相比，硒蛋氨酸和硒半胱氨酸等有機(jī)硒在人體中生物利用率更高[5]。富硒酵母則是利用酵母將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為利用率更高的有機(jī)硒[6]。此外，研究結(jié)果表明，富硒酵母具有抗癌[7]、保護(hù)慢性肝損傷[8]、改善脂質(zhì)代謝紊亂[9]和促進(jìn)骨骼健康[10]等生理作用。但姜黃素與富硒酵母對酒精性肝病的保護(hù)作用報(bào)道較少。程金來等[11]發(fā)現(xiàn)一次性大劑量酒精灌胃會造成小鼠急性酒精性肝損傷，因此，本文根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2022版）建立小鼠模型，通過觀察姜黃素聯(lián)合富硒酵母對急性酒精灌胃誘導(dǎo)肝損傷小鼠脂質(zhì)沉積及氧化應(yīng)激的影響效果，探討其保護(hù)肝臟的作用，為研發(fā)安全有效的護(hù)肝產(chǎn)品提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富硒酵母（批號：20211231026）、姜黃提取物（姜黃素含量95%，批號：J220224），安琪酵母股份有限公司；甘油三酯（Triglyceride，TG）測定試劑盒（貨號：A110-1-1）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）測定試劑盒（貨號：A003-1-2），南京建成生物有限公司；還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）和氧化型谷胱甘肽（Oxidized Glutathione Disulfide，GSSG）檢測試劑盒（貨號：S0053）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號：P0010），碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平，Sartorious公司；多功能酶標(biāo)儀，BioTek公司；5810R低溫高速離心機(jī)，Eppendorf公司；熒光倒置顯微鏡，OLYMPUS公司；渦旋混合儀，上海滬西分析儀器廠；恒溫水浴鍋，常州澳華儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，SANYO 公司；KZ-III研磨儀經(jīng)濟(jì)型，天津賽維爾公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

60只SPF級C57BL/6J雄性成年小鼠，體重18～20 g（湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證號為SCXK<湘>2019-0004），于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院農(nóng)藥毒理研究中心飼養(yǎng)（實(shí)驗(yàn)動物設(shè)施許可證號：SYXK（鄂）2019-0046）。環(huán)境溫度（24±1）℃，相對濕度55%～75%。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動物實(shí)驗(yàn)分組

所有小鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，依照體重隨機(jī)分為5組（12只/組）：空白組對照組、模型對照組、姜黃素組（姜黃素33.33 mg·kg-1 bw）、富硒酵母組（富硒酵母7.50 mg·kg-1 bw）、聯(lián)合組（姜黃素33.33 mg·kg-1 bw+富硒酵母7.50 mg·kg-1 bw）。

1.4.2 動物實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)小鼠每日經(jīng)口灌胃給予姜黃素、富硒酵母和姜黃素與富硒酵母混合溶液，空白組和模型組灌胃蒸餾水，連續(xù)灌胃30 d。小鼠均采用標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)環(huán)境，自由攝食飲水。每天觀察動物攝食、飲水、活動和一般情況，每周稱重2次，按照體重調(diào)整受試樣品的灌胃劑量。小鼠急性酒精性肝損傷模型于實(shí)驗(yàn)第30 d進(jìn)行，除空白對照組外，其余小鼠給予50%分析純乙醇（無水乙醇與蒸餾水為1∶1稀釋）一次性灌胃，灌胃量為12 mL·kg-1 bw，空白對照組給予等量蒸餾水。禁食不禁水16 h后處死動物，取材進(jìn)行各項(xiàng)生化檢測及病理組織學(xué)檢查。

1.4.3 肝臟生化指標(biāo)檢測

取100 mg肝組織，加入900 μL PBS，振動研磨，充分研磨后，以10 000×g離心10 min，取上清，通過生化試劑盒測定MDA、TG及GSH的含量。

1.4.4 肝臟組織病理學(xué)觀察

肝臟油紅O染色觀察小鼠肝臟脂肪沉積，取部分經(jīng)固定、脫水的肝臟組織于包埋機(jī)進(jìn)行包埋，制備冰凍切片，進(jìn)行油紅染色，并將染色片置于光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織中脂滴的數(shù)量與分布面積。對肝臟組織染色情況進(jìn)行脂質(zhì)沉積評分，細(xì)則如下。①肝細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量稀少、散在分布，則計(jì)0分；②肝臟組織中含有脂滴的肝細(xì)胞數(shù)量不超過肝臟組織面積的1/4則計(jì)1分；③不超過肝臟組織面積的1/2則計(jì)2分；④不超過肝臟組織面積的3/4則計(jì)3分；⑤整個(gè)肝臟組織幾乎充滿脂滴則計(jì)4分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 姜黃素聯(lián)合富硒酵母對急性酒精性肝損傷小鼠體重和臟器的影響

由表1可知，各組小鼠的初始體重均無顯著差異（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)期間小鼠進(jìn)食、飲水、活動正常，小鼠體重均有所增長，但各組小鼠最終體重差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組小鼠肝臟指數(shù)（肝體比）顯著增加（P＜0.05）。與模型組相比，聯(lián)合組小鼠肝臟指數(shù)降低3.6%，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 姜黃素聯(lián)合富硒酵母對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟氧化應(yīng)激的影響

由圖1可知，一次性大劑量酒精灌胃導(dǎo)致肝臟氧化應(yīng)激的發(fā)生，模型組小鼠肝臟的MDA水平顯著高于空白組（P＜0.05）。與模型組相比，姜黃素組、富硒酵母組、聯(lián)合組小鼠肝臟中MDA水平分別顯著降低了26.5%、35.3%和30.9%（P＜0.05）。相比于空白組，模型組小鼠肝臟組織中GSH水平有所上升，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。富硒酵母組、姜黃素組和聯(lián)合組小鼠肝臟的GSH水平較模型組均顯著升高（P＜0.05），其中聯(lián)合組升高了25.1%。

2.3 姜黃素聯(lián)合富硒酵母對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟TG水平的影響

由圖2可知，急性酒精性肝損傷模型組小鼠肝臟TG水平較空白組顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，聯(lián)合組小鼠肝臟中TG水平顯著降低了30.6%（P＜0.05）。

2.4 姜黃素聯(lián)合富硒酵母對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟脂質(zhì)沉積的影響

觀察油紅O染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白組小鼠肝細(xì)胞中散在少量、小體積、分布均勻的小脂滴。然而，模型組小鼠可以看到肝細(xì)胞內(nèi)充滿大量彌漫性、大小不一的橘紅色脂滴，且比空白組體積增大，數(shù)量增多。相比于模型組，姜黃素組、富硒酵母組及聯(lián)合組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量減少，體積減小，其中姜黃素與富硒酵母聯(lián)合干預(yù)對急性酒精誘導(dǎo)小鼠肝臟脂質(zhì)沉積改善效果最佳，見圖3。每組取5只小鼠進(jìn)行病理評分，對各組小鼠肝臟組織脂質(zhì)沉積情況進(jìn)行評分，結(jié)果如表2所示，與空白組相比，模型組小鼠肝臟病理得分增加，脂肪面積占比顯著升高（P＜0.05）。各組小鼠肝臟病理得分較模型組均有所下降，姜黃素組、富硒酵母組和聯(lián)合組脂肪面積占比較模型組顯著降低了50.6%、39.7%和52.9%（P＜0.05）。

3 結(jié)論與討論

大量飲酒能夠增加超重、肥胖、非酒精性脂肪肝相關(guān)肝硬化的肝癌風(fēng)險(xiǎn)，已成為疾病、殘疾和死亡的重要因素[12]。本實(shí)驗(yàn)按照《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范（2022版）》要求，姜黃素、富硒酵母單一及聯(lián)合干預(yù)30 d后一次性急性灌胃50%乙醇溶液，觀察到單一藥物和聯(lián)合藥物對檢測指標(biāo)有不同程度的改善效果，其中姜黃素聯(lián)合富硒酵母干預(yù)對小鼠肝損傷的改善效果最佳。

肝臟是乙醇毒性的主要靶器官，乙醇能在肝細(xì)胞中反應(yīng)代謝產(chǎn)生活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）和具有肝毒性的乙醛，乙醛能與DNA和蛋白質(zhì)反應(yīng)，從而形成誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的加合物[13]。酒精性肝病的發(fā)病機(jī)制涉及脂肪堆積、炎癥、氧化應(yīng)激和肝星狀細(xì)胞刺激的纖維化等病理進(jìn)程。氧化應(yīng)激是有害物質(zhì)刺激機(jī)體時(shí)，抗氧化系統(tǒng)清除氧化物能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于ROS產(chǎn)生程度，導(dǎo)致氧化系統(tǒng)與抗氧化防御系統(tǒng)平衡紊亂[14]。當(dāng)ROS過量時(shí)，內(nèi)源性ROS清除劑能夠中和部分自由基，但抗氧化劑被耗盡后，細(xì)胞膜與ROS結(jié)合，促進(jìn)MDA等脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等大分子損傷[15]。因此，MDA水平與氧化應(yīng)激程度密切相關(guān)，MDA水平越高，則表明機(jī)體氧化損傷程度越嚴(yán)重。葉敏貞等[16]研究表明，小鼠急性酒精灌胃后，肝臟組織中MDA水平顯著升高，同時(shí)抗氧化劑水平顯著降低，提示機(jī)體處于氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡的氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而促進(jìn)小鼠急性肝損傷的發(fā)生發(fā)展。還原型谷胱甘肽是一種非酶抗氧化劑，其主要活性基團(tuán)巰基可以與ROS自由基結(jié)合，從而降低氧化水平和炎癥損傷[17]。然而，研究發(fā)現(xiàn)有害物質(zhì)刺激動物在短時(shí)間內(nèi)肝臟、腎臟、睪丸等組織會出現(xiàn)GSH應(yīng)激性升高[18-19]。楊柳等[20]研究結(jié)果也表明小鼠急性酒精灌胃48 h后肝臟中GSH水平回升，可能是機(jī)體自我修復(fù)的作用。因此，本研究中模型組小鼠肝臟GSH水平升高，可能與GSH水平應(yīng)激性升高有關(guān)。乙醇氧化生成物在輔因子NAD+作用下產(chǎn)生NADH，從而降低NAD+與NADH的比率（NAD+/NADH）。NAD+/NADH比率降低能夠通過減少脂肪酸氧化和增強(qiáng)脂肪酸合成促進(jìn)肝臟中脂肪堆積[21]。本研究結(jié)果顯示，小鼠一次性攝入大劑量酒精16 h后，模型組小鼠肝臟氧化還原狀態(tài)失衡，脂肪異常聚集。與模型組相比，聯(lián)合組小鼠肝臟MDA和TG水平下降，GSH表達(dá)升高，脂滴數(shù)量明顯減少，表明姜黃素與富硒酵母聯(lián)合干預(yù)能夠減輕肝臟氧化損傷，改善脂肪堆積病理形態(tài)。

姜黃是一種藥食同源植物，其主要活性物質(zhì)姜黃素具有多種生理作用，但姜黃素含量少且生物利用度低[22]。近年來，天然產(chǎn)物和必需微量元素聯(lián)合作為藥物和保健食品開發(fā)受到越來越多的關(guān)注。KUMARI等[23]研究發(fā)現(xiàn)姜黃素負(fù)載硒納米顆粒能夠促進(jìn)HTC116細(xì)胞周期停滯和凋亡，此外，降低了EAC荷瘤小鼠的腫瘤負(fù)荷并延長其存活時(shí)間。AL-DOSSARI等[24]研究報(bào)道姜黃素和硒聯(lián)合干預(yù)7 d可以通過抑制炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)預(yù)防脂多糖或雙氯芬酸誘導(dǎo)的肝臟損傷。也有研究發(fā)現(xiàn)姜黃素與硒聯(lián)合給藥能夠增強(qiáng)機(jī)體抗氧化活性、減輕氧化應(yīng)激水平，從而抑制CCl4誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展[25]。因此，本研究采用姜黃素天然產(chǎn)物與富硒酵母聯(lián)合干預(yù)，觀察到其聯(lián)合作用能夠預(yù)防保護(hù)急性酒精性肝損傷。

綜上所述，姜黃素聯(lián)合富硒酵母具有預(yù)防保護(hù)急性酒精性肝損傷的應(yīng)用前景。本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素聯(lián)合富硒酵母能有效抑制肝臟腫大，降低肝臟MDA和TG水平，減少肝細(xì)胞脂滴沉積，同時(shí)上調(diào)GSH水平，提示姜黃素與富硒酵母聯(lián)合可能通過減輕氧化應(yīng)激水平和緩解脂質(zhì)堆積，從而保護(hù)酒精誘導(dǎo)的急性肝損傷，其中作用的具體機(jī)制需要更深入研究。

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