陳植 徐芳露 陳兵乾

[摘 ? 要] ? 目的：觀察自體富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）聯(lián)合自體骨移植術(shù)治療兔橈骨骨不連的效果。方法：成年新西蘭兔96只，隨機(jī)分為PRP-植骨組、單純植骨組和對(duì)照組各32只。將所有實(shí)驗(yàn)兔左前臂橈骨中段截除1 cm骨段，骨蠟封閉斷端髓腔，制成骨不連動(dòng)物模型。PRP-植骨組采用自體髂骨植入骨折端+骨折端注射自體PRP治療，單純植骨組僅在骨折端植入自體髂骨，對(duì)照組不作處理。術(shù)后2、4、8、12周時(shí)采用大體形態(tài)觀察、X線攝片、Micro-CT檢查、組織學(xué)觀察及生物力學(xué)檢測(cè)等手段對(duì)骨不連愈合情況進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果：大體觀察、X線攝片、Micro-CT、組織學(xué)及生物力學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，與單純植骨組比較，PRP-植骨組術(shù)后2、4周時(shí)軟骨細(xì)胞增生明顯增多，術(shù)后8周時(shí)已有明顯骨痂形成。PRP-植骨組術(shù)后2、4、8、12周被破壞時(shí)的最大載荷（payload-maximum，Pm）及破壞彎矩（moment，M）均高于同期單純植骨組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：自體富血小板血漿聯(lián)合骨移植術(shù)治療兔橈骨骨不連效果良好，骨愈合速度更快，骨愈合強(qiáng)度更高。

[關(guān)鍵詞] ? 實(shí)驗(yàn)兔；骨不連；富血小板血漿；骨移植術(shù)；生物力學(xué)

[中圖分類號(hào)] ? R683.41 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] ? A [DOI] ? 10.19767/j.cnki.32-1412.2024.01.002

Experimental study of autologous platelet-rich plasma combined with autologous bone grafting in the treatment of rabbit radial nonunion

CHEN Zhi1， XU Fanglu2， CHEN Bingqian1

（1Department of Orthopedics， Changshu No.1 People′s Hospital， Jiangsu 215500;

2Department of Nephrology， Changshu No.2 People′s Hospital）

[Abstract] ? Objective：To observe the effect of autologous platelet-rich plasma （PRP） combined with autologous bone grafting in the treatment of rabbit radial nonunion. Methods：Ninety-six adult New Zealand rabbits were randomly divided into three groups with 32 rabbits in each group， which were named as PRP-bone grafting group， the simple bone grafting group and the control group. A 1 cm bone segment was excised from the middle radium of the left forearm of all the rabbits in the three groups. The medullary cavity of the broken end was closed with bone wax. The rabbits in PRP-bone grafting group were treated with autologous iliac bone grafting and injection of autologous PRP at the fracture end， the rabbits in the simple bone grafting group were treated with autologous iliac bone grafting at the fracture end and the rabbits in the control group were not treated. At 2， 4， 8 and 12 weeks after operation， gross morphological observation， X-ray， Micro-CT， histological analysis， and biomechanical test were used to evaluate the healing of bone nonunion. Results：The results of gross observation， X-ray film， Micro-CT， histology and mechanical examination showed that the proliferation of chondrocytes in PRP-bone grafting group was significantly higher than that in the simple bone grafting group at 2 and 4 weeks after operation， and callus formation was obvious at 8 weeks after operation. The payload-maximum （Pm） and failure moment （M） in PRP-bone grafting group were higher than those in the simple bone grafting group at 2， 4， 8 and 12 weeks after operation（P<0.05）. Conclusion： The effect of autologous PRP combined with bone grafting in the treatment of rabbit radial nonunion is good， and the bone heals faster and stronger.

[Key words] ? experimental rabbits; nonunion of bone;platelet-rich plasma; bone grafting; biomechanics

骨不連又稱骨折不愈合，是骨折后常見(jiàn)的并發(fā)癥，5%以上骨折患者術(shù)后出現(xiàn)骨不連[1]。富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）治療是近年來(lái)興起的新型組織修復(fù)技術(shù)，PRP中富含大量生長(zhǎng)因子，可促進(jìn)人體各種組織的再生，目前廣泛用于慢性肌肉骨骼損傷、創(chuàng)面及軟組織修復(fù)、關(guān)節(jié)疼痛、運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。血小板可釋放多種生長(zhǎng)因子，激活間充質(zhì)細(xì)胞，觸發(fā)血管生成，促進(jìn)成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的增殖和趨化，在骨缺損治療中具有促進(jìn)骨愈合作用[2-3]。本研究構(gòu)建兔橈骨骨不連動(dòng)物模型，評(píng)估PRP聯(lián)合自體骨移植術(shù)治療骨不連的效果。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ? 清潔級(jí)成年新西蘭雄性大白兔96只［蘇州湖橋生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2020-0002］，兔齡6～7月，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，按數(shù)字隨機(jī)法分為PRP-植骨組、單純植骨組和對(duì)照組各32只。單籠飼養(yǎng)，室溫20 ℃、濕度65%，飲水量每日100 mL/kg，飼料主要為高質(zhì)量植物蛋白和優(yōu)質(zhì)脫水苜宿草（江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司），每日50 g/kg，每日分2次投喂。投喂7日后，在蘇州藥明康德新藥開(kāi)發(fā)有限公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（蘇）2018-0046］進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在無(wú)菌條件下制備兔橈骨骨不連模型。

1.2 ? 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ? 制備骨不連動(dòng)物模型：采用10%水合氯醛經(jīng)兔耳緣靜脈麻醉，劑量2 mL/kg，兔左前臂備皮，安爾碘消毒術(shù)區(qū)，鋪無(wú)菌巾單。取左前臂中段縱行切口，依次切開(kāi)皮膚、皮下組織，暴露左橈骨中段，用小型骨刀截除1 cm骨段，骨蠟封閉斷端髓腔，縫合切口。實(shí)驗(yàn)兔蘇醒后按前述飼養(yǎng)方式繼續(xù)飼養(yǎng)，切口定期消毒，每日肌肉注射青霉素200 000 U，連續(xù)1周。術(shù)后12周對(duì)所有實(shí)驗(yàn)兔左前臂攝X線片，確認(rèn)骨不連模型制備成功。

1.2.2 ? 自體PRP制備：采用Landesberg法，從實(shí)驗(yàn)兔耳緣靜脈抽取靜脈血10 mL，注入含抗凝劑試管內(nèi)，200 g離心10 min，得到3層液體，頂層為血小板血漿層，中間層為血小板濃縮物層，底層為紅細(xì)胞層。吸取全部頂層及交界面下3 mm液體，注入另1支不含抗凝劑試管中，200 g離心10 min，再次得到分為3層的液體，吸除3/4上清液，將剩余液體打勻，即得到約0.8 mL PRP。

1.2.3 ? 手術(shù)方法：PRP-植骨組：實(shí)驗(yàn)兔麻醉后，常規(guī)備皮、消毒鋪巾。在兔髂骨處作一小切口，鑿取少量松質(zhì)骨備用。于左前臂沿原切口切開(kāi)皮膚，暴露橈骨骨不連處，去除斷端硬化組織，打通髓腔。將自體松質(zhì)骨植于骨不連處，并將自體PRP填充于植骨處，逐層縫合切口。單純植骨組：手術(shù)步驟同PRP-植骨組，僅將自體松質(zhì)骨植于骨不連處。對(duì)照組：不作處理。麻醉蘇醒后按照前述飼養(yǎng)方式繼續(xù)飼養(yǎng)，切口定期消毒，每日肌肉注射青霉素200 000 U，連續(xù)1周。

1.3 ? 觀察指標(biāo) ? 在術(shù)后2周、4周、8周、12周時(shí)每組分別處死8只實(shí)驗(yàn)兔，切取左側(cè)橈骨完整骨段，作以下指標(biāo)觀察。（1）大體形態(tài)觀察。（2）X線攝片檢查：觀察骨不連修復(fù)情況。（3）Micro-CT檢查：觀察骨不連修復(fù)情況。（4）組織學(xué)觀察：橈骨骨段經(jīng)脫鈣、脫水、固定、透明后，用石蠟包埋，切片后行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察新骨生成情況。（5）生物力學(xué)檢測(cè)：采用拉扭雙軸動(dòng)靜態(tài)萬(wàn)能材料力學(xué)試驗(yàn)機(jī)對(duì)骨段進(jìn)行4點(diǎn)彎曲測(cè)試，測(cè)定被破壞時(shí)的最大載荷（payload-maximum，Pm）和破壞彎矩（moment，M）。

1.4 ? 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 ? 應(yīng)用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。計(jì)量資料以■±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用F檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 ? 結(jié) ? ? ?果

2.1 ? 大體形態(tài)觀察 ? 術(shù)后2周：PRP-植骨組、單純植骨組植入骨與自體骨交界面出現(xiàn)肉芽組織橋接。術(shù)后4周：PRP-植骨組、單純植骨組缺損位置可見(jiàn)淡紅色硬纖維，植入骨和自體骨之間可見(jiàn)模糊接線，連接不牢固，植入骨表面出現(xiàn)纖維骨痂，PRP-植骨組植入骨表面纖維骨痂多于單純植骨組。術(shù)后8周：PRP-植骨組骨痂呈膨脹性生長(zhǎng)，植入骨表面腔隙充填，植入骨和自體骨結(jié)合牢固。單純植骨組骨痂連續(xù)，植入骨和自體骨界限模糊，結(jié)合不夠牢固，刀片可分離。術(shù)后12周：PPR-植骨組缺損處骨組織覆蓋完全，愈合良好，呈現(xiàn)骨性愈合。單純植骨組植入骨表面出現(xiàn)連續(xù)堅(jiān)硬的骨痂，植入骨和自體骨結(jié)合較為牢固。對(duì)照組骨缺損位置出現(xiàn)疤痕纖維結(jié)締組織充填，截骨端骨折硬化。

2.2 ? X線攝片檢查 ? 術(shù)后2周：PPR-植骨組出現(xiàn)少量類骨痂樣物質(zhì)，單純植骨組與對(duì)照組中骨缺損間隙明顯。見(jiàn)圖1。術(shù)后4周：PPR-植骨組正常骨質(zhì)與植骨處間隙變小，間隙內(nèi)可見(jiàn)骨痂。單純植骨組中間隙仍明顯可見(jiàn)。對(duì)照組間隙清晰。見(jiàn)圖2。術(shù)后8周：PPR-植骨組中正常骨質(zhì)與植骨處附著緊密，間隙位置出現(xiàn)新生類骨組織。單純植骨組正常骨質(zhì)與植骨處出現(xiàn)細(xì)小間隙，骨痂充填間隙。見(jiàn)圖3。術(shù)后12周：PPR-植骨組缺損位置成熟板層狀骨組織充填，可見(jiàn)正常骨質(zhì)，骨缺損位置基本修復(fù)。單純植骨組中正常骨質(zhì)與植骨處附著緊密，新生類骨組織充填間隙。對(duì)照組僅少量骨痂形成，骨折斷端清晰可見(jiàn)，邊緣硬化。見(jiàn)圖4。

2.3 ? Micro-CT檢查 ? 術(shù)后2周：PRP-植骨組和單純植骨組植入骨與自體骨交接位置清晰，斷端整齊，斷端及缺損處骨密度均較對(duì)照組高。術(shù)后4周：PRP-植骨組缺損位置形成骨痂，植入骨出現(xiàn)少量吸收。單純植骨組缺損位置出現(xiàn)少量骨痂。術(shù)后8周：PRP-植骨組缺損位置骨痂大量形成，覆蓋植入骨，兩斷端被骨痂橋接，植入骨密度增加，缺損位置分區(qū)模糊，植入骨吸收明顯，骨髓腔部分出現(xiàn)再通。單純植骨組缺損位置骨痂形成增多，覆蓋大部分植入骨，兩端間隙略微模糊，植入骨兩端密度增加，部分植入骨吸收。術(shù)后12周：PRP-植骨組缺損處皮質(zhì)骨新生改造基本完成，新生骨密度接近正常骨，植入骨基本吸收，植入骨與自體骨連接自然，骨髓腔基本再通。單純植骨組缺損處骨痂大量形成，覆蓋植入骨，植入骨大部分吸收，皮質(zhì)骨基本連續(xù)，骨髓腔部分再通。對(duì)照組未形成連續(xù)型骨痂，缺損處呈現(xiàn)骨折硬化，骨折清晰，呈萎縮型骨不連表現(xiàn)。

2.4 ? 組織學(xué)觀察 ? 術(shù)后2周：PRP-植骨組植入骨孔隙出現(xiàn)少量軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，單純植骨組變化不明顯。術(shù)后4周：PRP-植骨組植入骨孔隙出現(xiàn)大量軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，并在植入骨邊緣見(jiàn)軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，新生骨痂呈條索狀，覆蓋在植入骨，缺損兩端成骨細(xì)胞更多，形成原始骨髓腔，載體骨內(nèi)發(fā)現(xiàn)毛細(xì)血管新生。單純植骨組植入骨孔隙出現(xiàn)少量軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞。術(shù)后8周：PRP-植骨組植入骨孔隙新生骨組織增加，可見(jiàn)破骨細(xì)胞，新生骨取代部分植入骨，見(jiàn)骨髓組織，新生骨痂（外周）成片狀，植入骨表面骨痂覆蓋面積大。單純植骨組植入骨孔隙出現(xiàn)大量軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，在植入骨邊緣也可見(jiàn)成骨細(xì)胞等。術(shù)后12周：PPR-植骨組植入骨成熟骨組織量大，植入骨大部分被吸收，骨髓組織增加，新骨、自體骨間可見(jiàn)骨小梁成熟。單純植骨組植入骨孔隙新生骨組織增加，破骨細(xì)胞可見(jiàn)，出現(xiàn)新生骨，新生骨痂（外周）成片狀，覆蓋面積擴(kuò)大。對(duì)照組缺損位置被大量纖維結(jié)締組織填充，骨斷端髓腔封閉，未見(jiàn)新骨生成。

2.5 ? 生物力學(xué)檢測(cè) ? 術(shù)后2、4、8、12周Pm及M，PRP-植骨組＞單純植骨組＞對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

3 ? 討 ? ? ?論

長(zhǎng)骨骨折術(shù)后骨不連發(fā)生率非常高，5%～10%[4]。自上世紀(jì)60年代AO組織提出解剖復(fù)位、堅(jiān)強(qiáng)內(nèi)固定及早期功能鍛煉的骨折治療原則以來(lái)，許多復(fù)雜骨折收到良好的治療效果，但時(shí)有骨不連的發(fā)生。骨折復(fù)位固定不牢靠、術(shù)后活動(dòng)和負(fù)重不當(dāng)可造成骨不連。骨不連的病理改變包括骨端的吸收硬化、骨質(zhì)疏松、骨與軟組織萎縮，并伴有關(guān)節(jié)僵硬。臨床上可以通過(guò)X線片、CT檢查等觀察骨缺損病灶具體情況，骨不連表現(xiàn)為骨折端互相分離，骨端硬化，間隙較大，萎縮疏松，髓腔封閉等征象。骨不連不僅延長(zhǎng)患者患病時(shí)間、延遲功能恢復(fù)，同時(shí)也會(huì)對(duì)患者心理產(chǎn)生不良影響。因此，一旦確診骨不連，應(yīng)立即采取相應(yīng)方法治療。

手術(shù)治療是目前公認(rèn)的治療骨不連最有效方法，包括內(nèi)固定、外固定、骨移植以及各種方法的聯(lián)合應(yīng)用。自體松質(zhì)骨移植術(shù)是治療骨不連的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但單純采用植骨治療術(shù)后恢復(fù)時(shí)間長(zhǎng)，因此有學(xué)者提出可將骨移植術(shù)與PRP技術(shù)聯(lián)合運(yùn)用。自體PRP含有豐富的生長(zhǎng)因子和高濃度血小板[5]，血小板活化后釋放轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、胰島素樣生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子以及表皮生長(zhǎng)因子等多種生長(zhǎng)因子，促進(jìn)軟骨組織和骨組織修復(fù)，加速骨不連患者骨組織修復(fù)。PRP制備方法較多，根據(jù)全血中各組分沉降系數(shù)不同，不同離心次數(shù)、離心力和離心時(shí)間所制備的PRP中血小板體積分?jǐn)?shù)以及各種生長(zhǎng)因子的量和活性各不相同。目前國(guó)際上尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化PRP提取方法。在諸多制備方法中Landesberg法具有血小板體積分?jǐn)?shù)高、活化率低的優(yōu)點(diǎn)，故本研究采用Landesberg法。本研究大體觀察、X線攝片及Micro-CT檢查發(fā)現(xiàn)，PRP-植骨組術(shù)后各時(shí)期骨痂形成速度、形成量均優(yōu)于單純植骨組，骨不連愈合速度明顯較單純植骨組更快，術(shù)后2、4、8、12周被破壞時(shí)的最大載荷及破壞彎矩均高于同時(shí)間單純植骨組和對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。分析原因：PRP血小板經(jīng)活化后釋放的各種生長(zhǎng)因子可以加速基質(zhì)干細(xì)胞分化，促進(jìn)成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖，加快纖維蛋白與細(xì)胞外基質(zhì)的合成[6-7]。PRP中含有高濃度白細(xì)胞，在控制感染方面具有積極意義。由于PRP源于自體，無(wú)免疫排斥，治療安全性較高。

綜上所述，在兔橈骨骨不連的治療中，在常規(guī)植骨基礎(chǔ)上配合自體PRP治療，可達(dá)到加速骨缺損修復(fù)，促進(jìn)骨愈合的效果，為臨床上PRP聯(lián)合骨移植術(shù)治療四肢長(zhǎng)骨骨不連提供一定的證據(jù)支持。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 甘文奕，謝肇，佘國(guó)榮，等. 膜誘導(dǎo)結(jié)合自體干細(xì)胞移植治療兒童股骨骨缺損1例［J］. 中國(guó)矯形外科雜志，2022，30（6）：574-576.

[2] 梁慶優(yōu)，鄧春林. 長(zhǎng)骨大段骨缺損修復(fù)材料的力學(xué)性能及制備策略［J］. 材料導(dǎo)報(bào)，2021，35（13）：13100-13108，13118.

[3] 譚洛卿，何錦安，李勝松. PRP與ESW聯(lián)合治療下肢長(zhǎng)管狀骨非感染性骨不連的研究［J］. 中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2021，16（19）：122-124.

[4] 都吉秀，陳琰，曾文娟. 富血小板纖維蛋白在自體牙即刻移植中修復(fù)重建骨缺損的效果［J］. 實(shí)用臨床醫(yī)學(xué)，2021，22（4）：53-55，58.

[5] 馮衛(wèi)華. 富血小板血漿技術(shù)結(jié)合同種異體骨移植對(duì)脛骨骨髓炎伴長(zhǎng)段骨缺損患者骨代謝及生長(zhǎng)細(xì)胞因子含量的影響［J］. 反射療法與康復(fù)醫(yī)學(xué)，2021，2（10）：66-69.

[6] 張鵬臻，李誼，胡浩磊. 富血小板血漿對(duì)促進(jìn)鼻骨缺損模型兔骨愈合的影響［J］. 中國(guó)臨床研究，2021，34（7）：900-904.

[7] 吳情，王慧慧，華洪飛，等. 自體骨聯(lián)合富血小板纖維蛋白用于埋伏阻生第三磨牙拔除后下頜第二磨牙遠(yuǎn)中骨缺損修復(fù)的隨機(jī)對(duì)照研究［J］. 口腔頜面外科雜志，2022，32（2）：100-105.

[收稿日期] 2023-08-04

（本文編輯 ? 王曉蘊(yùn)）