倪彬婷，何玉倉，李磊，徐金鈺，柳朝陽，李力群

1.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 整形外科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學 第二臨床醫(yī)學院，浙江 溫州 325035

近年來，自體脂肪移植技術在整形修復重建中有著廣泛的應用，因其良好的生物相容性，被認為是一種很好的軟組織填充材料[1]。然而，移植物液化壞死等原因，導致移植后的脂肪存活率不高[2-3]，因此提高脂肪移植成活率是目前研究的熱點之一。移植脂肪的存活主要與早期新生血管形成有關?；|血管片段（stromal vascular fraction, SVF）可促進自體脂肪移植后新生微血管的數(shù)量和發(fā)育[4]。前期進行的研究中，采用SVFs加緩釋血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）/血管生成素-1（angiopoietin-1, ANG-1）-PLGA微球改善小鼠脂肪移植存活的研究[5]證實了其在改善自體脂肪移植后的血管生成和移植物存活的應用。ANG-1是血管生成素家族的重要成員，在血管生成中起重要作用[6-7]。在內皮-周細胞共培養(yǎng)實驗中，Dickkopf-2介導的近胞素通過血管生成素-1/酪氨酸激酶受體-2（angiopoietin-1，ANG-1/tyrosine kinase receptors-2, Tie-2）信號通路改善血管生成[8]。因此，為了進一步探究SVFs促進脂肪移植后血管生成的機制，引入ANG-1/Tie-2信號通路，來探討其是否在SVFs促進脂肪移植后血管生成中發(fā)揮重要作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 4周齡雌性BALB/c-nu無胸腺裸鼠16只，購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司桐鄉(xiāng)分公司，動物許可證號：SCXK（浙）2020-0002。所有動物被安置12 h/12 h的明暗圈中，并提供充足食物和水。動物實驗均經溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準（倫理審查號：WYYYIACUC-AEC-2023-001）。

1.1.2 試劑 兔多克隆抗體CD31（28083-1-AP）、兔多克隆抗ANG-1（23302-1-ap）、小鼠單克隆抗體GAPDH（60004-1-Ig）、辣根過氧化物酶HRP標記親和純山羊抗鼠IgG（H+L，sa000001-1）和酶標親和純山羊抗兔抗體IgG（H+L，SA00001-2）購自美國Proteintech公司；兔親和分離磷酸化Tie-2 抗體

（SAB4503999）購自于美國Sigma-Aldrich公司；兔多克隆抗B淋巴細胞癌基因2（B-cell lymphoma-2,BCL-2）抗體（ab196495）、小鼠單克隆抗CD29抗體（ab30394）、小鼠單克隆抗CD31抗體（ab9498）、小鼠單克隆抗CD44抗體（ab6124）、小鼠單克隆抗CD45抗體（ab40763）、小鼠單克隆抗CD90抗體（ab23894）和647 標記的驢抗IgG二兔抗（H+L，ab150075）購自美國Abcam公司；兔源性抗BAX一抗（2772）購自美國Cell Signaling Technology公司；酪氨酸激酶抑制劑1（tyrosine kinase inhibitor 1, TKI1）（HY-100556）購自美國MedChemExpress公司。

1.2 方法

1.2.1 脂肪組織的獲取和SVFs分離 選取2023年2月溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院整形外科需接受抽脂手術的1例患者，在簽署知情同意書后，應用真空負壓吸脂術從無潛在疾病的腹部吸脂手術患者體內獲得廢棄的脂肪組織。將人體脂肪組織分成兩部分，一部分用于提取SVFs，其中部分SVFs傳代至第三代進行鑒定。脂肪組織的另一部分留存加工成微顆粒脂肪，根據(jù)所設計的體內動物實驗模型，將微顆粒脂肪分組經皮下注射到裸鼠體內，見圖1。分離SVFs詳細步驟如下：取脂肪組織在37 ℃下用0.125%的膠原酶I消化45 min，之后在DMEM培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清和0.1%青霉素終止消化。隨后使用100 μm細胞濾器去除結締組織。細胞懸液在25 ℃下通過1 200 r/min離心5 min后以獲得SVFs，最后加入紅細胞裂解緩沖液以裂解細胞懸液中的紅細胞后離心重懸，使用自動細胞計數(shù)器確保細胞密度為1×106/mL。本研究獲我院倫理委員會批準[批件號：臨床研究倫審Issuing Number（2022）第（R207）號]。

圖1 脂肪提取和加工成微顆粒脂肪和SVFs的過程示意圖

1.2.2 SVFs的培養(yǎng)和鑒定 在37 ℃含5% CO2的培育箱中孵育SVFs，每3 d更換一次培養(yǎng)基。當生長達到適當?shù)拿芏葧r進行傳代，收集第三代SVFs作進一步鑒定。具體鑒定方法：使用人分化集群CD29 （10 μg/mL）、CD31（1:20）、CD44（1×106細胞/μg）、 CD45（1:20）、CD90（1×106細胞/μg）的抗體對細胞進行標記，使用流式細胞術對細胞進行鑒定。

1.2.3 建立脂肪移植裸鼠模型 為了探討SVFs對血管生成和脂肪存活情況的影響，設置3組脂肪移植裸鼠模型。對照組移植物為0.3 mL微量脂肪混合0.2 mL DMEM；SVFs組移植物為0.3 mL微量脂肪混合0.2 mL SVFs；TKI組移植物為0.3 mL微量脂肪混合0.2 mL SVFs和1.79 μg TKI1。確認各裸鼠健康狀況良好后，所有小鼠均采用1.5%的異氟醚面罩吸入麻醉，接著對裸鼠進行脂肪移植。在每只裸鼠背部隨機選擇3個不同位置使用14G針頭皮下注射不同的混合物（每個部位0.5 mL），見圖2。麻醉清醒 后，在同等環(huán)境下飼養(yǎng)裸鼠，定時定量供給食物和水，每只裸鼠在術后8周的實驗觀察期間健康狀況良好。記錄觀察后稱體質量，采用Western blot法進行蛋白檢測，組織切片后進行組織學觀察。

圖2 移植脂肪的處理和移植物存活情況的檢測過程

1.2.4 標本收集 飼養(yǎng)至第8周，所有裸鼠用戊巴比妥鈉麻醉后處死。通過大體觀察、組織學觀察和Western blot法對獲得的脂肪組織移植物進行評估，見圖2。稱量各組每個脂肪組織團塊的重量，以進一步統(tǒng)計分析。隨后將脂肪組織在-80 ℃保存，以便進一步進行Western blot檢測。用裂解緩沖液從脂肪組織中提取總蛋白，使用放射免疫沉淀法（radioimmunoprecipitation assay, RIPA）進行進一步分析。其中裂解緩沖液中包含有勻漿緩沖液、1%蛋白酶抑制劑和1%磷酸酶抑制劑。部分脂肪組織用4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋切片，切片為5 μm厚度，用于后續(xù)免疫熒光染色和病理染色。

1.2.5 HE染色和Masson染色 HE染色為各組脂肪組織切片使用95%乙醇固定20 min，PBS洗滌2次，每次1 min。蘇木素染液染色2～3 min，自來水洗滌。浸入伊紅染液染色1 min，自來水洗滌。吹干后中性樹膠封片。然后在光學顯微鏡下觀察。 Masson染色為各組脂肪組織切片依次浸泡二甲苯I 5 min，二甲苯II 5 min，二甲苯III 5 min，無水乙醇1 min，95%乙醇1 min，75%乙醇1 min，自來水沖洗數(shù)秒；用配置好的鐵蘇木素（Weigert）染色液染色8 min；酸性乙醇分化液分化15 s后水洗； Masson藍化液返藍5 min后水洗。蒸餾水洗1 min；麗春紅品紅染色液染色5 min；弱酸工作液洗1 min； 磷鉬酸溶液洗1 min，弱酸工作液洗1 min；苯胺藍染色液染2 min，弱酸洗1 min；最后95%乙醇快速脫水2～3 s，無水乙醇脫水3次，每次5～10 s，二甲苯透明3次，每次1～2 min，中性樹膠封固。然后在光學顯微鏡下觀察。

1.2.6 免疫熒光染色 各組切片經脫蠟、梯度水化后，進行高壓抗原回收，恢復抗原活性。在磷酸鹽緩沖液中用5%牛血清白蛋白制備組織切片，在37 ℃ 下阻斷1 h。接著在4 ℃下用CD31（1:1 000稀釋）孵育過夜。組織切片用647 標記的驢抗兔IgG二抗（H+L）在37 ℃孵育2 h，然后用DAPI染色。染色后用共聚焦顯微鏡觀察組織切片，檢測指標。

1.2.7 Western blot分析 脂肪組織切片用RIPA裂解緩沖液裂解。用考馬斯亮蘭（Bradford）法定量測定脂肪組織中的蛋白質濃度。將每個蛋白樣品稀釋至40 μg/10 μL的濃度后，將樣品中的蛋白質用10%～12%的SDS-PAGE分離，將分離的蛋白質轉移到0.22 μm的聚偏氟乙烯膜上，在室溫下用5%的脫脂牛奶溶液封閉膜，之后用一抗在4 ℃下孵育過夜，前述中使用的一抗包括：GAPDH（1:1 000稀釋）、ANG-1（1:1 000稀釋）、磷酸化酪氨酸激酶受體-2（p-tyrosine kinase receptors-2, p-Tie-2）（1:1 000 稀釋）、CD31（1:1 000 稀釋）、凋亡相關蛋白BCL-2（1:1 000稀釋）、BCL-2相關蛋白X（BCL-2-associated X, BAX）（1:1 000稀釋）。用Tris緩沖鹽水和Tween?20緩沖液洗滌3次后，將膜與相應的酶標二抗在室溫下孵育2 h。使用ChemiDoc XRS成像系統(tǒng)（Bio-Rad）檢測蛋白條帶信號，使用ImageJ軟件定量條帶密度。

1.3 統(tǒng)計學處理方法

采用GraphPad Prism 9統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 人類脂肪組織中SVFs的鑒定

人體脂肪組織中提取的SVFs，傳代至第三代進行鑒定。SVFs表現(xiàn)出典型的紡錘形（梭形），見圖3A1。將SVFs誘導分化為脂肪和軟骨，結果顯示SVFs具有優(yōu)異的分化能力，見圖3A2和圖3A3。流式細胞儀檢測分析結果顯示，細胞強烈表達干細胞標記物CD29、CD44和CD90，而CD31和CD45標記物為陰性，符合SVFs的特征，見圖3B。這提示分離所得的SVFs具有良好的干細胞特性。

圖3 SVFs的分離、鑒定及成脂、成軟骨分化

2.2 SVFs對脂肪移植物大體形態(tài)的影響

裸鼠脂肪移植8 周后觀察脂肪移植體形態(tài)。SVFs組脂肪移植物略大于對照組和TKI組，見圖4A。SVFs組的移植物質量明顯大于其他兩組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），提示SVFs可促進脂肪移植物的存活。在給予TKI1后，SVFs對移植物脂肪大小和質量這一改善的過程被逆轉，TKI組脂肪移植物大小及質量均小于SVFs組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），見圖4B。這表明Tie-2可能是SVFs改善脂肪移植后血管生成和移植物存活的關鍵靶點。

圖4 各組移植脂肪組織大體形態(tài)、脂肪細胞形態(tài)及纖維化程度

2.3 SVFs對脂肪移植物組織形態(tài)的影響

HE染色顯示SVFs組的脂肪細胞比對照組更致密、更飽滿，見圖4C，說明SVFs維持了脂肪細胞的完整性，提高了脂肪移植的存活率。Masson染色顯示，與對照組比，SVFs組脂肪細胞周圍膠原沉積明顯減少，見圖4C，表明SVFs抑制了脂肪組織纖維化。在SVFs組觀察到更好的毛細血管網絡，見圖4C，表明SVFs具有巨大的血管生成潛力。對于TKI 組，Tie-2 受抑制后脂肪組織變得更加碎片化和不完整，脂肪組織纖維化程度增強。因此，SVFs組移植脂肪組織比TKI組更加飽滿，纖維化程度減低。

2.4 SVFs通過ANG-1/Tie-2信號通路改善移植脂肪的存活

Western blot結果顯示，SVFs組移植物較對照組ANG-1和p-Tie-2蛋白表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；TKI組較SVFs組ANG-1表達增加，但p-Tie-2表達減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明TKI對Tie-2產生了有效抑制，見圖5A-C。SVFs組CD31表達較對照組顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；TKI組較SVFs組CD31蛋白表達水平下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖5A和圖5D。CD31免疫熒光顯示了類似的趨勢，見圖5G。

圖5 SVFs通過ANG-1/Tie-2途徑調節(jié)脂肪移植物存活并減少細胞凋亡

2.5 SVFs抑制脂肪移植后細胞凋亡

SVFs組較對照組BAX蛋白表達降低，BCL-2蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；TKI組較SVFs組BAX蛋白表達升高，BCL-2蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖5A、5E、5F。這提示SVFs可能通過抑制細胞凋亡來提高脂肪移植的存活率。

3 討論

自體脂肪移植自1893年首次提出以來，其在整形和重建修復手術中展現(xiàn)出了巨大的潛力，臨床應用包括再生醫(yī)學、瘢痕修復、面部年輕化以及缺損組織體積修復[9]。近年來，研究人員和臨床醫(yī)師采用各種制備方法，制備如富血小板血漿（plateletrich plasma, PRP），減少免疫和炎癥反應，制備SVFs、脂肪干細胞、微脂肪和納米脂肪等促進血管生成和組織修復以提高移植脂肪的成活率[10]。

脂肪組織中包含兩種主要成分，一種是成熟的脂肪細胞，另一種就是SVFs[11]。SVFs由多種細胞組成，包括ADSCs、血管平滑肌細胞、間充質干細胞（mesenchymal stem cells, MSCs）、周細胞、成纖維細胞、內皮細胞等。SVFs具有與MSCs相似的特性，能夠分化為血管內皮細胞，并產生各種血管生成因子，包括VEGF、ANG-1、纖維母細胞生長因子（fibroblast growth factor, FGF）及肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor, HGF）等，從而促進血管生成[4]。本研究中，通過Western blot分析和免疫熒光染色結果證實了SVFs可促進脂肪移植物的血管生成，SVFs組的血管網絡比對照組更加完整。SVFs增加了移植脂肪移植物的體積和體質量，其脂肪細胞比對照組更飽滿、密度更大。SVFs還減少了膠原的沉積，改善脂肪組織的纖維化程度。這些結果均表明SVFs對脂肪移植存活有積極的影響。

脂肪移植后早期豐富的新生血管和血液再灌注對脂肪移植的預后有著重要的作用。但新生血管的形成是一個復雜的過程，受多種血管生成因子的調控，如VEGF、ANG-1和FGF等，都可以促進新生血管形成，從而提高移植物的存活率。血管的完整性和重塑是由內皮生長因子和炎癥細胞因子共同調節(jié)形成的[12]。SVFs細胞誘導新生血管改善微循環(huán)的確切機制尚不清楚。

在生理和病理條件下，ANG/Tie通路在調節(jié)血管穩(wěn)定性和血管生成中起著至關重要的作用。ANG-1主要由周細胞和血小板產生，具有多種生理功能，包括促進新生血管形成，促進血管成熟，維持血管網絡的穩(wěn)定性和完整性[13-14]。Tie-2是一種重要的膜酪氨酸激酶受體，在內皮細胞和造血干細胞中表達，并與所有4種ANG結合，在血管發(fā)育和體內平衡中起著重要作用。在胚胎發(fā)育過程中，ANG/Tie-2信號通路參與了血管和淋巴管的重塑和成熟[15]。在生理條件下，ANG-1通過結合和磷酸化Tie-2受體激活下游信號，促進細胞間連接，增強內皮細胞存活，從而維持血管穩(wěn)定和正常血管功能[16-17]。在血管生成過程中，ANG-1激活Tie-2，促進內皮細胞的遷移，促進血管缺失區(qū)域的血管發(fā)育，從而恢復缺血區(qū)域的腦灌注[18]。過表達ANG-1的人骨髓MSCs可改善腦缺血后的血管結構和功能[19]。這些研究表明ANG-1可能是SVFs和血管生成之間的關鍵靶點[20]。 在本研究中，通過Western blot檢測結果發(fā)現(xiàn)，SVFs組移植物較對照組上調了ANG-1和p-Tie-2蛋白的表達水平，血管生成相關蛋白CD31表達較對照組顯著增加，且SVFs組脂肪移植物中也有更好的毛細血管網絡，這些證據(jù)表明SVFs通過上調ANG-1/Tie-2的表達進一步促進移植物脂肪的血管生成。

Tie-2 是ANG家族的經典受體，它是一種酪氨酸激酶受體。ANG-1磷酸化Tie-2，導致磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositide 3-kinases, PI3K/protein kinase B, PKB）依賴性轉錄因子FOXO1的磷酸化，觸發(fā)其核排斥和降解，增加促進血管穩(wěn)定的基因表達[21]。利用TKI作為抑制劑抑制Tie-2的活性，下調Tie-2的磷酸化水平。發(fā)現(xiàn)SVFs對脂肪移植物的保護作用在抑制Tie-2活性后被逆轉。TKI組脂肪移植物體積和質量減小。HE染色見脂肪細胞肥厚且分散。Masson染色見膠原沉積加重，纖維化水平增強。同時，對相關蛋白指標的表達水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)TKI處理后抑制了SVFs上調p-Tie-2和CD31的表達，而ANG-1的表達則進一步增強。提示p-Tie-2的缺乏會抑制血管生成，而脂肪移植迫切需要新生血管，因此導致了ANG-1的積累。但結果表明ANG-1 富集未能維持移植脂肪的存活。通過對凋亡相關蛋白表達的檢測發(fā)現(xiàn)，SVFs抑制了脂肪移植物的凋亡，而TKI組則顯示凋亡過程的加重。這一系列結果提示SVFs可能通過ANG-1/Tie-2信號通路促進血管生成，保護移植脂肪，提高存活，抑制凋亡，見圖6。綜上所述，本研究表明SVFs可以通過ANG-1/Tie-2信號通路促進血管生成，抑制細胞凋亡，從而提高脂肪移植的存活率。本研究為臨床提高移植脂肪的成活率和軟組織修復提供了新的理論依據(jù)。

圖6 SVFs通過ANG-1/Tie-2信號通路發(fā)揮血管再生和抗凋亡作用