梁玉梅 陳維憲 黃群鋒

(1.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院藥學(xué)部,廣東 廣州 510260; 2.廣州市番禺區(qū)婦幼保健院藥劑科,廣東 廣州 511400;3.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院腫瘤科,廣東 廣州 510700)

肝纖維化是肝臟在受到外界刺激后發(fā)生的自我修復(fù)和傷口愈合,導(dǎo)致肝臟中細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度產(chǎn)生和沉積[1-2]。肝纖維化病程遷延而可逆,若無(wú)積極有效干預(yù)措施可進(jìn)展為肝硬化,進(jìn)而引發(fā)肝衰竭、肝性腦病、胃食管靜脈曲張破裂出血等一系列嚴(yán)重并發(fā)癥,給患者造成極大痛苦和死亡風(fēng)險(xiǎn),同時(shí)也給社會(huì)帶來(lái)了巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此,肝纖維化的早期診斷和有效干預(yù)尤為重要,其確診有賴于肝纖維化分子基礎(chǔ)的研究。相關(guān)的臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明,肝損傷消除后可能會(huì)出現(xiàn)纖維化消退[3-4]。肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cell,HSCs)的活化是肝纖維化發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),激活過(guò)程的特征是表型從靜止的富含維生素A的表型轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞的纖維化表型[5]。

許多具有抗氧化作用的人工和天然制劑已被建議用于治療和預(yù)防過(guò)度氧化應(yīng)激引起的肝病[6]。因此,補(bǔ)充抗氧化劑對(duì)人體健康有益。谷胱甘肽(Glutathione,GSH)是一種內(nèi)源性三肽,肝臟是其含量最高的組織之一。補(bǔ)充內(nèi)源性谷胱甘肽的有效方法是使用S-酰基前藥,如S-乙?；?谷胱甘肽(S-acetyl-glutathione,SAG),其能夠穿過(guò)細(xì)胞膜并增加細(xì)胞內(nèi)SH基團(tuán)[7]。與直接進(jìn)入細(xì)胞的GSH不同,SAG在血漿中更穩(wěn)定,一旦進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),就會(huì)被細(xì)胞質(zhì)硫酯酶轉(zhuǎn)化為GSH。特別是,硫原子的乙酰化避免了谷胱甘肽的分解,并簡(jiǎn)化了其通過(guò)腸壁的吸收[8]。四氯化碳(Carbon tetrachloride,CCl4)誘導(dǎo)的肝損傷被廣泛用于人類肝臟疾病的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃丸b定潛在的肝保護(hù)劑。目前已經(jīng)證實(shí),靶向Nrf2-ARE信號(hào)通路可以保護(hù)肝臟免受CCl4誘導(dǎo)的損傷[9]。據(jù)報(bào)道,海地瓜中的膠原蛋白肽通過(guò)Keap1/Nrf2-ARE、PI3K/AKT和MAPKs途徑預(yù)防CCl4誘導(dǎo)的肝損傷[10]。紅松松仁多糖PNP40c-1通過(guò)NRF2/ARE/MKP1/JNK信號(hào)通路對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷發(fā)揮肝臟保護(hù)作用[11]?；谶@些研究,我們猜想谷胱甘肽通過(guò)Nrf2/ARE通路改善CCl4誘導(dǎo)大鼠肝損傷和肝纖維化。本研究建立了CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝損傷和纖維化的假設(shè)來(lái)驗(yàn)證谷胱甘肽對(duì)肝損傷、膠原蛋白產(chǎn)生、HSC活化和體內(nèi)氧化應(yīng)激的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 CCl4、GSH購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(中國(guó)),qRT-PCR引物購(gòu)自北京擎科生物科技股份有限公司(中國(guó)),ALT、AST、ALP、羥脯氨酸測(cè)定試劑盒、LPO、MDA、GSH檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所,IL-6、TNF-a和IL-1β ELISA測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Millipore公司,一抗anti-α-SMA、anti-α1(I)procollagen、anti-fibronectin、anti-TGF-βR1、anti-PDGF-βR、anti-EGFR、anti-Nrf2、anti-ARE和anti-β-actin購(gòu)自Abcam公司,細(xì)胞色素P450 2E1(CYP2E1)活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海臻科生物科技有限公司。

1.2 動(dòng)物模型構(gòu)建 雄性SD大鼠(體重180～220 g)購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。參考前述研究進(jìn)行[12],用CCl4(0.1 mL/100 g體重)和橄欖油[1∶1(w/v)]的混合物誘導(dǎo)大鼠肝損傷。將32只大鼠按照配對(duì)比較法隨機(jī)分為4組,每組8只。第1組為對(duì)照組,大鼠腹腔注射橄欖油,未注射CCl4或GSH。第2組為CCl4組,大鼠腹腔注射CCl4,未經(jīng)GSH處理。第3組為低劑量治療組,大鼠靜脈注射CCl4,并灌胃50 mg/kg GSH。第4組為高劑量治療組,大鼠靜脈注射CCl4,并灌胃100 mg/kg GSH。第2至4組大鼠每隔一天腹腔注射CCl4,持續(xù)8周。將GSH溶于橄欖油中,在第5至8周每天灌胃一次。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),大鼠經(jīng)腹腔注射戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉后處死。采集血液,分離肝臟并稱重。實(shí)驗(yàn)期間,所有大鼠生長(zhǎng)良好,未出現(xiàn)死亡。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：AEWC-2201061)。

1.3 肝組織病理學(xué)分析 參考前所述進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色和天狼星紅染色[13],分析肝組織切片的病理變化。

1.4 肝細(xì)胞色素P450 2E1(CYP2E1)活性的測(cè)定 將0.1 mL樣品添加到含有70 mM Tris-HCl(pH 7.4)、10.0 mM氨基脲、14 mM MgCl2、215 mM KCl和4 mM NADPH的混合物中,最終體積為1.0 mL。在37 ℃下孵育混合物30 min,之后通過(guò)添加1.5 mL 12.5%三氯乙酸來(lái)終止反應(yīng)。在2000 rpm離心1.5 min后,將2 mL上清液與1.0 mL含有6 M乙酸銨、60 mM乙酰丙酮和0.15 M乙酸的NASH試劑混合。然后將試管在70 ℃下孵育20 min,并在415 nm處測(cè)量形成的六氯環(huán)己烷。CYP2E1活性以每分鐘每毫克蛋白質(zhì)的納摩爾數(shù)表示。

1.5 ELISA檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)水平 收集大鼠的血清樣本,使用ELISA試劑盒檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)的水平;用ELISA試劑盒檢測(cè)IL-6、TNF-a和IL-1β水平。

1.6 肝組織羥脯氨酸的測(cè)定 將從每只大鼠肝臟隨機(jī)切下的三小塊肝組織在110 ℃的6N HCl中水解24 h,隨后用NaOH中和。在水解產(chǎn)物的等分試樣中加入檸檬酸鹽緩沖氯胺T中的異丙醇,然后加入Ehrlich試劑。在60 ℃的避光條件下孵育25 min。離心后,使用96孔板光譜儀在558 nm處讀取每個(gè)樣品的上清液的吸光度。

1.7 qRT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)水平 通過(guò)Trizol法進(jìn)行總RNA提取,PrimeScript RT Reagent Kit(Takara,Japan)用于cDNA合成,隨后使用SYBR Green PCR Kit(Takara,Japan)進(jìn)行qRT-PCR分析檢測(cè)基因表達(dá),β-actin分別作為檢測(cè)目的基因表達(dá)量的內(nèi)參,引物序列見(jiàn)表1。使用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.8 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 肝臟樣品在含有蛋白酶抑制劑的放射免疫沉淀分析(RIPA)緩沖液中勻漿。使用BCA檢測(cè)試劑盒(Pierce,USA)測(cè)定蛋白水平,蛋白質(zhì)通過(guò)十二烷基硫酸鈉(SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離,轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore,USA)上,用含0.1%吐溫20的Tris緩沖鹽水的5%脫脂奶粉封閉。通過(guò)相應(yīng)的一級(jí)抗體和隨后的辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二級(jí)抗體檢測(cè)目標(biāo)蛋白。使用化學(xué)發(fā)光試劑(Millipore,USA)對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行可視化。

1.9 檢測(cè)脂質(zhì)過(guò)氧化(LPO)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)的水平 使用LPO、MDA和GSH檢測(cè)試劑盒分別測(cè)定肝臟組織中LPO、MDA和GSH水平。

2 結(jié)果

2.1 谷胱甘肽保護(hù)大鼠肝臟免受CCl4誘導(dǎo)的損傷 HE染色結(jié)果顯示,CCl4治療誘導(dǎo)了嚴(yán)重的肝損傷,表現(xiàn)為彌漫性小葉中心壞死伴全小葉炎癥,而谷胱甘肽預(yù)處理減輕了CCl4誘導(dǎo)的壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),見(jiàn)圖1A;在CCl4治療的大鼠血清中ALT、AST和ALP水平顯著升高,谷胱甘肽劑量依賴性地降低了血清ALT、AST和ALP水平,并且高劑量的谷胱甘肽在降低血清ALT、ALT和ALP水平方面更為顯著(P<0.05),見(jiàn)圖1B;CCl4處理后,大鼠肝臟CYP2E1活性被激活,而谷胱甘肽顯著降低CYP2E1的活性(P<0.05),見(jiàn)圖1C;CCl4導(dǎo)致大鼠血清中IL-6、TNF-a和IL-1β的顯著增加,而谷胱甘肽治療顯著逆轉(zhuǎn)了這一結(jié)果(P<0.05),見(jiàn)圖1D。綜上提示,谷胱甘肽可以改善CCl4注射引起的肝損傷。

圖1 谷胱甘肽保護(hù)大鼠肝臟免受CCl4誘導(dǎo)的損傷

2.2 谷胱甘肽可以降低CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝臟中膠原蛋白表達(dá) 天狼星紅染色檢測(cè)大鼠肝臟中膠原蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示,在CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝臟中膠原蛋白嚴(yán)重沉積,并伴有結(jié)節(jié)形成,谷胱甘肽可以逆轉(zhuǎn)這一影響(圖2A);α1(I)型前膠原(α1(I)procollagen)的免疫熒光染色顯示類似的結(jié)果(圖2B),表明谷胱甘肽減少了纖維化肝臟中的α1(I)型前膠原表達(dá)。肝羥脯氨酸的測(cè)定結(jié)果顯示,谷胱甘肽以劑量依賴顯著降低了纖維化肝臟中羥脯氨酸的含量(圖2C),表明纖維化肝臟中膠原蛋白的積累減少(P<0.05)。綜上提示,谷胱甘肽可以通過(guò)抑制大鼠膠原的表達(dá)來(lái)減弱CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化。

圖2 谷胱甘肽可以降低CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝臟中膠原蛋白表達(dá)

2.3 谷胱甘肽抑制CCl4引起的大鼠纖維化肝臟中HSC的活化 qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,α-SMA、α1(I) procollagen、fibronectin、TGF-βR1、PDGF-βR和EGFR在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)顯著增加,表明纖維化肝臟中HSC過(guò)度活化。然而,谷胱甘肽治療以劑量依賴性地降低了這些標(biāo)記物的mRNA和蛋白表達(dá)(P<0.05),見(jiàn)圖3。綜上提示,谷胱甘肽抑制了CCl4引起的大鼠纖維化肝臟中HSC的激活。

圖3 谷胱甘肽抑制CCl4引起的大鼠纖維化肝臟中HSC的活化

2.4 谷胱甘肽減輕CCl4引起的大鼠纖維化肝臟氧化應(yīng)激 為了評(píng)估谷胱甘肽對(duì)體內(nèi)氧化應(yīng)激的影響,我們測(cè)定了肝組織勻漿中LPO和MDA的水平。CCl4的處理顯著增加了大鼠肝臟LPO和MDA的水平,但谷胱甘肽的治療以劑量依賴的方式降低了LPO和MDA的水平(P<0.05),見(jiàn)圖4A、B;我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)CCl4處理的大鼠肝臟GSH水平顯著降低,但是通過(guò)谷胱甘肽處理以劑量依賴的方式得到改善(P<0.05),見(jiàn)圖4C。提示谷胱甘肽減輕了CCl4給藥引起的大鼠纖維化肝臟的氧化應(yīng)激。

圖4 谷胱甘肽減輕CCl4引起的大鼠纖維化肝臟氧化應(yīng)激

2.5 谷胱甘肽促進(jìn)Nrf2/ARE通路的活性 為了研究Nrf2/ARE信號(hào)通路是否參與谷胱甘肽對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷的保護(hù)作用,我們檢測(cè)了Nrf2和ARE在CCl4誘導(dǎo)大鼠肝組織中的表達(dá)。結(jié)果表明,CCl4處理顯著降低了Nrf2和ARE的表達(dá),而谷胱甘肽顯著提高Nrf2和ARE的表達(dá)(圖5A),以上結(jié)果提示Nrf2/ARE信號(hào)通路可能參與了谷胱甘肽對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷的保護(hù)作用。為了進(jìn)一步證實(shí)谷胱甘肽對(duì)CCl4誘導(dǎo)大鼠肝組織Nrf2/ARE信號(hào)通路的影響,我們檢測(cè)了Nrf2下游抗氧化基因的表達(dá)。結(jié)果顯示,CCl4處理后降低的GST、GCLc、NQO1和HO-的表達(dá),而在谷胱甘肽處理后明顯逆轉(zhuǎn)這一結(jié)果(P<0.05),見(jiàn)圖5B～E,進(jìn)一步驗(yàn)證了谷胱甘肽可以改善CCl4誘導(dǎo)的大鼠纖維化肝臟氧化應(yīng)激。

圖5 谷胱甘肽促進(jìn)Nrf2/ARE通路的活性

3 討論

CCl4誘導(dǎo)肝損傷模型已被廣泛應(yīng)用于肝臟病理研究,其形態(tài)學(xué)和生化特征與人類肝臟疾病細(xì)胞病變相似[14]。CCl4處理后大鼠肝臟細(xì)胞色素P450被激活,然后產(chǎn)生三氯甲基自由基,與細(xì)胞大分子共價(jià)偶聯(lián),從而影響細(xì)胞功能;產(chǎn)生的CCl3攻擊肝細(xì)胞膜上的磷脂分子,引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),并破壞肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性。與此同時(shí),肝組織中SOD、MDA和其他相關(guān)脂質(zhì)過(guò)氧化指數(shù)的水平發(fā)生改變,最終導(dǎo)致肝功能受損[15]。刺激肝細(xì)胞向血液中釋放各種酶,包括ALT、AST和ALP,這是肝細(xì)胞損傷的標(biāo)志物[16]。除了上述反應(yīng)外,CCl4還會(huì)引起體內(nèi)炎癥,導(dǎo)致血液中的炎性細(xì)胞因子(IL-6和TNF-α)和肝組織中的炎癥細(xì)胞因子(COX-2和PGE2)發(fā)生變化[17]。在代謝組學(xué)方面,CCl4被人體吸收后,細(xì)胞色素P450水平升高,導(dǎo)致一系列脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),造成三羧酸循環(huán)紊亂,其他相關(guān)途徑也受到影響[18]。本文研究了谷胱甘肽對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷大鼠肝組織病理變化和肝臟指標(biāo)的影響。結(jié)果表明,谷胱甘肽可以降低大鼠血液中的ALT、AST、ALP、TNF-α、IL-6和IL-1β水平。

HSC活化是肝纖維化過(guò)程中的關(guān)鍵步驟,因?yàn)榛罨腍SC是膠原和其他細(xì)胞外基質(zhì)成分的主要來(lái)源。HSC激活的過(guò)程伴隨著一系列標(biāo)志蛋白的上調(diào)表達(dá)[19]?；罨疕SC的減少可能導(dǎo)致膠原的產(chǎn)生和沉積減少;另一方面,HSC的激活是由各種細(xì)胞因子和趨化因子觸發(fā)的,包括TGF-β、PDGF和EGF,從枯否氏細(xì)胞、竇內(nèi)皮細(xì)胞和活化的HSC自身釋放[20]。HSC的激活過(guò)程與相應(yīng)受體的上調(diào)有關(guān),包括TGF-βR1、PDGF-βR和EGFR。本研究結(jié)果顯示,谷胱甘肽抑制了CCl4大鼠模型中促纖維化受體的表達(dá),表明谷胱甘肽可以阻斷TGF-β、PDGF和EGF通路,從而抑制體內(nèi)HSC的激活。此外,許多研究表明,HSC中的膠原表達(dá)受到這些促纖維化級(jí)聯(lián)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[21-23]。因此,可以推測(cè)谷胱甘肽減少膠原生成可能是這些級(jí)聯(lián)的中斷所致,有助于抗纖維化的功效。

越來(lái)越多的研究表明,氧化應(yīng)激與不同病因的肝纖維化有關(guān)。CCl4在肝臟中的代謝導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化和ROS的產(chǎn)生,ROS可以引發(fā)氧化應(yīng)激過(guò)程[24]。在本研究中,我們證實(shí)了CCl4損傷肝臟的氧化應(yīng)激增強(qiáng),表現(xiàn)為L(zhǎng)PO和MDA水平顯著升高。然而,谷胱甘肽顯著消除了大鼠肝臟中LPO和MDA水平的增加,表明氧化應(yīng)激減弱。此外,氧化應(yīng)激可能代表HSC激活的直接或間接促纖維化刺激[25-26]。氧化應(yīng)激的現(xiàn)象伴隨或先于HSC活化和膠原沉積。有證據(jù)表明,培養(yǎng)的人或大鼠HSC暴露于促氧化系統(tǒng)或經(jīng)歷氧化應(yīng)激的肝細(xì)胞釋放的產(chǎn)物的培養(yǎng)基后,I型前膠原基因的表達(dá)和合成增加[27]。此外,谷胱甘肽是最豐富的非酶抗氧化劑,在氧化還原系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽有效地逆轉(zhuǎn)了纖維化肝臟中GSH含量的減少,表明GSH的恢復(fù)可能是谷胱甘肽抗纖維化作用的重要機(jī)制之一。

先前研究報(bào)道Nrf2/ARE通路參與CCl4誘導(dǎo)的肝損傷[28]。據(jù)報(bào)道,鮭魚(yú)精子DNA通過(guò)Nrf2/ARE和線粒體凋亡途徑預(yù)防CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷[9]。Han等[29]發(fā)現(xiàn)黃連素通過(guò)調(diào)節(jié)Nrf2-Keap1-ARE和p53信號(hào)通路改善CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝損傷。另一項(xiàng)研究報(bào)道熊果酸通過(guò)Nrf2/ARE通路改善CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化[30-32]。本研究的結(jié)果顯示CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝臟中Nrf2和ARE的表達(dá)受到抑制,而谷胱甘肽可以恢復(fù)Nrf2/ARE通路活性,揭示谷胱甘肽可能通過(guò)激活Nrf2/ARE通路改善CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝損傷和肝纖維化。

4 結(jié)論

谷胱甘肽在體內(nèi)保護(hù)大鼠肝臟免受CCl4引起的損傷和纖維化,這些作用可能與抑制HSC活化和減輕肝臟氧化應(yīng)激有關(guān);此外,其還可能通過(guò)激活Nrf2/ARE通路改善CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝損傷和肝纖維化。