楊春生，王添興，張鐵成，武恒敏，王寶蘭*

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1.康復(fù)醫(yī)學(xué)科；2.關(guān)節(jié)外科，新疆 烏魯木齊 830000

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種嚴重危害人類身心健康的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病。既往研究報告指出,到2020年全球40歲以上人群的患病率為22.9%[1]。除了個人負擔(dān)外,骨關(guān)節(jié)炎的社會經(jīng)濟成本也是相當(dāng)可觀的。據(jù)報道,骨關(guān)節(jié)炎是影響70歲以上人群殘疾生活年限的十大主要病因之一,影響了這個年齡組三分之一的人,并且在所有年齡段中排名第14位[2]。已知OA的發(fā)病由多種因素引起。本文關(guān)注到生物鐘和細胞周期紊亂會導(dǎo)致許多亞健康狀況和疾病,如肥胖、糖尿病、骨關(guān)節(jié)炎和心血管疾病等[3]。

生物鐘(biological clock)晝夜節(jié)律周期和細胞周期(cell cycle)是機體的兩個基本的生命周期,周期在1 d范圍內(nèi),可相互影響。生物鐘基因可驅(qū)動軟骨穩(wěn)態(tài)關(guān)鍵基因如MMP13、COL2A1和IHH的節(jié)律性表達,并可直接或間接控制多個細胞周期基因的表達,如WEE1、CDKN1A、Cyclin E 和Cyclin B等。與生物鐘晝夜節(jié)律周期類似,細胞周期也是一個嚴格調(diào)控的系統(tǒng),細胞周期調(diào)節(jié)蛋白異常,可影響細胞周期正常進程,從而引發(fā)疾病,如CCND1、CDK1和CCNB1、WEE1、CDKN1A蛋白表達異常,可影響軟骨細胞正常分裂、增殖和分化,引起細胞凋亡,發(fā)生骨關(guān)節(jié)炎[4]。然而,軟骨細胞中時鐘基因Bmal1和細胞周期的內(nèi)在平衡關(guān)系,調(diào)控細胞周期的機制并不是完全清楚。本文主要探討軟骨細胞中Bmal1和細胞周期相關(guān)基因的關(guān)系,及其對細胞周期的調(diào)控作用,進一步探究和OA發(fā)病相關(guān)的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞: 小鼠畸胎瘤 ATDC5細胞系,用于軟骨分化誘導(dǎo)(南京科佰生物科技有限公司)。

1.1.2 試劑及試劑盒 :DMEM/F12 培養(yǎng)基(Gibco公司);胎牛血清(BioInd公司);胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒(insulin-transfering-selenium, ITS,Sigma-Aldrich公司);IL-1β(PeproTech Inc公司);LV-Bmal1(21735-1)和病毒感染試劑(上海吉凱基因技術(shù)有限公司);一抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司);β-actin、細胞周期檢測試劑盒(武漢塞維爾生物科技有限公司);蛋白裂解液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒和annexin PE/7-AAD凋亡檢測試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司);引物(上海生工生物工程股份有限公司);SYBR Green PCR試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 ATDC5細胞的培養(yǎng)與誘導(dǎo): 將ATDC5細胞置于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的完全培養(yǎng)基(DMEM/F12)中,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞匯聚度達到 30%～40% 時,將完全培養(yǎng)基替換成含有ITS的誘導(dǎo)培養(yǎng)基,進行ATDC5細胞的成軟骨誘導(dǎo)[5]。每2 d更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基1次, 誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d成為軟骨樣ATDC5細胞。連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)的0、7、14和21 d,通過PCR測定誘導(dǎo)的ATDC5細胞內(nèi)Ⅱ型膠原(collagen type Ⅱ, Col Ⅱ)和Ⅹ型膠原(collagen type Ⅹ, Col Ⅹ)的mRNA表達情況,明確軟骨樣ATDC5細胞誘導(dǎo)是否成功。將ITS誘導(dǎo)培養(yǎng)基更換為含有IL-1β的完全培養(yǎng)基,IL-1β的濃度為10 ng/mL,誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h成為OA軟骨樣ATDC5細胞。PCR檢測IL-1β誘導(dǎo)后細胞Il-6、Tnf-α的mRNA表達量,確定OA軟骨樣ATDC5細胞誘導(dǎo)成功。

1.2.2 穩(wěn)定感染BMAL1慢病毒的軟骨樣ATDC5細胞株建立和誘導(dǎo):ATDC5細胞成軟骨誘導(dǎo)過程中,按照上海吉凱基因技術(shù)有限公司推薦的方案,根據(jù)感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI),待細胞匯聚度達到 30%,加入相應(yīng)劑量的病毒和感染增強試劑。48 h后細胞匯聚度達到 80%～90%,熒光顯微鏡下觀察細胞熒光情況。細胞明顯感染病毒后加入嘌呤霉素,濃度為 3 μg/mL,進行穩(wěn)定感染病毒的細胞篩選,傳代后用于后續(xù)實驗。PCR檢測感染后細胞Bmal1的mRNA表達量,評估感染效果。

1.2.3 細胞分組:將ITS誘導(dǎo)的軟骨樣ATDC5細胞設(shè)定為正常組(normal),OA軟骨樣ATDC5細胞為骨關(guān)節(jié)炎組(osteoarthritis,OA), 慢病毒Bmal1過表達的軟骨樣ATDC5細胞設(shè)定為慢病毒Bmal1組(LentivirusBmal1,LV-Bmal1)。

1.2.4 CCK8法:將細胞按實驗分組接種于96孔板中(100 μL/孔) ,每孔加入10 μL的 CCK-8溶液,于培養(yǎng)箱中孵育1 h,用酶標儀測定各組細胞在 450 nm處的吸光度。

1.2.5 RT-qPCR :將各組ATDC5細胞提取的mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,進行基因擴增。根據(jù)Bmal1、Wee1、Per1、Cdk1、Ccnb1、Mmp13檢測結(jié)果的Ct值,計算相對表達量后分組比較,并根據(jù)mRNA的表達量,進行相關(guān)性分析。

1.2.6 Western blot:各組的ATDC5細胞采集后加入RIPA裂解液和蛋白質(zhì)磷酸酶抑制劑,在冰上提取細胞總蛋白,BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。電泳分離、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉后添加一抗,在4 ℃下過夜。第2天,加二抗孵育、化學(xué)發(fā)光成像。用Image J軟件進行灰度值分析,計算蛋白質(zhì)相對表達量。

1.2.7 流式細胞測量術(shù)檢測細胞周期和凋亡

1.2.7.1 細胞周期檢測:將細胞和細胞懸液加入15 mL離心管,離心收集細胞后,用預(yù)冷的75%乙醇重懸細胞,在4 ℃過夜固定。第2天,將過夜的細胞離心棄上清。加入1 mL的PBS混勻,離心后收集細胞并重懸。加入RNaseA后,37 ℃水浴30 min。加入的 PI染色液避光染色。流式細胞儀進行檢測。

1.2.7.2 細胞凋亡檢測:收集培養(yǎng)的細胞置于離心管內(nèi),離心沉淀細胞后吸除上清,加入預(yù)冷的 PBS重懸細胞,再次離心沉淀細胞,吸除上清;去離子水稀釋結(jié)合緩沖液,用結(jié)合緩沖液重懸細胞,調(diào)節(jié)其濃度為1×106～5×106/mL,取 100 μL 的細胞懸液于流式檢測管中,加入annexin V/PE 混勻后于室溫避光孵育,加入7AAD和PBS,立刻檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ATDC5細胞的誘導(dǎo)和誘導(dǎo)后慢病毒感染驗證

Ⅱ型膠原在ITS誘導(dǎo)后,第7天mRNA表達量明顯增高,14 d達峰值,提示ATDC5細胞系向軟骨分化的早期階段。Ⅹ型膠原的mRNA表達量自誘導(dǎo)后逐漸增加,21 d時表達量達到峰值,提示ATDC5細胞系向軟骨分化的晚期階段(表1)。IL-1β誘導(dǎo)后的軟骨樣ATDC5細胞,Il-6、Tnf-α的mRNA表達量明顯上升,出現(xiàn)炎性表型(P<0.05)(表2)。Bmal1慢病毒感染后的軟骨樣ATDC5細胞,Bmal1的mRNA表達量明顯升高(P<0.05)(表2)。

表1 軟骨樣ATDC5細胞誘導(dǎo)Table 1 The inducted differentication of chondrocyte-like cell of ATDC5

表2 OA軟骨樣ATDC5細胞誘導(dǎo)和軟骨樣ATDC5細胞感染Bmal1過表達慢病毒

2.1 CCK8法檢測細胞活力

相對于normal組,OA組細胞活力提高,LV-Bmal1組細胞活力下降,P值均≤0.05(表3)。

表3 CCK8細胞活力測定

2.2 RT-qPCR檢測和相關(guān)性分析

在OA軟骨樣ATDC5細胞中,和normal組相比,OA組中Bmal1、Wee1的mRNA相對表達量下降,Per1、Cdk1、Ccnb1和Mmp13的mRNA相對表達量明顯增加;而LV-Bmal1組中Bmal1、Wee1的mRNA相對表達量升高,Per1、Cdk1、Ccnb1和Mmp13的mRNA相對表達量下降(表4)。相關(guān)性分析顯示,Bmal1與Wee1存在正相關(guān),二者與Per1、Cdk1、Ccnb1、Mmp13存在負相關(guān),Per1、Cdk1、Ccnb1、Mmp13之間存在正相關(guān)(圖1),P值均<0.05。結(jié)果表明,Bmal1可能對Wee1有正向調(diào)控作用,對Per1、Cdk1、Ccnb1和Mmp13有負向調(diào)控作用。

Red represents positive correlation; Blue represents negative correlation; 0-0.19.very weak correlation or no correlation; 0.2-0.39.weak correlation; 0.4-0.59.moderate correlation; 0.6-0.79.strong correlation; 0.8-1.0.highly correlated.

表4 Bmal1、Wee1、Per1、Cdk1、Ccnb1和Mmp13的mRNA相對表達量Table 4 Relative mRNA expression of Bmal1, Wee1, Per1, Cdk1, Ccnb1 and

2.3 Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達

與normal組相比,OA組中BMAL1、WEE1相對表達水平下降,PER1、CDK1、CCNB1和MMP13相對表達水平增高; LV-Bmal1組中BMAL1 和WEE1相對表達強度升高,PER1、CDK1、CCNB1和MMP13相對表達水平下降(表5,圖2),P值均<0.05。進一步驗證了Bmal1對Wee1有正向調(diào)控作用,對Per1、Cdk1、Ccnb1和Mmp13有負向調(diào)控作用。

圖2 免疫印跡法檢測BMAL1、PER1、CDK1、CCNB1、WEE1和MMP13的表達Fig 2 Western blot was used to detect the expression of BMAL1, PER1, CDK1, CCNB1, WEE1 and MMP13

表5 免疫印跡法半定量分析BMAL1、PER1、CDK1、CCNB1、WEE1和MMP13的表達

2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞周期和凋亡

和normal組比,OA組中S期和G2/M期縮短,細胞比例明顯下降,早期和晚期凋亡細胞比例明顯增加; LV-Bmal1組的S期和G2/M期延長,細胞比例增加,早期和晚期凋亡細胞比例下降(P<0.05)(表6,圖3, 4)。

圖3 流式細胞測量術(shù)檢測不同處理的軟骨樣ATDC5細胞的細胞周期Fig 3 Flow cytometry was used to detect the cell cycle of chondrocyte-like ATDC5 cells treated with different methods

圖4 流式細胞術(shù)檢測不同處理后的軟骨樣ATDC5細胞的細胞凋亡Fig 4 Apoptosis of chondrocyte-like ATDC5 cells after different treatments detected with flow cytometry

表6 流式細胞術(shù)半定量分析細胞周期和凋亡Table 6 Semi-quantitative analysis of cell cycle and apoptosis by flow

3 討論

BMAL1作為生物鐘核心協(xié)調(diào)者,是調(diào)節(jié)生物節(jié)律的重要轉(zhuǎn)錄因子,對包括骨、軟骨和牙齒在內(nèi)的硬組織發(fā)育是不可或缺的,在間充質(zhì)干細胞終末分化的骨細胞和軟骨細胞中都有表達[6]。Bmal1可通過與Clock形成的復(fù)合物直接結(jié)合腫瘤細胞中Wee1基因啟動子,而促進其轉(zhuǎn)錄,同時Bmal1可誘導(dǎo)肝臟中Wee1的 mRNA 合成, 促進Wee1的表達,當(dāng)Bmal1敲除時,Wee1表達下調(diào)[7-8]。WEE1是G2檢查點激酶-細胞周期調(diào)節(jié)因子,可通過介導(dǎo)Thr14和Tyr-15上 CDK1 的磷酸化位點,保護細胞核免受 CDK1-CyclinB1復(fù)合物的影響,充當(dāng)有絲分裂(G2-M)的負調(diào)節(jié)因子。而CDK1和CCNB1常以復(fù)合物的形式共同調(diào)控細胞周期G2到M期轉(zhuǎn)變,控制細胞周期進展,是細胞增殖、分裂、分化和凋亡的重要調(diào)節(jié)因子。正常情況下,DNA 損傷時,WEE1通過CDK1 磷酸化調(diào)節(jié) G2/M 檢查點來負性調(diào)節(jié)細胞進入有絲分裂,使細胞有充足時間修復(fù)受損的 DNA,為細胞提供有利的生存環(huán)境[9]。當(dāng)WEE1 抑制時, G2/M 檢查點的功能消失或缺陷,會使細胞無視是否存在 DNA 損傷,提前通過 G2/M檢測點,進入程序外有絲分裂,導(dǎo)致有絲分裂災(zāi)難及細胞凋亡[10-11]。CDK1活性增加時,可以破壞Bcl-2家族蛋白的抗凋亡功能,細胞有絲分裂加快并部分轉(zhuǎn)換為凋亡[12];而在星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞中,下調(diào)CDK1的活性,可抑制神經(jīng)元的自噬和凋亡[13]。此外,CCNB1的高活性可引起細胞周期紊亂,在有絲分裂時導(dǎo)致細胞死亡機制的激活[14]。本研究中發(fā)現(xiàn),BMAL1在軟骨細胞中可正向調(diào)控WEE1的活性,并間接負向影響CDK1和CCNB1的表達。當(dāng)BMAL1表達下降時,WEE1的活性下降,G2檢查點的功能減弱或消失,而CDK1和CCNB1保持高活性,細胞活力增加,此時細胞不能正常退出S期和G2/M期,DNA復(fù)制和有絲分裂期縮短,致使細胞周期進程加速,細胞損傷后沒有充足時間修復(fù),最終發(fā)生凋亡和轉(zhuǎn)化的細胞增加,或繼發(fā)有絲分裂災(zāi)難,細胞死亡、衰老加快。

綜上所述,時鐘基因Bmal1與細胞周期相關(guān)基因在OA中緊密耦合,在此次的研究中得到驗證,并推測,BMAL1、WEE1可能為OA的保護因素,PER1、CDK1、CCNB1、MMP13可能為OA危險因素,它們共同影響OA的發(fā)生和進展。