魏 斌，段紅杰，柴家科*

1.中國人民解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學中心 燒傷整形醫(yī)學部，北京 100048；2.中國人民武裝警察部隊北京總隊醫(yī)院 外一科，北京 100027

代謝組學定性和定量分析細胞特定時期的所有低分子量代謝產(chǎn)物(包括小分子底物、中間產(chǎn)物及終產(chǎn)物),是系統(tǒng)生物學的重要組成部分,廣泛應用于疾病診斷、 醫(yī)藥研發(fā)及環(huán)境科學等領域。代謝組學可以表征疾病的代謝紊亂、發(fā)現(xiàn)新治療靶點、篩選診斷疾病或監(jiān)測治療活動的生物標志物,在臨床研究中主要用于臨床診斷、病因與病理機制研究、臨床用藥指導及臨床前動物模型篩選,從而在多個層面實現(xiàn)精準醫(yī)療。

早期代謝組學研究多采用核磁共振技術(nuclear magnetic resonance, NMR)[1]。NMR重復性好但靈敏度低于質譜技術。NMR可檢測濃度為1～2 μmol/L,體積為0.5 mL的代謝物,但早期代謝物變化多發(fā)生在nmol/L甚至pmol/L水平,NMR無法分析。液相色譜-質譜聯(lián)用技術(liquid chromatograph mass spectrometer, LC-MS)比NMR優(yōu)點更多,如高靈敏度、高分辨率及檢測和量化代謝物的能力更廣泛。因此,LC-MS目前是代謝組學研究的首選分析技術[2]。

本文將就代謝組學近年來在嚴重創(chuàng)傷和燒傷中的應用及研究進展予以簡述,以期為其臨床診治與尋找生物標志物及藥物靶點提供線索,提高救治效率,并展望了燒沖復合傷代謝組學的問題和挑戰(zhàn)。

1 創(chuàng)傷代謝組學研究進展

全球每年有約580萬人因重度創(chuàng)傷致死,約占總死亡率10%。絕大多數(shù)患者早期能存活,而后期常死于創(chuàng)傷并發(fā)癥,如多器官衰竭、急性呼吸窘迫綜合征、醫(yī)院感染及膿毒癥等。盡管創(chuàng)傷相關的蛋白質標志物研究取得了一定進展,當前創(chuàng)傷類疾病的診斷和預后仍存在問題,臨床缺乏可靠生物標志物。而利用代謝組學等組學技術,可為創(chuàng)傷性疾病提供新的診斷生物標志物。目前應用代謝組學技術進行創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury, TBI)、嚴重外傷/休克以及燒傷的研究越來越多,彰顯出代謝組學在創(chuàng)傷研究中的巨大潛力。

1.1 創(chuàng)傷性腦損傷的代謝組學研究進展

TBI破壞生理內穩(wěn)態(tài),可導致代謝組學表現(xiàn)出“代謝危機”,出現(xiàn)復雜的代謝紊亂。危重患者可能有近2 500個代謝物受影響。分析尿液、腦脊液、血液等體液的代謝組,可了解TBI患者損傷的病理生理學機制。應用1H-NMR定量波譜代謝組學分析輕重度TBI患者的尿液樣本,發(fā)現(xiàn)L-甲硫氨酸和胸腺嘧啶等代謝物與損傷嚴重程度呈負相關,而嘌呤代謝是TBI影響的主要通路[3]。以尿液代謝物作為生物標志物,有助于客觀、快速地識別TBI的嚴重程度和預后判斷。此外,顱內監(jiān)測和腦室外引流通常是臨床護理的必要條件,腦脊液也可作為TBI患者代謝組數(shù)據(jù)的來源[4]。Thomas等對716例TBI和非TBI對照患者血清進行了全面的代謝組學研究,發(fā)現(xiàn)膽堿磷脂(溶血磷脂酰膽堿、醚磷脂酰膽堿和鞘磷脂)與TBI嚴重程度呈負相關,是TBI患者預后關鍵的潛在生物標志物[5]。

嚴重TBI如低血壓、缺氧和顱內壓升高等疾病,臨床治療重點是糾正生理紊亂[6]。TBI生化指標乳酸/丙酮酸比值(lactate/pyruvate ratio, LPR)升高,反映了能量代謝受損。LPR升高與TBI術后不良結局及死亡率相關。外源13C標記的琥珀酸經(jīng)三羧酸循環(huán)在細胞內代謝,利用NMR技術測量13C標記的代謝物,發(fā)現(xiàn)局部琥珀酸鹽給藥改善了能量代謝,降低了LPR比值,證明琥珀酸鹽是TBI潛在的治療藥物[7]。

因此,代謝組學有望補充其他“組學”分析,解決TBI引起的復雜病理生物學問題。如果未來有更大規(guī)模的臨床研究,將代謝組學測定的血漿生物標志物用于TBI篩查和損傷后監(jiān)測,可進一步鑒定臨床預后相關代謝標志物的價值。

1.2 嚴重外傷/休克的代謝組學研究進展

創(chuàng)傷是戰(zhàn)斗中最常見的傷害,嚴重創(chuàng)傷的士兵可能會死于外傷性失血性休克(trauma hemorrhagic shock, THS)引起的并發(fā)癥。失血過多導致器官氧氣不足引發(fā)THS,進而引發(fā)大規(guī)模的代謝紊亂和強烈的炎性反應,導致器官衰竭甚至死亡。利用豬創(chuàng)傷THS模型通過NMR和LC-MS聯(lián)合互補的代謝組學方法,發(fā)現(xiàn)與急性期反應、炎性反應、能量消耗、氧化應激和腎功能障礙相關的幾種代謝物(如脂類、嘌呤、葡萄糖醛酸代謝物等),在休克30 min后發(fā)生了顯著變化,導致嚴重的代謝紊亂[8]。應用基于質譜的代謝組學技術,檢測嚴重外傷和失血性休克(hemorrhagic shock, HS)引發(fā)的血漿代謝異常,發(fā)現(xiàn)其代謝紊亂對臨床結局具有潛在影響,血漿乳酸和琥珀酸的水平是重傷患者死亡率的預測指標[9-10]。

乳酸水平升高與創(chuàng)傷死亡率增加有關,然而通過強陰離子間隙定量的未測定酸性代謝物可能具有更大的預測價值。進行性失血性休克導致組織供氧不足,使細胞代謝從有氧代謝轉變?yōu)闊o氧代謝,并產(chǎn)生乳酸血癥[11]。缺氧導致電子傳遞鏈解偶聯(lián),出血性低氧血癥會促進檸檬酸代謝物(如琥珀酸鹽)循環(huán)水平增加?；诙抠|譜的代謝組學分析重傷患者血漿樣本,發(fā)現(xiàn)休克后代謝紊亂琥珀酸水平可能是比乳酸更敏感的生物標志物,更能預測重傷患者的死亡率[12]。丙二酸二甲酯可減緩HS豬模型琥珀酸鹽和乳酸的積聚,有助于保持復蘇期間心臟充盈壓力和功能,從而在豬復蘇后更好地恢復其生理功能[13]。因此,丙二酸二甲酯具有治療HS的潛力。

對有感染性休克的重癥監(jiān)護室(intensive care unit, ICU)患者和無感染性休克的ICU患者對照的血清樣本,進行靶向代謝組與炎性因子譜分析,發(fā)現(xiàn)在感染性休克ICU患者中,8種代謝物濃度升高:其中異丁酸鹽、肌醇、脯氨酸和尿素濃度增加,提示肝衰竭和腎損傷;3-羥基丁酸、O-乙酰肉堿、2-羥基丁酸增加,與炎性反應增加引起的能量需求,以及疾病狀況相關的代謝需求相關;苯丙氨酸升高是蛋白質分解加快的結果,通常由感染和炎性狀態(tài)引起[14]。這些代謝物可用于ICU感染性休克的診斷和預后,且優(yōu)于傳統(tǒng)使用的ICU臨床評分系統(tǒng),預測能力出色。

1.3 燒傷的代謝組學研究進展

燒傷仍然是世界范圍內的重大公共衛(wèi)生問題。代謝紊亂是燒傷的主要并發(fā)癥,對嚴重燒傷患者的臨床結局產(chǎn)生負面影響。這些代謝異常包括肌肉萎縮、代謝亢進、高血糖、高乳酸血癥、胰島素抵抗和線粒體功能障礙[15]。嚴重燒傷會引起全身代謝和炎性紊亂,最終導致能量消耗,脂肪和葡萄糖分解代謝增加[16]。當前,代謝組學研究是全面系統(tǒng)了解燒傷后患者的代謝變化規(guī)律和尋找臨床診斷重要代謝標志物的有效手段。

研究報道應用代謝組學鑒定燒傷患者血漿、血清中升高的細胞因子、細胞內分泌蛋白以及脂肪酸代謝物,可能具有預后價值[17]。40%全身表面積燒傷外加松樹皮煙霧吸入的豬重度燒傷模型,應用NMR技術分析其動脈血血清。在所檢測的38種水溶性代謝物中,80%以上其濃度隨時間顯著變化。由于脂肪酸分解代謝與氧化應激等代謝途徑隨時間推移而增加,最終導致四種有機羧酸鹽(2-羥丁酸、3-羥丁酸、乙酰乙酸和異戊酸)的累積[17]。研究雖然沒有觀察到與死亡率相關的差異代謝變化,但是這四種有機羧酸鹽可作為燒傷復蘇或恢復的生物標志物。

此外,基于1H-NMR代謝組學分析, ATP通過誘導小鼠低溫狀態(tài),可逆轉燒傷皮膚代謝譜的變化,改善燒傷深度的進展,并減少膠原蛋白的降解,同時減輕了燒傷誘導的過度炎性反應和氧化應激,從而緩解了損傷和炎癥性疼痛[18]。因此ATP誘導的低溫可以減輕燒傷,并為熱燒傷后的急救治療提供新的思路。通過毛細管電泳-質譜(capillary electrophoresis-mass spectrometry,CE-MS)代謝組學分析發(fā)現(xiàn),小鼠受燒傷影響最大的代謝通路是嘌呤、谷胱甘肽、β-丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸等代謝通路,燒傷可能導致小鼠骨骼肌谷氨酰胺分解和還原羧化增加。法尼基轉移酶抑制劑既能逆轉燒傷引起的胰島素抵抗和線粒體功能障礙,也可逆轉氧化/還原煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+/NADH)比率以及氧化應激和ATP耗竭[15]。因此,代謝組學數(shù)據(jù)分析表明,燒傷可誘導代謝組成分和代謝途徑的全局變化,多種代謝途徑中某些關鍵代謝物的豐度劇烈改變。

膿毒癥也是嚴重燒傷患者死亡的重要原因,綠膿桿菌是導致膿毒癥的主要因素,而降鈣素原(procalcitonin,PCT)是膿毒癥早期診斷的生物標志物[19]。利用氣相色譜-飛行時間質譜法(GC-TOF-MS)分析熱損傷和感染綠膿桿菌小鼠血清的代謝組學,發(fā)現(xiàn)五種代謝物(反式-4-羥基脯氨酸、5-氧化脯氨酸、甘油-3-半乳糖苷、吲哚-3-乙酸酯和吲哚-3-丙酸酯)的組合,可作為燒傷患者早期診斷綠膿桿菌引起膿毒癥的生物標志物[20]。因此,PCT 和以上五種代謝物組合,可作為嚴重燒傷患者感染膿毒癥及預后的特定生物標志物,為早期臨床診斷提供新的研究工具和思路。

2 嚴重復合傷的代謝組學研究進展

復合傷是兩種或兩種以上不同致傷因素同時或相繼作用導致的機體損傷,主要分為燒沖復合傷、放射復合傷以及化學復合傷等。致傷因素包括熱能(火燒傷、沸水)、放射線、機械力(爆炸沖擊波、高強度擠壓)、激光及化學物中毒等。復合傷的病情嚴重且復雜、疾病進展快。與其他單一損傷相比,復合傷大大增加了并發(fā)癥和死亡風險。目前復合傷大部分研究集中在其病理機制和臨床治療等方面,而代謝組學在復合傷病人和動物模型中的相關研究較少。

燒沖復合傷是和平、戰(zhàn)時及恐怖襲擊事件中常見致命性損傷之一,由熱力及沖擊波兩種致傷因素共同導致?，F(xiàn)代戰(zhàn)爭大批量高爆炸性武器的使用及恐怖爆炸事件等,勢必導致大量嚴重的燒沖復合傷。燒沖復合傷除皮膚燒傷外,肺臟是主要受累器官,具有致傷因素多、容易發(fā)生漏診或誤診、傷情重、處理矛盾多、死亡率高等特點,救治困難。研究報道瓦斯爆炸導致大鼠多臟器系統(tǒng)損傷,應用LC-MS代謝組學方法分析瓦斯爆炸致大鼠復合傷的血清代謝組,發(fā)現(xiàn)組間代謝譜差異明顯,并鑒定出烏頭酸、檸檬酸、煙酰胺、丙酮酸等18個差異代謝物,其機制可能與丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、煙酸和煙酰胺代謝等12條代謝通路有關[21]。通過基于 LC-MS 的大鼠血清代謝組學分析急性爆炸性肺損傷(acute blast lung injury explosive,ABLI),發(fā)現(xiàn)9種代謝物顯著變化,2-氨基己二酸、L-甲硫氨酸、L-丙氨酸、L-賴氨酸、L-蘇氨酸、膽酸和L-組氨酸在暴露組中顯著增加,檸檬酸和烏頭酸在暴露后顯著降低,確定了肺循環(huán)生物標志物的變化,為爆炸引起的 ABLI 提供了新的潛在治療機制[22]。肺損傷的致病機制及臨床治療干預措施的研究是治療燒沖復合傷的關鍵,研究發(fā)現(xiàn)蛋白酶抑制劑烏司他丁對重度燒沖復合傷造成的大鼠急性肺損傷有治療作用,對燒沖復合傷造成的凝血、纖溶功能紊亂有很好的調節(jié)作用,同時能減輕大鼠燒沖復合傷早期肺組織水腫和病理損害,其機制可能與烏司他丁能增加肺組織保護性蛋白的表達、提高大鼠對損傷的耐受力有關[23]。

燒沖復合傷的早期研究重點是其病理生理變化。如應用大鼠燒沖復合傷模型研究心肌損傷相變化,利用分子生物學和細胞組化等方法檢測心肌損傷以及鈣蛋白酶的變化[24],發(fā)現(xiàn)燒沖復合傷后大鼠出現(xiàn)心肌損傷,鈣蛋白酶表達升高、活性增強。但是燒沖復合傷的損害程度遠遠大于單純沖擊傷或燒傷,會引發(fā)相較于單純沖擊傷或燒傷更為復雜多變的生化應答,導致代謝組劇烈改變。重傷代謝組學的諸多研究成果表明,應用即時的代謝組學分析,可以密切監(jiān)測患者傷后不同階段的生化狀態(tài)變化,篩選用于臨床決策的生化標志物,并可能快速找出救治的新靶點。鑒于代謝組學技術可以全面、快速的反映機體代謝變化規(guī)律,故在病情復雜且進展迅速的嚴重復合傷領域具有非常廣闊的研究前景。

3 問題與展望

重傷患者的病情復雜,代謝狀態(tài)高度紊亂,單一代謝物或生化分子標志物無法實時反映出病情的復雜變化,而應用代謝組學分析技術可全面、快速實時反映機體的代謝變化,有助于改善臨床診治策略。如何找到危重病和創(chuàng)傷的早期發(fā)展趨勢,以及對診斷、預后和治療可靠的臨床分子標志物;根據(jù)以往研究的代謝物和信號途徑,如何利用復雜的代謝組學信息,從指數(shù)級增長的數(shù)據(jù)中提取有價值的信息是非常棘手的挑戰(zhàn)。未來需要研究有效算法來降低數(shù)據(jù)維度,同時剖析疾病復雜生物過程背后的奧秘。而隨著可用數(shù)據(jù)變得越來越多,如何集成和綜合這些數(shù)據(jù)必然成為挑戰(zhàn)。運用超級計算機的強大算力和人工智能、大數(shù)據(jù)技術,可以更好的利用代謝組學等不同組學技術監(jiān)測危重患者傷后不同階段的生化狀態(tài),分析代謝物與機體生理/病理變化關系,從中梳理分析出有意義的臨床相關數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)重癥臨床診治的新靶點和分子標志物。

近幾年,人工智能領域已經(jīng)從理論研究轉向現(xiàn)實應用。臨床醫(yī)學的人工智能輔助工具可以改善管理決策,多組學技術和人工智能算法的同步發(fā)展,推動了精準醫(yī)學的發(fā)展。人工智能可以利用各種來源的信息內容,為我們對疾病的理解開辟新的視野,并為準確診斷和制定更精確的治療策略提供機會。有研究[25]表明,機器學習算法可以通過分析組學數(shù)據(jù)實現(xiàn)個性化治療。盡管存在許多挑戰(zhàn),但仍有大量研究在解決這些問題,并促進基于人工智能的多組學分析的臨床轉化。預計以人工智能為基礎的多組學技術將推動精準醫(yī)學模式的轉變。到目前為止,對于給定的特定數(shù)據(jù)集,選擇要使用的最優(yōu)算法并沒有黃金標準。事實上,數(shù)據(jù)集結構微小的變化可能導致所選算法和函數(shù)顯著的不同結果,為了更好地了解算法如何與數(shù)據(jù)集的特征相互作用,應進一步的深入研究。隨著臨床實踐中越來越多地產(chǎn)生新的多組學數(shù)據(jù),人工智能技術將提供更有意義的信息來指導臨床決策,最終推動精準醫(yī)學的發(fā)展。