孫趁意,趙建波,李貴,劉霞

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科,河南 鄭州 450000)

機(jī)體長時(shí)間處于“正平衡(攝入能量大于消耗能量)”狀態(tài)時(shí),脂質(zhì)過度積累,導(dǎo)致體重增加,進(jìn)而引起肥胖[1-3]。糖尿病、高脂血癥、高血壓等所致的心腦血管疾病、肌肉骨骼系統(tǒng)及代謝系統(tǒng)等疾病的發(fā)生發(fā)展與肥胖密切相關(guān)[4-7]。肥胖還會造成該部分人群心理壓力明顯增大、生活質(zhì)量下降等一系列問題的出現(xiàn)[8-9]。絕大多數(shù)肥胖人群很難長期堅(jiān)持低脂健康飲食[10]。因此,需要探索一種適合肥胖人群能長期堅(jiān)持、簡便、行之有效的減重方法。共軛亞油酸(conjugated linoleic acid,CLA)是一種多不飽和脂肪酸,可以從各種反芻動物的奶制品及富含亞油酸的植物油中獲得[11]。CLA具有多種生理效應(yīng),包括抗腫瘤、減輕胰島素抵抗、降低血糖、減輕肥胖及降低血壓等[12-14],通常被認(rèn)為是一種膳食補(bǔ)充劑[15],已有人群將其作為一種減肥“代餐”。

利用CLA干預(yù)高脂飲食小鼠,其能夠通過調(diào)節(jié)胃蛋白的表達(dá)并對特定的腸道細(xì)菌產(chǎn)生益生元的作用[16]?？梢?腸道微生物菌群為CLA的作用位點(diǎn)之一。腸道微生物菌群在食物的吸收與消化上起到重要作用[17]。而高脂飲食導(dǎo)致機(jī)體腸道微生物菌群紊亂,進(jìn)一步加重肥胖的形成[18]。為了解腸道微生物菌群在CLA減輕高脂飲食小鼠肥胖中所起的作用,促進(jìn)CLA作為膳食補(bǔ)充劑的進(jìn)一步應(yīng)用進(jìn)行了本研究,期望能為GLA的臨床研究應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及飼料

于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司[許可證號SYXK(京)2022-0052]購買24只4周齡雄性LDLR-/-小鼠。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批(2022248)。于鼠來寶(武漢)生物科技有限公司購買小鼠飼料。其中高脂飼料的營養(yǎng)成分組成:蛋白質(zhì)15%,碳水化合物25%,脂肪60%。

1.2 試劑和儀器

本次實(shí)驗(yàn)所需的CLA乳液、TRIzol和HE染色試劑盒分別購于武漢綠景豐華生物科技有限公司、北京普利萊基因技術(shù)有限公司和上海碧云天生物技術(shù)有限公司。電子顯微鏡購自Carl Zeiss公司,實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自ABI公司,血糖儀購自Roche公司。

1.3 造模、分組及干預(yù)

小鼠在SPF級動物房適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后,隨機(jī)分為3組(正常組、高脂組和干預(yù)組),每組8只。普通飼料用于喂養(yǎng)正常組小鼠,高脂飼料同時(shí)喂養(yǎng)高脂組小鼠及干預(yù)組小鼠,正常組及高脂組小鼠分別于每天上午9:00接受生理鹽水灌胃(0.1 mL·10 g-1)、干預(yù)組小鼠于每天上午9:00接受CLA灌胃(0.1 mL·10 g-1)。3組小鼠均連續(xù)干預(yù)16周,實(shí)驗(yàn)過程所用小鼠均未出現(xiàn)死亡。

小鼠Lee’s指數(shù)和肝臟指數(shù)。Lee’s指數(shù)[19]=體重(g)×103/體長(cm),肝臟指數(shù)=肝臟重量(g)/體重(g)。小鼠處死前稱重、測體長(小鼠鼻尖至肛門的距離,單位為cm),處死小鼠后取肝臟組織并稱重。

口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(oral glucose tolerance test, OGTT)應(yīng)于干擾結(jié)束前2 d進(jìn)行。應(yīng)用25 g·L-1的葡萄糖溶液給小鼠灌胃(0.1 mL·10 g-1),之后分別于灌胃后0、15、30、60、90、120 min通過血糖儀檢測血糖。

小鼠血脂及血清胰島素?cái)?shù)據(jù)。 用摘眼球法對小鼠進(jìn)行取血操作,用離心管采集小鼠眼球血,于室溫下靜置2 h,待血液凝固血塊收縮后,以4 000 r·min-1離心10 min鐘后得到血清,取上清于干凈的離心管中,暫存于-20 ℃?zhèn)溆谩０凑赵噭┖姓f明檢測各指標(biāo)的含量(于南京建成生物工程研究所完成)。

RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及RT-PCR。取50 mg小鼠回腸組織,加入TRIzol試劑進(jìn)行充分研磨,隨后依次加氯仿進(jìn)行震蕩、離心,取上清于干凈的離心管中,加入異丙醇再次離心、棄上清,加入體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精洗滌沉淀,以此提取總RNA;應(yīng)用ReverTra Ace qPCR RT Kit和SYBR Green試劑盒(東洋紡生物科技有限公司)進(jìn)行后續(xù)操作,反應(yīng)結(jié)束后,通過2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。各引物序列如下。ZO-1:(F)5’-CTCCAGGTGCTTCTCTTGCT-3’,(R)5’-TATCTTCGGGTGGCTTCACT-3’。TLR4:(F)5’-TCTCAGCAGTTGCTTCTTCTT-3’,(R)5’-CCAGAGCCGGGAGTGTACAA-3’。

TNF-α:(F)5’-AAGGGGAGGAAGTCCTGTTG-3’,(R)5’-TCTGTAGAGTGGGAGGTGC-3’。Ocln:(F)5’- AGAACAGGAGGGACTGCTCTTTTTG -3’,(R)5’- CCAGGCTATAGCCTTTGGCAGGGCTCG -3’。

小鼠回腸組織病理變化。離體的小鼠回腸組織應(yīng)用甲醛溶液充分固定,再按照浸泡、脫水、包埋的步驟完成所有程序后,進(jìn)行連續(xù)切片從而得到回腸組織病理切片,隨之進(jìn)行HE染色,封片后在電子顯微鏡下觀察小鼠回腸組織的病理改變。

小鼠腸道菌群的16S rDNA高通量測序。干預(yù)結(jié)束后,收集3組小鼠的糞便于滅菌凍存管中,隨后立即轉(zhuǎn)入-80 ℃超低溫冰箱凍存?zhèn)溆?送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測序。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CLA對小鼠體重、糖耐量、肝臟指數(shù)和Lee’s指數(shù)的影響

每隔2周測量小鼠體重。前4周,小鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)展,相對于高脂組與干預(yù)組的小鼠體重的明顯增加,正常組小鼠的體重增加比較緩慢。實(shí)驗(yàn)第10周之后,干預(yù)組小鼠的體重低于高脂組小鼠(P=0.023)(圖1A)。OGTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)正常組小鼠的血糖在30 min時(shí)達(dá)到峰值,120 min時(shí)恢復(fù)到實(shí)驗(yàn)前水平。圖1B顯示高脂飲食導(dǎo)致小鼠血糖急劇上升,在15～90 min處于較高水平(>30 mmol·L-1),120 min時(shí)仍未降至實(shí)驗(yàn)前水平。GLA結(jié)果顯示干預(yù)組小鼠的血糖峰值明顯低于高脂組小鼠的血糖峰值,且各時(shí)間點(diǎn)血糖均低于高脂組(圖1B)。高脂組小鼠OGTT曲線下面積明顯增加(P<0.001)。和高脂組相比,干預(yù)組小鼠OGTT曲線面積出現(xiàn)下降(P<0.001)。為了解CLA對肥胖小鼠中主要器官的影響,計(jì)算肝臟指數(shù),高脂組小鼠的肝臟指數(shù)較正常組小鼠增加(P=0.034),而CLA干預(yù)16周后,高脂組小鼠的肝臟指數(shù)降低(P=0.035)。CLA降低了肥胖小鼠的Lee’s指數(shù)(P=0.030 )。見表1。

表1 各組小鼠OGTT曲線下面積變化、肝臟指數(shù) 和Lee’s指數(shù)

A為小鼠體重曲線圖;B為小鼠血糖曲線圖。

2.2 CLA對小鼠血清胰島素和脂質(zhì)的影響

相對于正常組小鼠,高脂組小鼠的血清胰島素、血清甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)和總膽固醇(total cholesterol,TC)均升高(P<0.05)。CLA灌胃16周后,干預(yù)組小鼠的血清胰島素、TC、TG、LDL水平較高脂組下降(P<0.05)。相對于正常組小鼠,高脂組小鼠血清中高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)含量下降(P=0.003),干預(yù)組小鼠血清HDL含量在CLA干預(yù)后升高(P=0.041)。見表2。

表2 各組小鼠血清脂質(zhì)和胰島素變化情況

2.3 CLA對小鼠回腸炎癥因子水平、腸道緊密連接蛋白和回腸組織病理的影響

肥胖小鼠的回腸炎癥因子TLR4在mRNA水平的相對表達(dá)量約為正常飲食小鼠的90倍,相對于正常組對照是明顯增加,同時(shí)TNF-α在mRNA水平的相對表達(dá)量也升高,約為正常組小鼠TNF-α表達(dá)量的40倍。小鼠體內(nèi)的TLR4和TNF-α相對表達(dá)量在CLA干預(yù)下可以降低(見表3)。高脂組小鼠體內(nèi)的Ocln(P<0.001)和ZO-1(P=0.001)在mRNA水平的相對表達(dá)量低于正常組。ZO-1和Ocln相對表達(dá)水平在CLA干預(yù)后上升(見表3)。通過HE染色,發(fā)現(xiàn)高脂飲食會造成小鼠回腸組織結(jié)構(gòu)紊亂、細(xì)胞核染色變淺、組織細(xì)胞間隙增大、上皮細(xì)胞脫落、壞死,而CLA干預(yù)后,干預(yù)組小鼠的回腸組織結(jié)構(gòu)較高脂組小鼠改善,說明GLA能夠降低高脂組小鼠的腸道通透性。見圖2。

表3 各組小鼠回腸炎癥因子、腸道緊密連接蛋白相對表達(dá)量

A為正常組;B為高脂組;C為干預(yù)組。

2.4 CLA對小鼠腸道微生物菌群的影響

通過對小鼠腸道菌群Alpha多樣性分析觀察到:高脂組小鼠的Chao指數(shù)相對于正常組小鼠有所下降(P<0.05),而干預(yù)組小鼠Chao指數(shù)在GLA干預(yù)后則增加(P<0.01)(圖3A)。相對于正常組,在門水平上,肥胖小鼠腸道菌群的放線菌門豐度增加、厚壁菌門豐度降低。干預(yù)組小鼠腸道微生物菌群中厚壁菌門豐度在CLA干預(yù)后明顯增加,放線菌門豐度則有所下降(圖3B)。相對于正常組,在屬水平上,高脂組小鼠腸道微生物菌群中乳酸桿菌豐度下降(由19.56%下降至10.25%),而CLA能顯著增加小鼠腸道微生物菌群雙歧桿菌豐度由2.21%下降至24.36%。(圖3C、D和E)。

A為Chao指數(shù);B為門水平物種組成;C為正常組屬水平物種組成;D為高脂組屬水平物種組成;E為干預(yù)組屬水平物種組成。

3 討論

肥胖是指體內(nèi)貯存的脂肪量超過理想量的20%以上,當(dāng)體重指數(shù)≥30 kg·m-2時(shí),被認(rèn)為已處于肥胖的狀態(tài)[20-21]。近年來,越來越多的研究表明肥胖與腸道微生物菌群密切相關(guān),腸道微生物菌群能夠調(diào)節(jié)宿主的代謝,促進(jìn)肥胖的發(fā)生與發(fā)展[22]。目前研究認(rèn)為,在正常進(jìn)食時(shí)適當(dāng)補(bǔ)充雙歧桿菌、乳酸桿菌等有益微生物可能會預(yù)防或減少肥胖的發(fā)生[23]。從而推斷,若能夠?qū)⒛c道微生物菌群的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改善,可能進(jìn)一步阻斷肥胖的發(fā)生、發(fā)展。

本次實(shí)驗(yàn)中用到的LDL受體基因敲除小鼠,是研究肥胖的理想模型之一。因?yàn)長DL的主要作用是轉(zhuǎn)運(yùn)內(nèi)源性膽固醇,當(dāng)LDL的受體缺失時(shí),LDL就無法正常代謝,血漿膽固醇即可升高,進(jìn)一步引起脂質(zhì)累積,最終造成肥胖[24]。相對于正常組小鼠,在本實(shí)驗(yàn)中觀察到高脂飲食導(dǎo)致小鼠體重明顯增加,Lee’s指數(shù)進(jìn)一步印證了小鼠肥胖的發(fā)生。OGTT和血清胰島素結(jié)果表明高脂組小鼠出現(xiàn)了明顯的胰島素抵抗和糖耐量受損的情況。CLA干預(yù)后,小鼠體重明顯下降,且糖耐量受損也有所改善。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CLA降低肥胖小鼠TC、TG、LDL的含量,增加了HDL的含量。Druart等[25]研究發(fā)現(xiàn),CLA具有顯著減輕肥胖小鼠體重、改善糖脂代謝等功能。高脂飲食能夠引發(fā)小鼠腸道炎癥,并導(dǎo)致小鼠腸黏膜屏障功能受損[26],為了評價(jià)CLA對腸道炎癥和腸黏膜屏障的影響,檢測了回腸炎癥因子和腸緊密連接蛋白的相對表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CLA能夠顯著改善肥胖小鼠腸道內(nèi)炎癥水平,降低腸道通透性。

腸道菌群測序結(jié)構(gòu)表明,高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠的Chao指數(shù)相較于正常組小鼠的Chao指數(shù)明顯降低,而經(jīng)過CLA的干預(yù),發(fā)現(xiàn)干預(yù)組小鼠的Chao指數(shù)又產(chǎn)生了上升趨勢,這說明高脂飲食會導(dǎo)致小鼠腸道菌群的多樣性降低,而GLA能夠逆轉(zhuǎn)這種改變,GLA能夠明顯提高小鼠的腸道菌群多樣性。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肥胖小鼠的放線菌門和厚壁菌門豐度降低,與Zhou等[27]的研究結(jié)果是一致的。研究證實(shí),乳酸桿菌、雙歧桿菌有改善機(jī)體糖脂代謝水平和降低炎癥水平等多種生物功能[28-29]。本研究中,CLA能夠明顯提高小鼠腸道菌群的雙歧桿菌豐度,而乳酸桿菌豐度變化不明顯,這可能與研究時(shí)間短、樣本數(shù)量小等原因有關(guān)。

CLA在結(jié)構(gòu)上被認(rèn)為是一種反式脂肪酸,有研究表明食用反式脂肪酸的消耗量可能與冠心病危險(xiǎn)因素呈正相關(guān)[30],但美國食品和藥物管理局未將CLA歸類為反式脂肪酸。CLA有多種生理功能,因此已被作為“膳食補(bǔ)充劑”而應(yīng)用,在乳制品、食物或者飲料中添加CLA是增加其攝入的常用方法[31]。機(jī)體腸道微生物菌群可能是CLA的作用位點(diǎn)之一,Den等[32]實(shí)驗(yàn)表明,trans-10,cis-12CLA飲食補(bǔ)品能夠優(yōu)化高脂高蔗糖小鼠的腸道微生物菌群,增加乳酸桿菌含量,同時(shí)糞便中丁酸鹽和血漿乙酸鹽的濃度升高了2倍,血漿乙酸鹽的濃度升高了1.5倍。有研究表明,丁酸鹽對機(jī)體的能量平衡產(chǎn)生積極影響,并能夠防止飲食所引起的肥胖[33]。因此,推測CLA能夠影響機(jī)體腸道微生物菌群,改善腸道微生物菌群結(jié)構(gòu),增加了產(chǎn)丁酸鹽細(xì)菌含量,進(jìn)而延緩肥胖進(jìn)展。

4 小結(jié)

CLA可能通過改善高脂飲食組小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu),提高厚壁菌門和雙歧桿菌豐度,進(jìn)一步減輕肥胖小鼠體重,調(diào)節(jié)糖脂代謝,降低腸道內(nèi)炎癥因子的表達(dá)量及恢復(fù)腸黏膜屏障功能。CLA作為一種膳食補(bǔ)充劑,必將有更為廣泛的應(yīng)用。但本實(shí)驗(yàn)存在不足之處,未能明確糞便中短鏈脂肪酸的含量變化。在下一步實(shí)驗(yàn)中,將進(jìn)一步研究,了解CLA對肥胖小鼠內(nèi)腸道短鏈脂肪酸的影響變化。