李曉斌,蘇曉鵬,馬貴萍,劉博文,李峰,胡世平

1.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029; 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院(龍崗),廣東 深圳 518172; 3.山西省中醫(yī)院,山西 太原 030012

原發(fā)性肝癌(primary liver cancer,PLC)是全球六大常見癌癥之一,也是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的第三大原因[1-2],其中肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見的病理類型,約占90%[3]。我國肝細(xì)胞癌患者中由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染所致者占84%[4]。HCC的治療方法因腫瘤數(shù)量、直徑、分布、肝功能、肝外轉(zhuǎn)移和血管浸潤而有所不同[5]。對于早期診斷且肝功能良好的患者,手術(shù)切除仍是首選治療[6]。晚期HCC患者僅限于全身治療,包括標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞毒性化療,靶向治療和免疫治療[7]。但由于HCC具有復(fù)雜生物學(xué)特性、高度異質(zhì)性和免疫抑制腫瘤微環(huán)境的形成,目前的治療方法存在術(shù)后復(fù)發(fā)、耐藥等問題,限制了其療效[8]。因此,針對HCC新的治療策略的研究意義重大。中醫(yī)藥具有多成分,多靶點的優(yōu)勢,中醫(yī)藥聯(lián)合常規(guī)西醫(yī)療法可有效改善乙型病毒性肝炎(以下簡稱乙肝)相關(guān)PLC患者的臨床結(jié)局[9-11]。

中醫(yī)認(rèn)為,乙肝相關(guān)PLC責(zé)之于正氣虧虛,疫毒侵襲,毒瘀互結(jié)。筆者以扶正解毒消癥為主要治療原則,自擬柴芪益肝方?；诖?本研究回顧性分析柴芪益肝方輔助治療乙肝相關(guān)性肝癌正虛毒瘀證患者的生存情況,以探究其臨床療效。

1 資料與方法

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.1.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)(1)慢性乙型肝炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[4]:慢性HBV感染是指HBsAg和/或HBV-DNA陽性6個月以上。(2)原發(fā)性肝癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2019年版)》[10]:若慢性乙型肝炎患者在隨訪期間發(fā)現(xiàn):①肝內(nèi)直徑≤2 cm 的結(jié)節(jié),且同時伴有至少2種影像學(xué)檢查[動態(tài)增強(qiáng)磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)、增強(qiáng)電子計算機(jī)斷層掃描(computerized tomography,CT)、超聲造影、肝細(xì)胞特異性對比劑釓塞酸二鈉增強(qiáng)MRI]有典型的肝癌病變特征;②肝內(nèi)直徑>2 cm的結(jié)節(jié),且同時伴有至少1種影像學(xué)檢查(動態(tài)增強(qiáng)MRI、增強(qiáng)CT、超聲造影、肝細(xì)胞特異性對比劑釓塞酸二鈉增強(qiáng)MRI)有典型的肝癌病變特征;③發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)結(jié)節(jié),病理診斷為肝癌;④甲胎蛋白≥400 μg·L-1,在排除妊娠、慢性或活動性肝病、生殖腺胚胎源性腫瘤以及消化道腫瘤后,且同時至少有一種影像學(xué)檢查(動態(tài)增強(qiáng)MRI、增強(qiáng)CT、超聲造影、肝細(xì)胞特異性對比劑釓塞酸二鈉增強(qiáng)MRI)有典型的肝癌特征者。以上4條滿足其中1條即可診斷為原發(fā)性肝癌。同時符合(1)和(2)可診斷為乙肝相關(guān)性肝癌。(3)肝癌轉(zhuǎn)移及進(jìn)展標(biāo)準(zhǔn)參照《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2019年版)》[12]及《肝癌復(fù)發(fā)的診斷與治療進(jìn)展》[13]:隨訪過程中發(fā)現(xiàn)原發(fā)病灶增大,或肝內(nèi)其他地方出現(xiàn)新發(fā)病灶且符合原發(fā)性肝癌的影像學(xué)表現(xiàn),抑或者向周圍組織轉(zhuǎn)移。

1.1.2 中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)參照《原發(fā)性肝癌中西醫(yī)結(jié)合診療專家共識(2021年版)》[14]和《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》[15]辨證為正虛毒瘀證:(1)主癥:神疲乏力,脅下痞塊,痛處不移,腰膝酸軟。(2)次癥:納呆食少,形體消瘦,噯氣,大便或溏或結(jié),少氣懶言,脘腹脹滿,面色晦暗,口黏不欲飲,惡心、嘔吐。(3)舌脈:舌質(zhì)紫暗,有瘀斑、瘀點,舌邊有齒痕,脈沉細(xì)或弦澀。

1.2 病例納入標(biāo)準(zhǔn)(1)年齡18～80歲;(2)符合中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn);(3)符合乙肝相關(guān)肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn);(4)柴芪益肝方組患者至少服用3個月柴芪益肝方;(5)可隨訪時間達(dá)5年,且其臨床資料較完整者。

1.3 病例排除標(biāo)準(zhǔn)(1)繼發(fā)性肝癌患者;(2)生命體征不穩(wěn)定者;(3)妊娠期、哺乳期婦女;(4)合并嚴(yán)重精神類疾病者;(5)失訪或臨床資料不完善者;(6)已知有酗酒或物質(zhì)依賴者;(7)合并HIV、HCV等其他病毒者;(8)合并活動性感染,尤其是膽管系統(tǒng)炎癥等;(9)合并心、腦、腎、肺等重要臟器嚴(yán)重疾病者。

1.4 研究對象回顧性收集2016年1月至2022年12月首次確診為乙肝相關(guān)PLC的住院患者臨床資料,按照診斷標(biāo)準(zhǔn)、納入及排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。

1.5 治療方法及分組(1)西醫(yī)治療組:僅采用西醫(yī)治療,包括抗病毒、保肝等內(nèi)科常規(guī)治療以及手術(shù)治療。(2)柴芪益肝方組:在西醫(yī)治療基礎(chǔ)上服用柴芪益肝方加減。柴芪益肝方藥物組成:生黃芪 30 g,柴胡10 g,白芍20 g,丹參20 g,醋鱉甲10 g,重樓15 g。中藥飲片或配方顆粒由北京中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院藥劑科提供。用法:水煎服(或顆粒劑沖服),每日1劑,早、晚分兩次服用。本組納入病例服用柴芪益肝方治療時間累計≥3個月。

1.6 臨床資料收集

1.6.1 一般資料患者姓名、性別、年齡、現(xiàn)病史、既往史、家族史(特指HBV感染和HCC)、個人史、治療方案、中藥服用史。

1.6.2 臨床檢驗指標(biāo)血常規(guī):白細(xì)胞計數(shù)、血小板計數(shù)、血紅蛋白等;生化指標(biāo):丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、白蛋白、總膽紅素等;電解質(zhì)指標(biāo):鉀離子、鈉離子、鈣離子;腫瘤指標(biāo):甲胎蛋白;病毒學(xué)指標(biāo):乙型肝炎病毒定量(HBV-DNA)、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)等。

1.6.3 影像學(xué)肝膽胰脾超聲、胸部CT、腹部CT、腹部MRI。

1.6.4 分級及分期參照Child-Pugh分級及巴塞羅那臨床肝癌(Barcelona clinic liver cancer,BCLC)分期[16]。

1.7 觀察指標(biāo)

1.7.1 5年生存率及5年無進(jìn)展生存率從患者確診為乙肝相關(guān)性肝癌的日期開始記錄生存時間,至患者死亡或者5年隨訪時間截止,比較兩組患者5年生存率及5年無進(jìn)展生存率,并比較服用柴芪益肝方不同累計時間患者的5年生存率及5年無進(jìn)展生存率。

1.7.2 5年生存率的影響因素采用單因素和多因素Cox回歸分析探討乙肝相關(guān)性PLC患者5年生存率的影響因素。

1.7.3 不同分期、不同分級患者的生存情況的比較將兩組患者分為BCLC-A期者、BCLC-B期者、BCLC-C/D期者及Child-Pugh A級者、Child-Pugh B級者、Child-Pugh C級者。分別比較上述兩種分類中柴芪益肝方組患者和西醫(yī)治療組患者在5年隨訪期內(nèi)的生存結(jié)局。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。首先對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行11傾向性評分匹配(propensity score matching,PSM)。符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示組間比較采用獨立樣本t檢驗;非正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)和四分位數(shù)表示[M(Q25,Q75)],組間比較采用曼-惠特尼U檢驗。計數(shù)資料采用頻數(shù)表示,組間比較采用χ2檢驗。采用Cox單因素及多因素回歸分析篩選出影響生存結(jié)局的獨立因素。采用K-M法繪制患者生存曲線,Log-rank檢驗法比較生存率。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者基線資料比較最終納入符合標(biāo)準(zhǔn)的乙肝相關(guān)PLC正虛毒瘀證患者300例。PSM前西醫(yī)治療組為154例,柴芪益肝方組為146例,組間基線不均衡。將組間有差異的變量,包括年齡、吸煙史、飲酒史、中性粒細(xì)胞百分比、尿酸、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、腫瘤個數(shù)及腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移在兩組間進(jìn)行11 PSM。PSM后西醫(yī)治療組(n=87例)和柴芪益肝方組(n=87例)的基線均衡,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),組間有可比性,見表1。

表1 兩組患者PSM前后基線數(shù)據(jù)表 [M(Q25,Q75),例(%)]

2.2 兩組患者生存情況比較PSM前,西醫(yī)治療組和柴芪益肝方組5年生存率分別為6.8%和21.3%,5年中位生存時間分別為20個月和27個月,5年無進(jìn)展生存率分別為4.1%和6.3%,組間比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。PSM后,西醫(yī)治療組和柴芪益肝方組5年生存率分別為5.9%和23.8%,5年中位生存時間分別為21個月和38個月,5年無進(jìn)展生存率分別為2.70%和7.40%,組間比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見圖1。

注:A:兩組患者PSM后的5年生存率比較;B:兩組患者PSM后的5年無進(jìn)展生存率比較。

為進(jìn)一步明確服用柴芪益肝方的時間是否影響患者的生存情況,本研究按照累計服用柴芪益肝方的時間,將柴芪益肝方組患者分為累計服用3～<6個月者、6～<12個月者及≥12個月者。PSM后,服用柴芪益肝方的患者整體生存情況低于西醫(yī)治療組。柴芪益肝方累計服用3～<6個月者與西醫(yī)治療組的5年生存率和無進(jìn)展生存率相近;累計服用6個月以上者的5年生存率和無進(jìn)展生存率明顯高于西醫(yī)治療組與累計服用3～<6個月者(P<0.01),見圖2。由此可知,累計服用柴芪益肝方的時間越長越有利于乙肝肝癌患者的生存并避免疾病惡化。

注:A:西醫(yī)治療組與柴芪益肝方不同服藥時間的5年生存率;B:西醫(yī)治療組與柴芪益肝方不同服藥時間的5年無進(jìn)展生存率。圖中3～<6個月、6～<12個月以及12個月以上均指代累計服用柴芪益肝方的時間。

2.3 患者5年生存率的影響因素首先將PSM匹配后兩組患者中的所有變量納入Cox單因素回歸分析,結(jié)果顯示年齡、家族史、西醫(yī)治療方式(僅微創(chuàng)治療)、服用柴芪益肝方、BCLC分期、Child-Pugh分級、HBV-DNA(≥2 000 IU·mL-1)、甲胎蛋白(≥400 μg·L-1)和腫瘤個數(shù)是乙肝相關(guān)性肝癌患者5年生存的影響因素。隨后將上述變量納入Cox多因素回歸分析中,結(jié)果顯示年齡、家族史、西醫(yī)治療方式(僅微創(chuàng)治療)、服用柴芪益肝方、BCLC-C期、BCLC-D期、Child-Pugh B級、Child-Pugh C級、HBV-DNA(≥2 000 IU·mL-1)和腫瘤個數(shù)是乙肝相關(guān)性肝癌患者5年生存的獨立影響因素。其中西醫(yī)治療(僅微創(chuàng)治療)和服用柴芪益肝方是乙肝相關(guān)性肝癌患者5年生存的獨立保護(hù)因素(HR<1),其余皆是危險因素(HR>1),見表2。

表2 影響正虛毒瘀型乙肝相關(guān)PLC 5年生存的Cox回歸結(jié)果

2.4 兩組患者不同BCLC分期和不同Child-Pugh分級生存情況的比較

2.4.1 兩組患者不同BCLC分期的生存情況Cox回歸分析發(fā)現(xiàn),BCLC分期是乙肝相關(guān)性PLC患者生存的危險因素,為了進(jìn)一步明確兩組患者在不同BCLC分期的生存情況,本研究將兩組患者分為BCLC-A期、BCLC-B期、BCLC-C/D期。在BCLC-B期(圖3B)和BCLC-C/D期(圖3C),柴芪益肝方組患者5年生存率均高于西醫(yī)治療組(P=0.007,P=0.002),在BCLC-A期(圖3A),組間無明顯差異(P=0.09)。在BCLC-C/D期(圖3F),柴芪益肝方組患者5年無進(jìn)展生存率顯著高于西醫(yī)治療組(P=0.02),在BCLC-A期(圖3D)和BCLC-B期(圖3E),兩組患者的5年無進(jìn)展生存率無顯著差異(P=0.33,P=0.06)。

圖3 兩組患者不同BCLC分期的5年生存率及無進(jìn)展生存率

2.4.2 兩組患者不同Child-Pugh分級的生存情況Cox回歸分析發(fā)現(xiàn),Child-Pugh分級是乙肝相關(guān)性肝癌患者生存的危險因素,本研究通過繪制兩組患者在不同Child-Pugh分級下的生存曲線發(fā)現(xiàn):在Child-Pugh A級(圖4A)、Child-Pugh B級(圖4B)、Child-Pugh C級(圖4C),柴芪益肝方組患者的5年生存率均顯著高于西醫(yī)治療組(P=0.002,P=0.006,P=0.04)。在Child-Pugh B級(圖4E),柴芪益肝方組患者的5年無進(jìn)展生存率明顯高于西醫(yī)治療組(P=0.001),在Child-Pugh A級(圖4D)和Child-Pugh C級(圖4F),組間的5年無進(jìn)展生存率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.09,P=0.21)。

圖4 兩組患者不同Child-Pugh分級的5年生存率及無進(jìn)展生存率

3 討論

中醫(yī)學(xué)將PLC歸為“積聚”“肝積”“癥瘕”等范疇,多責(zé)之于外感六淫、飲食不節(jié)、七情內(nèi)傷導(dǎo)致氣血津液布散失常,凝聚成積。現(xiàn)代醫(yī)家多認(rèn)為,PLC病理性質(zhì)是本虛標(biāo)實,發(fā)病的根本原因是正氣虧虛,疫毒侵襲,毒瘀互結(jié)[17],且中西醫(yī)結(jié)合治療PLC有顯著優(yōu)勢[18-19]。

柴芪益肝方中黃芪、柴胡為君,助陽氣生長與通達(dá),促進(jìn)氣血津液運行。乙肝相關(guān)性PLC病位在肝,肝屬木而應(yīng)春令,其性喜條達(dá),黃芪之性溫而上升,以之補肝有同氣相求之妙用。重用黃芪的基礎(chǔ)上加用柴胡可起到助陽、升陽之效。此外,肝體陰而用陽,在補肝助陽的基礎(chǔ)上臣以白芍補肝陰。白芍專入肝脾二經(jīng),入肝經(jīng)則補肝陰,入脾經(jīng)則補中焦脾氣又可助陽。臣以鱉甲、丹參活血化瘀散積。又佐以重樓清熱解毒。諸藥配伍,共奏扶陽抑陰、固本消癥解毒之功。

現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn),柴芪益肝方中的諸多有效成分可通過促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡、抑制肝癌細(xì)胞的增殖與侵襲、下調(diào)HBx蛋白表達(dá)等途徑抑制乙肝相關(guān)性肝癌的進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn),黃芪和丹參提取物通過miR-145/miR-21介導(dǎo)的Smad 3磷酸化抑制腫瘤細(xì)胞遷移,增殖[20]。黃芪多糖促進(jìn)肝癌腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞向M1型極化,有效抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[21]。芍藥苷可激活半胱天冬酶-3的活性并抑制p65和IκB的磷酸化,從而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡[22]。丹參酮ⅡA通過活化半胱天冬酶-3等凋亡分子和p21、細(xì)胞周期蛋白D1、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6等細(xì)胞周期調(diào)控因子來啟動HepG2細(xì)胞的凋亡,促進(jìn)細(xì)胞周期的停滯[23]。細(xì)胞實驗證實,柴胡皂苷D可抑制HBsAg在HepG2.2.15細(xì)胞中的表達(dá)[24],用柴胡皂苷D處理HepG2.2.15細(xì)胞6 h以上時,發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞DNA斷裂且伴隨HBeAg濃度的降低,提示柴胡皂苷D可能通過破壞宿主細(xì)胞核內(nèi)DNA復(fù)制,抑制HBsAg及HBeAg的表達(dá),發(fā)揮抗HBV的作用[25]。此外,柴胡皂苷-b2可以抑制肝癌細(xì)胞侵襲,其機(jī)制與下調(diào)VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白進(jìn)而抑制腫瘤血管生成及腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)降解相關(guān)[26]。重樓皂苷Ⅰ可以抑制HepG2.2.15細(xì)胞中HBx蛋白的表達(dá),而HBx蛋白是乙肝致癌的關(guān)鍵蛋白,可見重樓具有抗病毒、抗肝癌的雙重作用[27]。

本研究結(jié)果表明,西醫(yī)治療聯(lián)合柴芪益肝方可有效提高乙肝相關(guān)性PLC正虛毒瘀型患者5年生存率及5年無進(jìn)展生存率,且服用柴芪益肝方時間越長的患者獲益越大。在BCLC-C/D期,柴芪益肝方組患者生存率及無進(jìn)展生存率均顯著高于西醫(yī)治療組,提示柴芪益肝方可有效改善中、晚、終末期乙肝相關(guān)性PLC患者的生存結(jié)局。

綜上所述,與單純西藥治療相比,聯(lián)合柴芪益肝方可有效改善乙肝相關(guān)性PLC正虛毒瘀證患者的生存結(jié)局,且更適用于中、晚、終末期患者。但本研究的樣本量偏少且為回顧性研究,尚需更大樣本的前瞻性隨機(jī)對照試驗進(jìn)一步驗證,并通過基礎(chǔ)實驗深入分析其作用機(jī)制,為新藥研發(fā)提供基礎(chǔ)。