趙若嵐,董盛,宋亞剛,權偉,馬善波

1.陜西中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院,陜西 咸陽 712046; 2.河南中醫(yī)藥大學,河南 鄭州 450046;3.空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院,陜西 西安 710032

抑郁癥屬于中醫(yī)“郁證”范疇,郁證主要是由情志不舒、氣機郁滯引起的,以心情抑郁、情緒不寧、胸部滿悶或易怒易哭等為主要表現(xiàn)[1]。名老中醫(yī)李可辨治郁證,從中醫(yī)陰陽觀出發(fā),運用《傷寒雜病論》經典方劑四逆湯,形成系統(tǒng)的治療方案。四逆湯由甘草(炙)、干姜、附子(生用,去皮)三味藥組成,基于此方,逐日增加附子用量,即可有效緩解抑郁癥狀[2-3],但其藥效物質基礎和作用機制尚不清楚。

中藥藥效物質是指能夠反映中藥臨床療效的化學成分群。這些成分是中藥在進入機體后,作用于多個靶點并產生整體治療效果的化學組分[4]。虛擬篩選和分子對接技術能夠將已知的小分子活性物質與相關靶蛋白進行對接,從而在分子層面闡明中藥效應成分與靶標之間的作用機制。目前,這項技術在揭示中藥藥效物質基礎與心血管疾病、癌癥等眾多疾病的病理機制方面都發(fā)揮重要作用[5]。

藥物靶點是藥物發(fā)揮治療作用的生物大分子,其中蛋白質是最重要的藥物靶點[6]。目前,臨床上使用的抗抑郁藥物主要是基于“單胺神經遞質假說”而研發(fā),包括選擇性5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)再攝取抑制劑、選擇性去甲腎上腺素(norepinephrine,NA)再攝取抑制劑、選擇性NA/5-HT再攝取抑制劑以及單胺氧化酶抑制劑(monoamine oxidase inhibitor,MAOI)等[7]。這些靶點不僅是抗抑郁藥物的“可成藥”靶點,也是研究相對成熟的靶點。中藥作用靶點的發(fā)現(xiàn)對于闡明中藥的作用機制具有重要意義。

因此,本研究首先檢索四逆湯的化學成分,并結合類藥五原則、口服生物利用度等參數(shù)進行篩選。然后,采用Discovery StudioTM2016軟件,對化合物與抗抑郁藥物作用靶點進行分子對接,探索兩者的親和力與結合模式。最后,采用小鼠海馬神經元細胞系HT22細胞和小鼠抑郁模型,觀察四逆湯活性成分的抗抑郁作用,初步闡明四逆湯抗抑郁的藥效物質基礎。

1 材料

1.1 動物清潔級健康C57BL/6雄性小鼠,體質量(20±1) g,購自陜西中醫(yī)藥大學實驗動物中心,實驗動物生產許可證號:SCXK(陜)2021-001,實驗動物使用許可證號:SYXK(陜)2021-001。本實驗經陜西中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準,倫理審批編號:SUCMDL20230620003。

1.2 細胞小鼠海馬神經元HT22細胞,購自武漢梓杉生物技術有限公司,貨號:STCC20011P。

1.4 儀器懸尾實驗測試儀、強迫游泳實驗測試儀(上海欣軟信息科技有限公司,型號:XR-XX203、XR-XQ202);CO2細胞培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器有限公司,型號:BPN-80CRH);熒光顯微鏡(OLYMPUS 光學技術公司,型號:BX53M)。

2 方法

2.1 四逆湯抗抑郁的關鍵活性成分篩選

2.1.1 四逆湯活性成分篩選通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)[8]檢索四逆湯三味中藥(甘草、干姜、附子)的活性成分。根據(jù)類藥五原則及相關條件進行二次篩選:(1)分子量<500;(2)脂水分配系數(shù)<5;(3)氫鍵給體數(shù)目<5;(4)氫鍵受體數(shù)目<10;(5)口服生物利用度>50%;(6)類藥性>0.18,最終得到的化合物以mol2的格式保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 抑郁癥作用靶點篩選通過RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)[9]檢索抑郁癥相關靶點,分別以“serotonin transporter 5i71”“dopamine transporter 4m48”“monoamine oxidase A 2z5x”“histamine receptor H1 3rze”作為關鍵詞,檢查相應的靶蛋白并下載pdb格式的文件。

2.1.3 分子對接與關鍵活性成分篩選采用Discovery StudioTM2016分子對接軟件,對靶蛋白進行預處理,將其作為受體分子;將四逆湯活性成分作為配體分子,設置配體所在位置為活性中心。將受體與配體進行分子對接,即可觀察受體蛋白氨基酸殘基與配體對接間的非鍵相互作用力,也可生成配體-蛋白相互作用的二維平面圖,從而直觀觀察兩者的相互作用及關鍵的氨基酸基團。同時,計算對接的Cdocker Energy,包含配體分子內能、與受體的相互作用能。為了避免高得分化合物的屏蔽作用,減少假陰性化合物的產生,選取與靶蛋白的親和數(shù)、親和力排名前15位的化合物作為關鍵活性成分。

（1）上消化道出血相關知識的掌握情況：采用自制調查表，了解干預前后兩組患者對上消化道出血相關知識的掌握程度。共25題，每題4分，總分100分，得分≥90分，掌握程度為優(yōu)；70～89分，掌握程度為中；＜70分，掌握程度為差；（2）對兩組患者的生活質量狀況采用生活質量調查量表[5]進行評價，該量表共35個條目，分為日常生活能力、社會活動能力、焦慮心理狀態(tài)、抑郁心理狀態(tài)4個維度，每個條目1～4分，總分范圍35～140分，總分越高意味著個體的生活質量越低。入院護理查體時和出院前進行出院指導時，以同樣的方法和量表調查兩組患者的生活質量狀況。

2.2 四逆湯活性成分抗抑郁的實驗研究

2.2.1 細胞實驗

2.2.1.1 藥物制備精密稱取(R)-去甲烏頭堿、甘草素、山柰酚及皮質酮適量,分別加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,配置濃度為1 mol·L-1的藥液。

2.2.1.2 HT22細胞培養(yǎng)HT22細胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)期生長的細胞,以1×105mL-1的密度接種至24孔板,培養(yǎng)過夜后細胞貼壁生長,待細胞密度達到70%時,分為空白組、模型組、(R)-去甲烏頭堿組、甘草素組和山柰酚組。除空白組外,其余各組細胞先加入皮質酮200 μL培養(yǎng)24 h,建立體外抑郁模型[10],隨后加入相應藥物100 μL干預 24 h,光學顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)并拍照。

2.2.1.3 TUNEL染色觀察細胞凋亡情況采用TUNEL試劑盒檢測細胞凋亡情況,按照試劑盒說明書進行操作。收集HT22細胞,4%冷乙醇固定細胞30 min,洗滌后對細胞進行蛋白酶消化,以去除背景蛋白質干擾。將配置好的TUNEL溶液滴加到細胞上,反應1 h,加入終止液停止反應,倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.2.2 動物實驗

2.2.2.1 藥物制備精密稱取(R)-去甲烏頭堿、甘草素、山柰酚適量,分別加入生理鹽水配成質量濃度為1 g·L-1、1.5 g·L-1、2 g·L-1的藥液。

2.2.2.2 小鼠抑郁模型建立40只小鼠隨機分為空白組、模型組、(R)-去甲烏頭堿組(10 mg·kg-1)、甘草素組(15 mg·kg-1)、山柰酚組(20 mg·kg-1),每組8只。除空白組外,其余各組小鼠采用慢性不可預見性溫和應激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)結合孤養(yǎng)的方式建立抑郁模型。刺激因素包括:熱水游泳5 min(45 ℃),夾尾5 min,冷水游泳5 min(6 ℃),人工水平震蕩5 min,夜間強光照射 5 min,禁食24 h,禁水24 h。每天隨機選取1種應激源,連續(xù)28 d[11]。造模首日開始給藥,每日1次,空白組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃。

2.2.2.3 行為學檢測方法(1)強迫游泳實驗(forced swimming test,FST):將小鼠放入盛水的透明玻璃桶中,水溫(22±1)℃,水深12 cm。通過高清數(shù)碼攝像機記錄小鼠6 min內的活動情況,然后采用雙盲法計算第2—6 min小鼠不動行為的時間。不動行為的判斷標準為:小鼠停止掙扎,呈漂浮直立狀態(tài),僅有偶而的肢體運動以保持頭部浮在水面,身體無屈曲或扭動[12]。(2)懸尾實驗(tail suspension test,TST):使用膠帶固定小鼠尾巴,固定位置距離尾尖大約1 cm;懸掛小鼠,頭部距離桌面約10 cm;高清數(shù)碼攝像機采集圖像,采用雙盲法分析小鼠在6 min內的不動時間[13]。(3)糖水偏愛實驗(sucrose preference test,SPT):末次灌胃后,小鼠禁食禁水24 h,每籠放置1%糖水和普通飲用水,為了避免小鼠產生位置偏好,每1 h交換水瓶位置,2 h后取下水瓶并稱重,計算糖水偏愛度[14]。

糖水偏愛度 =糖水消耗量(g)/[糖水消耗量(g)+普通水消耗量(g)]×100%

3 結果

3.1 四逆湯抗抑郁的關鍵活性成分篩選

3.1.1 四逆湯活性成分與抑郁癥靶點通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取四逆湯活性成分493個,其中干姜148個,甘草280個,附子65個。根據(jù)類藥五原則及相關條件篩選得到91個化合物,占總化合物的18.5%。通過RCSB PDB數(shù)據(jù)庫檢索得到抑郁癥作用靶點4個,即單胺氧化酶A(monoamine oxidase A,MAO-A)、多巴胺轉運體(dopamine transporter,DAT)、5-羥色胺轉運體(serotonin transporter,SERT)、組胺H1受體(histamine H1 receptor,H1R)。

3.1.2 四逆湯抗抑郁癥的關鍵活性成分通過Discovery StudioTM2016對91個活性成分與4個靶點進行分子對接,篩選出15個關鍵活性成分,包括(R)-去甲烏頭堿、山柰酚、甘草素、甘草黃酮醇等,見表1。

表1 四逆湯抗抑郁的關鍵活性成分信息

3.1.3 關鍵活性成分與4個靶點的親和力將15個關鍵活性成分與4個靶點進行分子對接,取Cdocker Energy排名前10位的結果予以展示,見表2。其中,MAO-A與(R)-去甲烏頭堿、甘草黃酮醇A、山柰酚的親和力最強;DAT與甘草素、異甘草素、(R)-去甲烏頭堿的親和力最強;H1R與山柰酚、甘草素、異甘草素的親和力最強;SERT與(R)-去甲烏頭堿、甘草黃酮醇A、山柰酚的親和力最強。

表2 分子對接結合能 (kcal·mol-1)

3.1.4 四逆湯關鍵成分與抑郁癥靶點的結合模式選取與每個靶點親和力最強的化合物,繪制活性成分與靶點結合圖,可直觀觀察兩者的結合模式以及與周圍氨基酸殘基的相互作用。SERT的活性空腔主要由Ile172、Ala173、Tyr176、Phe341、Phe335、Gly338、Ser438、Leu443等組成,(R)-去甲烏頭堿占據(jù)了SERT的活性空腔,且與Phe335、Gly338、Ser438存在較好的疏水作用,與Ile172、Ala173、Phe341、Leu443存在較好的π-π共軛。(R)-去甲烏頭堿占據(jù)了由殘基Gly67、Asn180、Asn181、Gln215、Ile335、Tyr407和Met445形成的MAO-A活性空腔,其氨基與Asn181形成一個氫鍵,其環(huán)狀結構與Tyr407形成π-π堆積作用。DAT的活性空腔Ala44、Asp121、Ser320、Ser422、Ser421均為疏水殘基,推測疏水作用是甘草素與DAT結合的主要推動作用。另外,Val120存在疏水作用,且與Tyr431、Phe432存在T型的π-π堆積作用,見圖1。

注:A:SERT與(R)-去甲烏頭堿;B:MAO-A與(R)-去甲烏頭堿;C:DAT與甘草素;D:H1R與山柰酚。

3.2 四逆湯活性成分的抗抑郁作用

3.2.1 (R)-去甲烏頭堿、甘草素及山柰酚對HT22細胞形態(tài)的影響空白組細胞光澤度好,突起交錯分布且相互連接,有較為明顯的突起相連形態(tài)。模型組細胞光澤度較差,突起連接部分斷裂消失,可見細胞變圓皺縮。與模型組比較,(R)-去甲烏頭堿組細胞形態(tài)皺縮減輕,分布較為規(guī)則,有一定的突起連接形態(tài);甘草素組細胞光澤度較好,形態(tài)皺縮減輕,存在突起相連形態(tài);山柰酚組細胞形態(tài)皺縮減輕,存在突起連接形態(tài),見圖2。

注:A:空白組;B:模型組;C:(R)-去甲烏頭堿組;D:甘草素組;E:山柰酚組。

3.2.2 (R)-去甲烏頭堿、甘草素及山柰酚對HT22細胞凋亡的影響空白組基本未見細胞凋亡;與空白組比較,模型組細胞凋亡增加;與模型組比較,(R)-去甲烏頭堿組、甘草素組及山柰酚組細胞凋亡減少,見圖3。

注:A:空白組;B:模型組;C:(R)-去甲烏頭堿組;D:甘草素組;E:山柰酚組。

3.2.3 (R)-去甲烏頭堿、甘草素及山柰酚對CUMS小鼠行為學的影響與空白組比較,模型組小鼠糖水偏愛度降低(P<0.05);與模型組比較,(R)-去甲烏頭堿組小鼠糖水偏愛度升高(P<0.05)。與空白組比較,模型組小鼠不動時間(TST和FST)均增加(P<0.05);與模型組比較,甘草素組小鼠TST不動時間減少(P<0.05),(R)-去甲烏頭堿組、甘草素組小鼠FST不動時間減少(P<0.05),見圖4。

注:A:糖水偏愛度;B:TST不動時間;C:FST不動時間;與空白組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05。

4 討論

名老中醫(yī)李可將《傷寒雜病論》的六經辨證思想應用于臨床遣方用藥,尤善附子、烏頭等峻藥治療危重患者。四逆湯是張仲景治療心腎陽衰寒厥證的代表方劑,李可臨床應用四逆湯不限于少陰病,還將其用于抑郁癥、咳喘、足心發(fā)熱等病[15]。本研究采用“虛擬篩選-分子對接-活性評價”的中藥新藥發(fā)現(xiàn)與評價新模式,深入挖掘四逆湯的藥效物質基礎,為該方的二次開發(fā)提供思路,這也是中藥現(xiàn)代化研究的一個重要方向。

本研究發(fā)現(xiàn)四逆湯抗抑郁的15個關鍵活性成分,包括(R)-去甲烏頭堿、山柰酚、甘草素、甘草黃酮醇A、3,4,5,7-四羥基-8-甲氧基黃酮、異甘草素等。這些化合物富含黃酮類成分,已有文獻報道黃酮類化合物具有抗抑郁作用[16]。研究表明,山柰酚具有抗癌、抗癲癇、抗炎、抗氧化等作用[17]。王佳等[18]研究發(fā)現(xiàn),山柰酚具有抗大鼠抑郁的作用,能提高抑郁大鼠腦內NA、多巴胺、5-HT水平,與本研究的虛擬篩選結果一致。(R)-去甲烏頭堿是一種含氮原子的雜環(huán)化合物,廣泛存在于藥用植物中,具有多種藥理活性,如抗炎、擴張血管、抗心律失常等[19]。本研究發(fā)現(xiàn),(R)-去甲烏頭堿與MAO-A、SERT具有較強的親和力,可能是四逆湯抗抑郁的藥效物質之一。此外,本研究發(fā)現(xiàn)甘草素與DAT、H1R具有很強的親和力,甘草素或有可能開發(fā)成為具有抗抑郁活性的先導化合物。因此,四逆湯的活性成分可能通過抑制DA等神經遞質代謝、減少5-HT攝取、抑制H1R活性等機制發(fā)揮抗抑郁作用。

分子對接結果表明,(R)-去甲烏頭堿占據(jù)SERT的活性空腔,與Ile172、Ala173、Phe341、Leu443存在較好的π-π共軛。Henry等[20]通過定點突變實驗發(fā)現(xiàn),Ile172是SERT的關鍵殘基,與本研究結果相符。(R)-去甲烏頭堿占據(jù)MAO-A的活性空腔,其氨基與Asn181形成氫鍵,環(huán)狀結構與Tyr407形成π-π堆積作用。Upadhyay等[21]研究表明,與Asn181、Tyr407的相互作用是決定化合物能否與MAO-A活性中心結合的關鍵,這與本研究的結果一致。另外,肉葉蕓香堿與Tyr407也存在π-π堆積作用,這表明Tyr407可能是影響化合物與MAO-A結合的關鍵殘基之一。DAT的活性空腔組成均為疏水殘基,且與Val120存在較好的π-π共軛。Penmatsa等[22]研究表明,與Val120的相互作用是抗抑郁活性的關鍵。山柰酚的3號、7號、1號氧原子與Ser111、Thr194、Tyr431形成氫鍵,環(huán)狀結構與Tyr108、Trp428、Phe432、Phe435、Ile454存在疏水作用,且與Tyr431、Phe432存在T型π-π堆積作用。Heifetz等[23]研究表明,Asp107、Tyr108、Ser111、Thr112、Phe432、Tyr458是H1R與化合物作用的關鍵殘基。

分子對接技術尚存在諸多缺陷和局限性,其結果不能取代實驗數(shù)據(jù),在很多情況下需要結合其它方法加以驗證[24]。本研究采用皮質酮刺激HT22細胞模擬體外抑郁狀態(tài),發(fā)現(xiàn)(R)-去甲烏頭堿、甘草素及山柰酚能夠有效保護皮質酮刺激下的HT22細胞。CUMS模型具有良好的抑郁癥表面效度、結構效度和預測效度,主要模擬抑郁癥的快感缺失癥狀。這種癥狀在造模成功后可持續(xù)數(shù)周,并被抗抑郁藥物逆轉[25]。本研究發(fā)現(xiàn),(R)-去甲烏頭堿、甘草素及山柰酚可有效緩解抑郁模型大鼠的抑郁情緒和絕望情緒。

綜上所述,本研究采用中藥新藥發(fā)現(xiàn)與評價的新模式“虛擬篩選-分子對接-活性評價”,深入挖掘四逆湯抗抑郁的物質基礎主要為(R)-去甲烏頭堿、甘草素及山柰酚,為四逆湯的二次開發(fā)奠定基礎。