謝希,李玲,石曄,鄧漢清,婁宏君,高曦

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150040; 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410208;3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410208; 4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410208;5.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150040

腰椎間盤(pán)突出癥(lumbar disc herniation,LDH)是因腰椎間盤(pán)變性、纖維環(huán)破裂、髓核組織突出壓迫和刺激腰骶神經(jīng)根、馬尾神經(jīng)所引起的一種綜合征[1]。LDH的臨床表現(xiàn)主要為腰背部疼痛、僵硬、活動(dòng)受限、下肢麻木,嚴(yán)重者甚至可出現(xiàn)大小便困難等癥狀。目前,針對(duì)LDH的治療可分為保守治療和手術(shù)治療,其中保守治療是大多數(shù)初發(fā)患者的首選方式,主要形式為臥床休息、藥物治療、運(yùn)動(dòng)療法、硬膜外注射、腰椎牽引和中醫(yī)治療等,且多數(shù)患者經(jīng)過(guò)保守治療后臨床癥狀得到減輕,有的還會(huì)出現(xiàn)腰椎間盤(pán)重吸收現(xiàn)象[2]。研究顯示,經(jīng)過(guò)中醫(yī)保守治療后,320例患者的腰椎間盤(pán)突出率顯著下降,其中189例患者的突出吸收率>30%,81例患者的突出吸收率>50%,表明中醫(yī)保守治療LDH具有潛在優(yōu)勢(shì)[3]。脊痛消膠囊是黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院院內(nèi)制劑,由當(dāng)歸、澤瀉和川芎等14味中藥組成,具有清熱利尿、活血化瘀、通經(jīng)止痛的功效,臨床常用其治療LDH和頸椎病,療效確切[4-6]。該藥組分復(fù)雜,作用靶點(diǎn)繁多,深入闡明其治療LDH的物質(zhì)基礎(chǔ)和藥效機(jī)理對(duì)于其臨床運(yùn)用和現(xiàn)代藥理學(xué)研究具有重要價(jià)值。近年來(lái),網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)成為研究中藥組方有效成分體系與病證復(fù)雜生物系統(tǒng)相互作用關(guān)系的重要方法,其核心理念為“網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)”,將方藥和病證映射于生物分子網(wǎng)絡(luò),從分子和信號(hào)通路等層面對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行解析,根據(jù)生物分子在網(wǎng)絡(luò)中的重要性度量,篩選關(guān)鍵靶標(biāo)和有效成分,從而對(duì)方藥-疾病的作用機(jī)制和有效成分進(jìn)行機(jī)制性地計(jì)算和預(yù)測(cè)[7]。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)脊痛消膠囊治療LDH的靶標(biāo)和成分進(jìn)行預(yù)測(cè),再進(jìn)一步利用分子對(duì)接技術(shù)和體外實(shí)驗(yàn)對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,以期為脊痛消膠囊的臨床運(yùn)用提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 脊痛消膠囊有效成分和靶點(diǎn)收集在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology,TCMSP)數(shù)據(jù)庫(kù)中收集脊痛消的化學(xué)成分,以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和類(lèi)藥性(drug likeness,DL)≥0.18為條件篩選有效成分,并收集其作用靶點(diǎn);由于地龍和五靈脂未被TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)收納,故在BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)收集五靈脂的化學(xué)成分和作用靶點(diǎn),在中醫(yī)藥資料@Taiwan數(shù)據(jù)庫(kù)收集地龍的化學(xué)成分,并將檢索到的化學(xué)成分導(dǎo)入SwissADME數(shù)據(jù)庫(kù),以Gatrointestinal absorption為High,Drug likeness 5個(gè)指標(biāo)中滿足兩個(gè)為條件篩選兩者的有效成分,然后以Probability>0為條件在Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)其作用靶點(diǎn)。利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org)對(duì)蛋白靶點(diǎn)名稱進(jìn)行校正,以“Homo sapiens”為種屬來(lái)源,刪除未經(jīng)驗(yàn)證和無(wú)對(duì)應(yīng)基因名的蛋白靶點(diǎn),得到蛋白靶點(diǎn)的官方基因名稱。

1.2 LDH靶點(diǎn)收集在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.omim.org)和DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.disgenet.org)中以“l(fā)umbar disc herniation”為關(guān)鍵詞檢索疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選利用Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)對(duì)成分靶點(diǎn)和LDH靶點(diǎn)進(jìn)行映射獲得潛在靶點(diǎn),隨后將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org),設(shè)置置信度為0.7,隱藏網(wǎng)絡(luò)中孤立的節(jié)點(diǎn),將結(jié)果保存為T(mén)SV格式文件并在Cytoscape 3.9.1軟件中對(duì)PPI進(jìn)行分析,構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò),利用軟件中的插件CytoNCA篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4 “藥物-活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將交集靶點(diǎn)與有效化學(xué)成分導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件構(gòu)建“藥物-活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

1.5 富集分析將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入R Studio軟件,利用clusterProfiler包對(duì)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(Gene Ontology,GO)功能富集分析、京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,設(shè)置P<0.05,物種為Homo sapiens,再通過(guò)ggplot2包對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.6 分子對(duì)接從Protein Data Bank(PDB)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org)下載各靶點(diǎn)基因的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu),從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)下載藥物活性成分的3D結(jié)構(gòu),運(yùn)用AutoDockTools軟件對(duì)受體蛋白和配體小分子進(jìn)行加氫、平衡電荷等修飾。利用AutoDock Vina軟件對(duì)受體蛋白與配體小分子進(jìn)行分子對(duì)接,結(jié)合能打分,Pymol和Discovery Studio軟件將對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.7 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.7.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雄性SD大鼠50只,購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司,體質(zhì)量200～220 g,許可證號(hào):SYXK(湘)2019-0009,飼養(yǎng)溫度 22～24 ℃,相對(duì)濕度40%～60%。本研究經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審批通過(guò),批號(hào):2022030102。

1.7.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器脊痛消膠囊(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,每粒0.25 g,批號(hào):黑藥制字Z20100379);塞來(lái)昔布膠囊(輝瑞制藥有限公司,每粒0.2 g,批號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字J20140072);c-JUN、p-c-JUN、c-FOS、p-c-FOS、JNK、p-JNK、p38-MAPK和p-p38-MAPK抗體(貨號(hào):bsm-42050M、bs-1735R、bsm-33204M、bs-12910R、bs-2592R、bs-4163R、bs-0637R、bs-2210R,北京Bioss);IL-6、IL-10、TNF-α的ELISA試劑盒(貨號(hào):E-EL-R0015c、E-EL-R0016c、E-EL-R2856c,武漢Elabscience);BCA試劑盒(C05-02001,北京Bioss)。多功能酶標(biāo)儀(Infinite?M Nano+,瑞士Tecan);石蠟切片機(jī)(A0820,美國(guó)華納-蘭伯特技術(shù)公司);電泳儀(Mini-ProteanTetra,美國(guó)Biorad);微量移液器(FinnpipetteTMF2,美國(guó)Thermo)。

1.7.3 造模與分組50只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、脊痛消膠囊低劑量組、脊痛消膠囊高劑量組和塞來(lái)昔布組,參考杜肖勛等[8]的造模方法,其中模型組、脊痛消膠囊組、塞來(lái)昔布組中取大鼠第3、4尾椎椎間盤(pán)2個(gè),以10 mL針頭刺破椎間盤(pán)正中纖維環(huán),暴露并取出髓核,并將其置于硬膜外腔暴露處,隨后逐層縫合,并于傷口處涂抹紅霉素眼膏。假手術(shù)組大鼠僅暴露椎間盤(pán),不作其他處理。按照人與動(dòng)物體表面積換算法,脊痛消膠囊低劑量組和高劑量組分別按照0.57 g·kg-1和1.14 g·kg-1灌胃給藥,塞來(lái)昔布組按照0.02 g·kg-1灌胃給藥,假手術(shù)組給予等量體積生理鹽水,14 d后處死動(dòng)物。

1.7.4 組織蛋白測(cè)定水合氯醛麻醉后,取大鼠椎間盤(pán)髓核組織,PBS沖洗兩次,RIPA提取總蛋白,BCA法定量蛋白濃度,電泳2 h,轉(zhuǎn)移到PVDF膜,封閉2 h,按照11 000 比例孵育一抗過(guò)夜,TBST洗滌3次,每次10 min,按照15 000比例孵育二抗 2 h,TBST洗滌,顯影,Image J軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.7.5 血清細(xì)胞因子測(cè)定大鼠行腹主動(dòng)脈采血,離心后收集血清,免疫酶聯(lián)吸附法檢測(cè)血清中白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6、IL-10和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

2 結(jié)果

2.1 脊痛消膠囊有效化學(xué)成分和靶點(diǎn)收集收集到脊痛消膠囊有效成分:白芍13種、車(chē)前子9種、川芎7種、澤蘭2種,當(dāng)歸2種、杜仲28種、莪術(shù)3種、防己3種、黃芪20種、三棱5種、延胡索49種、澤瀉10種、五靈脂7種和地龍5種,去重后共獲得139種活性成分。收集到作用靶點(diǎn):白芍123個(gè)、車(chē)前子195個(gè)、川芎42個(gè)、澤蘭69個(gè)、當(dāng)歸69個(gè)、杜仲532個(gè)、莪術(shù)24個(gè)、防己47個(gè)、黃芪462個(gè)、三棱140個(gè)、延胡索1 098個(gè)、澤瀉9個(gè)、五靈脂115個(gè)和地龍248個(gè)。靶點(diǎn)去重后獲得479個(gè)靶點(diǎn),見(jiàn)圖1。

圖1 脊痛消膠囊與LDH靶點(diǎn)映射結(jié)果

2.2 LDH靶點(diǎn)收集在3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中共檢索到590個(gè)與LDH相關(guān)的靶點(diǎn),見(jiàn)圖1。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選將上述獲得的化學(xué)成分靶點(diǎn)與TNBC靶點(diǎn)取交集后,得到潛在作用靶點(diǎn),共84個(gè),將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org),設(shè)置置信度為0.7,隱藏網(wǎng)絡(luò)中孤立的節(jié)點(diǎn),將結(jié)果保存為T(mén)SV格式文件并在Cytoscape 3.9.1軟件中,對(duì)蛋白相互作用結(jié)果進(jìn)行分析,構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò),見(jiàn)圖2,利用Cytoscape 3.9.1軟件中的插件CytoNCA進(jìn)行關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選,根據(jù)度值獲得排名前10位的核心靶點(diǎn),見(jiàn)表1。

表1 核心靶點(diǎn)信息

圖2 PPI可視化結(jié)果

2.4 “藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將交集靶點(diǎn)與有效化學(xué)成分導(dǎo)入Cytoscape3.9.1軟件構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),該網(wǎng)絡(luò)共217個(gè)節(jié)點(diǎn),594條邊,其中紫色三角形節(jié)點(diǎn)代表藥物,黃色圓形節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn),綠色菱形節(jié)點(diǎn)代表活性成分,度值越大者節(jié)點(diǎn)越大,見(jiàn)圖3。

圖3 “藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

借助R語(yǔ)言進(jìn)行生物過(guò)程(biological process,BP)、細(xì)胞組成(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)分析,制作結(jié)果排名前10位的柱狀圖和氣泡圖。生物過(guò)程主要涉及上皮細(xì)胞增殖、腺體發(fā)育、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌起源的分子的反應(yīng)、對(duì)活性氧的反應(yīng)、肌肉細(xì)胞增殖、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、傷口愈合、對(duì)MAPK信號(hào)通路的正調(diào)控等;細(xì)胞組成主要包括膜筏、膜微區(qū)、含有膠原蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)、囊泡腔、細(xì)胞外顆粒腔、血小板α顆粒管腔、黏著斑等;分子功能主要涉及信號(hào)受體激動(dòng)劑、受體配體活性、細(xì)胞因子及其受體活性、內(nèi)肽酶活性、絲氨酸型肽酶活性、生長(zhǎng)因子受體結(jié)合等,見(jiàn)圖4。

注:A:柱狀圖;B:氣泡圖。X軸表示計(jì)數(shù)或者基因比例的顯著增加;Y軸代表GO功能富集分析中的“生物學(xué)過(guò)程”“細(xì)胞組分”和“分子功能”。

2.5 KEGG通路富集分析KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,交集基因主要涉及糖尿病中的AGE-RAGE信號(hào)通路、流體剪切力和動(dòng)脈粥樣硬化、IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、癌癥中的蛋白聚糖、前列腺癌、松弛素信號(hào)通路、膀胱癌、恰加斯病、人巨細(xì)胞病毒感染、胰腺癌、乙型肝炎、結(jié)直腸癌、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、內(nèi)分泌抵抗、MAPK信號(hào)通路、Toll樣信號(hào)通路、丙型肝炎、百日咳、甲型流感、肺結(jié)核、FoxO信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑抗性、C型凝集素受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑通路等,見(jiàn)圖5。

注:A:柱狀圖;B:氣泡圖。X軸表示計(jì)數(shù)或者基因比例的顯著增加;Y軸表示主要的信號(hào)通路。

2.6 分子對(duì)接Autodock Vina軟件對(duì)化學(xué)成分和PPI篩選出的核心靶點(diǎn)STAT3(PBD ID:6NUQ),JUN(PBD ID:1S9K),MAPK14(PBD ID:5LAR),MAPK1(PBD ID:2Y9Q),AKT1(PBD ID:4EKL),CTNNB1(PBD ID:1QZ7),FOS(PBD ID:1A02),IL-10(PBD ID:1ILK),IL-6(PBD ID:4CNI),TNF(PBD ID:2AZ5)進(jìn)行分子對(duì)接,結(jié)合能≤5 kcal·mol-1即表明活性成分與靶點(diǎn)有較強(qiáng)的結(jié)合活性(圖6)。Pymol和Discovery Studio軟件將對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化,活性成分與作用靶點(diǎn)之間主要是通過(guò)氫鍵、π-π作用等分子作用力形成較強(qiáng)結(jié)合力,見(jiàn)圖7。

圖6 分子對(duì)接結(jié)合能熱圖

注:A:AKT1-二氫血根堿(Dihydrosanguinarine);B:TNF-荷包牡丹堿(Bicuculline);C:MAPK14-二氫血根堿(Dihydrosanguinarine);D:IL-6-西加小冠花苷(Hyrcanoside)。

2.7 各組大鼠髓核組織p-c-JUN/c-JUN、p-c-FOS/c-FOS、p-JNK/JNK、p-p38-MAPK/p38-MAPK水平比較與假手術(shù)組比較,模型組大鼠髓核組織p-c-JUN/c-JUN、p-c-FOS/c-FOS、p-JNK/JNK、p-p38-MAPK/p38-MAPK水平均顯著升高(P<0.05);與模型組比較,脊痛消膠囊低劑量組和高劑量組、塞來(lái)昔布組髓核組織p-c-JUN/c-JUN、p-c-FOS/c-FOS、p-JNK/JNK、p-p38-MAPK/p38-MAPK水平均顯著降低(P<0.05),見(jiàn)表2、圖8。

表2 各組大鼠髓核組織p-c-JUN/c-JUN、p-c-FOS/c-FOS、p-JNK/JNK、p-p38-MAPK/p38-MAPK水平

注:A:假手術(shù)組;B:模型組;C:脊痛消膠囊低劑量組;D:脊痛消膠囊低劑量組;E:塞來(lái)昔布組。

2.8 各組大鼠血清IL-6、IL-10、TNF-α水平比較與假手術(shù)組比較,模型組血清IL-6和 TNF-α 水平顯著升高(P<0.05),IL-10水平顯著降低(P<0.05);與模型組比較,脊痛消膠囊低劑量組和高劑量組、塞來(lái)昔布組血清IL-6和TNF-α水平顯著降低(P<0.05),IL-10水平顯著升高(P<0.05),見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清IL-6、IL-10、TNF-α水平

3 討論

LDH是引起老年人腰腿痛的常見(jiàn)原因,且該病的發(fā)生逐漸年輕化。肥胖[9]、吸煙[10]和缺乏運(yùn)動(dòng)[11]等不良生活習(xí)慣均會(huì)增加LDH的發(fā)生率。疼痛是LDH最主要的癥狀。LDH疼痛產(chǎn)生的機(jī)制主要有機(jī)械壓迫機(jī)制、炎癥化學(xué)刺激機(jī)制、自身免疫反應(yīng)機(jī)制等[12]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析脊痛消膠囊治療LDH的作用機(jī)制,對(duì)脊痛消膠囊和LDH映射得到的分子生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用分析發(fā)現(xiàn),重要性最大的前10個(gè)靶標(biāo)是STAT3、JUN、IL-6、MAPK1、FOS、CTNNB1、MAPK14、AKT1、IL-10 和TNF。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),分子生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)涉及的信號(hào)通路主要有AGE-RAGE信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路和Toll樣信號(hào)通路等。STAT3是STAT家族之一,由770個(gè)氨基酸組成,收到激活因子如干擾素、IL-6 和IL-10后,通過(guò)Janus酪氨酸激酶和MAPKs通路二聚化并從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡和免疫應(yīng)答等生物學(xué)過(guò)程[13]。研究發(fā)現(xiàn),LDH會(huì)增加背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的興奮性,上調(diào)RAGE和p-STAT3蛋白的表達(dá)[14],提示RAGE/STAT3信號(hào)通路的激活是LDH引發(fā)疼痛的重要機(jī)制。p38-MAPK和JNK屬于MAPK信號(hào)通路的分支[15]。JNK通路是在受到感染、炎癥和氧化應(yīng)激等刺激后被激活的,隨后磷酸化其底物JUN、FOS、ATF2和p53等,磷酸化的JUN和FOS結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白1(activator protein-1,AP-1)從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化以及凋亡等[16]。在LDH大鼠模型中觀察到p-JNK/JNK的比例顯著升高[17],通過(guò)抑制JNK信號(hào)通路的激活可以顯著改善LDH模型的神經(jīng)根性疼痛癥狀[18]。p38-MAPK家族有4種同型:p38α(MAPK14)、p38β(MAPK11)、p38γ(MAPK 12)和p38δ(MAPK13),在過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的人軟骨終板細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型中,p38-MAPK信號(hào)通路被激活,p-p38-MAPK/p38-MAPK比例顯著升高,提示p38-MAPK通路在腰椎間盤(pán)退變中的重要作用[19]。本研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分發(fā)現(xiàn),在LDH模型大鼠中p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、p-c-Fos/c-Fos、p-p38-MAPK/p38-MAPK的比例顯著升高,與現(xiàn)有研究結(jié)果一致。

炎癥反應(yīng)是引發(fā)LDH疼痛的重要因素。IL是一類(lèi)由白細(xì)胞產(chǎn)生并調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子家族,IL-6是一種炎癥介質(zhì),來(lái)源于多種免疫細(xì)胞,如巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等,在炎癥反應(yīng)中,IL-6可以誘導(dǎo)其他炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生,如IL-1和TNF-α,促進(jìn)白細(xì)胞的增殖、活化,促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖從而實(shí)現(xiàn)組織的修復(fù)。有研究發(fā)現(xiàn),IL-6水平與患者疼痛程度呈正相關(guān)[20]。另有研究發(fā)現(xiàn),較高的血清IL-6水平與患者的恢復(fù)不佳相關(guān)[21]。TNF是一種Ⅱ型跨膜蛋白,作為三聚體在質(zhì)膜上表達(dá),被TNF-α轉(zhuǎn)化酶切割產(chǎn)生可溶性配體,通過(guò)與TNF受體1和TNF受體2結(jié)合傳導(dǎo)信號(hào),TNF受體1可以激活NF-κB和MAPK信號(hào)通路從而介導(dǎo)細(xì)胞死亡,在TNF信號(hào)通路傳導(dǎo)中起主要作用[22]。TNF-α可以誘導(dǎo)髓核細(xì)胞中炎癥因子IL-1β、IL-4、IL-6的產(chǎn)生,NF-κB和MAPK信號(hào)通路的激活,抑制該通路的激活可以使LDH模型大鼠得到保護(hù)[23]。作為一種抗炎因子,IL-10的保護(hù)作用得到了廣泛研究。自體髓核突出誘導(dǎo)的LDH大鼠模型中,背根神經(jīng)節(jié)中的IL-10水平顯著下降,TNF-α水平顯著升高,髓鞘內(nèi)人工注射 IL-10 可以顯著減輕模型大鼠的疼痛,且該效應(yīng)能被TNF-α抑制,體現(xiàn)了兩者的相互拮抗作用[24]。本研究中,脊痛消膠囊能顯著降低LDH大鼠血清 IL-6 和TNF-α水平,提高IL-10的水平,說(shuō)明脊痛消膠囊可以抑制炎癥反應(yīng),提高LDH的抗炎能力。

LDH屬中醫(yī)“腰痹”“痹證”范圍,根本病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí),腎虛和風(fēng)寒濕熱為主要致病因素?！端貑?wèn)·脈要精微論》云:“腰者,腎之府,轉(zhuǎn)搖不能,腎將憊矣。”腎主骨,生髓,腎虛髓?？仗?腰部的骨骼經(jīng)脈得不到濡養(yǎng),導(dǎo)致腰部疼痛,活動(dòng)受限?！端貑?wèn)·痹論》記載:“風(fēng)寒濕三氣雜至,合而為痹也。其風(fēng)氣勝者為行痹,寒氣勝者為痛痹,濕氣勝者為著痹也?！盠DH通常兼見(jiàn)“行”“痛”“著”的特點(diǎn):LDH患者常常伴有下肢放射性疼痛麻木,此為“行”;在寒冷季節(jié)容易發(fā)作且疼痛劇烈,此為“痛”;發(fā)病部位較為固定,影像學(xué)研究發(fā)現(xiàn),腰椎間盤(pán)突出的好發(fā)部位為L(zhǎng)4/L5、L5/S1,占90%以上,此為“著”。《素問(wèn)·痿論》曰:“宗筋者,主束骨而利機(jī)關(guān)也?！敝嗅t(yī)認(rèn)為,LDH是由于“筋出槽,骨錯(cuò)縫”,經(jīng)絡(luò)相當(dāng)于現(xiàn)代解剖學(xué)的肌腱、韌帶和筋膜等組織。LDG常常伴隨棘上韌帶、棘間韌帶和前后縱韌帶等軟組織的損傷,從而進(jìn)一步引起椎體與椎體之間的穩(wěn)定性下降,加重椎間盤(pán)的退變[25]。肝主血,在體合筋,肝血不足,血不養(yǎng)筋,筋脈失養(yǎng),筋骨不堅(jiān),故見(jiàn)腰痛、膝軟、脛酸、足跟痛,甚至腰脊不舉、足不任身等癥。LDH的常見(jiàn)證型可分為血瘀證、寒濕證、濕熱證和肝腎虧虛證,而LDH常常是由于勞累和外傷導(dǎo)致氣滯血瘀,經(jīng)脈閉阻,不通則痛而發(fā)病,故臨床以血瘀證最為多見(jiàn)?！堆撟C》云:“水病則累血,血瘀則累氣。”瘀血內(nèi)阻,氣失宣降可導(dǎo)致水液停聚,瘀血與水濕相互為患,LDH導(dǎo)致神經(jīng)根受到機(jī)械壓迫壓,神經(jīng)根的血供障礙和水腫被認(rèn)為是LDH疼痛重要機(jī)制[12]。脊痛消膠囊由白芍、車(chē)前子、川芎、澤蘭、當(dāng)歸、杜仲、莪術(shù)、防己、黃芪、三棱、延胡索、澤瀉、五靈脂和地龍等14味藥組成,其中車(chē)前子、澤蘭和澤瀉清熱利尿消腫,川芎和延胡索緩急止痛,三棱和地龍活血化瘀,白芍和當(dāng)歸養(yǎng)血舒筋,黃芪補(bǔ)氣升陽(yáng)以助行水,全方相輔相成,相得益彰,共奏益氣、活血、行水之功效[4]。

綜上所述,脊痛消膠囊通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)和JNK/MAPK信號(hào)通路的激活從而發(fā)揮治療LDH的效應(yīng),網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果佐證了這一結(jié)論,為脊痛消膠囊的臨床運(yùn)用提供了一定的參考依據(jù),也為脊痛消膠囊現(xiàn)代藥理學(xué)的深入研究夯實(shí)了基礎(chǔ)。