張成浠,李小茜,高丹,汪順,朱華賀,譚波,楊愛東

1.上海中醫(yī)藥大學(xué),上海 201203; 2.上海市重大傳染病和生物安全研究院中醫(yī)藥疫病研究中心,上海 200032;3.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院,上海 200040; 4.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院,上海 201203

葶藶大棗瀉肺湯首載于《金匱要略》,該方由葶藶子、大棗兩味中藥組成,具有瀉肺行水、下氣平喘之功[1]。臨床研究表明,葶藶大棗瀉肺湯能夠通過減輕炎癥反應(yīng)、提高氧合指數(shù),顯著提升嚴(yán)重肺挫傷所致急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)的搶救成功率[2]。此外,該方可有效緩解肺膿腫患者的臨床癥狀,改善肺功能,并降低炎癥反應(yīng)程度[3]。

在急性肺損傷(acute lung injury,ALI)/ARDS中,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)等外源性刺激可通過激活磷酸酶與張力蛋白同源物(phosphatase and tension homology,PTEN)/磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-hydroxykinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)等信號通路,引發(fā)肺部炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和肺泡上皮細(xì)胞損傷等病理改變[4]。研究表明,葶藶大棗瀉肺湯治療兒童肺炎的作用機(jī)制可能與調(diào)控PI3K/AKT、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)等信號通路有關(guān)[5]。此外,該方治療新型冠狀病毒感染的機(jī)制可能與抑制促炎因子表達(dá)與細(xì)胞因子風(fēng)暴、減輕肺部炎癥損傷有關(guān)[6]。葶藶大棗瀉肺湯治療ALI是否與調(diào)控PI3K/AKT信號通路有關(guān),有待進(jìn)一步研究[7]。因此,本實驗通過建立小鼠ALI模型,觀察葶藶大棗瀉肺湯對模型小鼠肺組織病理學(xué)、炎癥因子及PTEN/PI3K/AKT信號通路的影響。

1 材料

1.1 動物C57BL/6J雄性小鼠30只,6～8周齡,體質(zhì)量18～20 g,購自西普爾-必凱實驗動物有限公司。所有小鼠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心SPF級屏障系統(tǒng),許可證號:SYXK(滬) 2020-0009,溫度25～27 ℃,濕度40%～60%,自由進(jìn)食和飲水。動物實驗由上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物福利與倫理委員會審核批準(zhǔn),倫理編號為PZSHUTCM220613025。

1.2 藥物與試劑葶藶大棗瀉肺湯顆粒(一方制藥有限公司,批號:A12388);地塞米松磷酸鈉注射液(辰欣藥業(yè)股份有限公司,批號:H37021969);LPS(默克公司,貨號:L2880);白細(xì)胞介素-1β(interleukin 1β,IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin 6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)試劑盒(威奧生物科技有限公司,貨號:EM30300M、EM30325M、EM30536M);EZB組織RNA提取試劑盒(英澤生物醫(yī)藥科技有限公司,貨號:RN001-plus);RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB Green定量試劑盒(日本TAKARA,貨號:RR036A、RR420A);BCA蛋白定量試劑盒(雅酶生物科技有限公司,貨號:ZJ102);PI3K抗體、p-AKT抗體、AKT抗體、PTEN抗體、β-actin抗體(Cell Signaling Technology公司,貨號:4249、4060、4691、9188、4970);羊抗兔IgG二抗、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物、RIPA裂解緩沖液、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天生物科技有限公司,貨號:A0208、P1045、P0013B、P0018FM)。

1.3 儀器3K15型低溫冷凍離心機(jī)(Sigma);BH2型顯微鏡(Olympus);680型多功能酶標(biāo)儀(Bio-Rad);實時熒光定量PCR儀(Roche,型號:LightCycler96);SDS-PAGE電泳儀、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-Rad,型號:MINI Protean2、ChemiDoc MP)。

2 方法

2.1 藥物制備葶藶大棗瀉肺湯:取葶藶大棗瀉肺湯顆粒劑,用適量生理鹽水溶解,配成質(zhì)量濃度為0.585 g·L-1、1.17 g·L-1的藥液。地塞米松藥液:取地塞米松磷酸鈉注射液,用生理鹽水稀釋成質(zhì)量濃度為1 g·L-1的藥液[8]。LPS溶液:取適量LPS粉末,加入無菌PBS溶液,配成質(zhì)量濃度為 2 g·L-1的溶液。

2.2 分組、造模及給藥適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,將30只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、葶藶大棗瀉肺湯低劑量組、葶藶大棗瀉肺湯高劑量組、地塞米松組(5 mg·kg-1),每組6只?；谌撕蛣游矬w表面積,按照成人(70 kg)每日葶藶大棗瀉肺湯生藥量45 g換算得出小鼠的等效劑量為5.85 g·kg-1,因此確定低劑量組、高劑量組的灌胃劑量分別為5.85 g·kg-1、11.70 g·kg-1。各藥物組按照相應(yīng)劑量灌胃給藥,正常組和模型組灌胃等體積生理鹽水,每日1次,連續(xù)7 d。末次灌胃2 h后,除正常組外,其余各組小鼠腹腔注射LPS溶液(20 mg·kg-1)建立急性肺損傷模型,造模8 h后取材。

2.3 樣本制備異氟烷麻醉小鼠,體積分?jǐn)?shù)75%酒精消毒,充分暴露氣管并作一字型切口,將導(dǎo)管插入氣管后使用尼龍繩固定,注入生理鹽水進(jìn)行灌洗,留取支氣管肺泡灌洗液,置于-80 ℃冰箱保存[9]。取小鼠肺組織,使用4%多聚甲醛溶液固定用于制備切片,新鮮組織置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 HE染色觀察肺組織病理學(xué)改變?nèi)?%多聚甲醛固定的肺組織,固定24 h后取出換液,梯度酒精脫水,二甲苯透明,組織浸蠟包埋,制備石蠟切片(4 μm);切片采用HE染色,顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)形態(tài)并拍照[10]。

2.5 ELISA檢測肺泡灌洗液 IL-1β、IL-6、TNF-α含量取小鼠支氣管肺泡灌洗液,3 000 r·min-1離心5 min,取上清液。按照ELISA試劑盒說明書的步驟,使用多功能酶標(biāo)儀檢測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品在450 nm波長下的光密度(optical density,OD)值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)而計算樣品中IL-1β、IL-6、TNF-α 含量。

2.6 RT-qPCR檢測肺組織IL-6、TNF-α、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3(suppressors of cytokine signaling 3,SOCS3)基因表達(dá)水平根據(jù)EZB試劑盒說明書提取小鼠肺組織總RNA;按照RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(設(shè)定參數(shù)為:42 ℃ 2 min,37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s);使用TB Green定量試劑盒進(jìn)行RT-PCR實驗(設(shè)定參數(shù)為:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s);最后,采用實時熒光定量PCR儀上機(jī)檢測。采用2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達(dá)水平,以GAPDH作為內(nèi)參基因[11]。引物由上海生工生物工程有限公司合成,引物序列見表1。

表1 引物序列

2.7 Western Blot檢測肺組織PI3K、p-AKT/AKT、AKT、PTEN蛋白表達(dá)水平每組隨機(jī)取3只小鼠肺組織,加入適量裂解液勻漿,提取總蛋白;采用BCA法進(jìn)行蛋白定量[12],95 ℃加熱使蛋白變性;配置10%分離膠、5%濃縮膠,上樣,電泳(80 V,120 min),轉(zhuǎn)膜(250 mA,80 min),封閉10 min。加入一抗(PI3K、AKT、PTEN濃度均為11 000,p-AKT濃度為12 000),4 ℃孵育過夜;TBST洗膜3次,每次10 min;二抗(11 000)室溫孵育1 h;TBST洗膜3次,每次10 min;配置ECL化學(xué)發(fā)光液,凝膠成像系統(tǒng)曝光并顯影。采用Image J 軟件分析蛋白條帶的灰度值,以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠肺組織病理學(xué)變化比較正常組小鼠肺組織未見明顯病理性改變;模型組小鼠可見間質(zhì)性肺炎和出血;與模型組比較,葶藶大棗瀉肺湯低劑量組、高劑量組小鼠的間質(zhì)性肺炎、出血情況減輕;地塞米松組小鼠肺組織未見明顯病理性改變,見圖1。

注:A:正常組;B:模型組;C:葶藶大棗瀉肺湯低劑量組;D:葶藶大棗瀉肺湯高劑量組;E:地塞米松組。

3.2 各組小鼠肺泡灌洗液炎癥因子含量比較與正常組比較,模型組小鼠肺泡灌洗液IL-1β、IL-6、TNF-α含量均升高(P<0.01);與模型組比較,地塞米松組小鼠肺泡灌洗液IL-1β、IL-6、TNF-α 含量均降低(P<0.01),葶藶大棗瀉肺湯低劑量組、高劑量組小鼠肺泡灌洗液IL-1β、IL-6、TNF-α含量均降低(P<0.01),見表2。

表2 各組小鼠支氣管肺泡灌洗液炎癥因子含量比較

3.3 各組小鼠肺組織IL-6、TNF-α、STAT3、SOCS3基因表達(dá)水平比較與正常組比較,模型組小鼠肺組織IL-6mRNA、TNF-αmRNA、STAT3mRNA、SOCS3mRNA水平均升高(P<0.01);與模型組比較,地塞米松組小鼠肺組織IL-6mRNA、TNF-αmRNA、STAT3mRNA、SOCS3mRNA水平均降低(P<0.01),葶藶大棗瀉肺湯低劑量組、高劑量組小鼠肺組織IL-6mRNA、TNF-αmRNA、STAT3mRNA、SOCS3mRNA水平均降低(P<0.05),見表3。

表3 各組小鼠肺組織IL-6、TNF-α、STAT3、SOCS3基因表達(dá)水平比較

3.4 各組小鼠肺組織PI3K、AKT、p-AKT/AKT、PTEN蛋白表達(dá)水平比較與正常組比較,模型組小鼠肺組織PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達(dá)水平升高(P<0.01);與模型組比較,地塞米松組小鼠肺組織PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達(dá)水平降低(P<0.01),葶藶大棗瀉肺湯低劑量組、高劑量組小鼠肺組織PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達(dá)水平降低(P<0.01)。與正常組比較,模型組小鼠肺組織PTEN蛋白表達(dá)水平降低(P<0.01);與模型組比較,地塞米松組小鼠肺組織PTEN蛋白表達(dá)水平升高(P<0.01),葶藶大棗瀉肺湯低劑量組、高劑量組小鼠肺組織PTEN蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05),見表4、圖2。

注:A:正常組;B:模型組;C:葶藶大棗瀉肺湯低劑量組;D:葶藶大棗瀉肺湯高劑量組;E:地塞米松組。

表4 各組小鼠肺組織PI3K、AKT、p-AKT/AKT、PTEN蛋白表達(dá)水平比較

4 討論

ALI在中醫(yī)學(xué)歸屬于“喘證”“暴喘”“喘脫”等疾病范疇[13]。當(dāng)外在邪氣侵襲人體時,五臟之中肺臟最易受邪?！端貑枴ち?jié)藏象論》云:“肺者,氣之本”,《素問·陰陽應(yīng)象大論》曰:“天氣通于肺”[14],《醫(yī)門法律》曰:“肺主一身之氣”。在 ALI 發(fā)展過程中,肺主治節(jié)與通調(diào)水道的功能發(fā)生障礙,氣血津液無法正常輸布,導(dǎo)致痰濁邪氣壅滯體內(nèi),邪實氣逆,進(jìn)而導(dǎo)致肺氣壅滯。臨床主要表現(xiàn)為進(jìn)行性呼吸困難,嚴(yán)重者出現(xiàn)鼻翼煽動,喘息不得臥。因此,痰濁壅滯、肺氣壅塞是 ALI 的關(guān)鍵病機(jī)[15],治宜瀉肺祛痰、下氣平喘,方選葶藶大棗瀉肺湯[16]。

PI3K/AKT信號通路位于哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路上游,其中關(guān)鍵蛋白PI3K、AKT在ALI的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。AKT可通過mTOR途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和細(xì)胞凋亡[17],還可通過其下游核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥反應(yīng)[18]。抑癌基因PTEN可通過去磷酸化磷脂酰肌醇-3-磷酸(phosphatidylinositol-3-phosphate,PI3P)抑制AKT活性[19]。既往研究表明,PI3K/AKT信號通路可能與LPS所致大鼠肺組織損傷改善有關(guān)[20]。

Janus激酶2(Janus kinase 2,JAK2)/STAT3、PI3K/AKT信號通路與急性肺損傷密切相關(guān)[21]。JAK/STAT信號通路是IL-6激活的關(guān)鍵信號途徑之一,其中JAK/STAT3信號通路在細(xì)胞因子刺激下激活,并參與細(xì)胞增殖和炎癥基因的調(diào)控[22]。研究表明,在小鼠ALI模型中,STAT3磷酸化顯著增加,引發(fā)下游蛋白酪氨酸磷酸酶2(Src homology region 2-containing protein tyrosine phosphatase 2,SHP2)磷酸化,以及SOCS3表達(dá)上調(diào),激活促炎因子從而誘發(fā)ALI[23-24]。通過抑制JAK2/STAT3信號通路傳導(dǎo),以及白細(xì)胞介素家族因子釋放,可對肺部起到一定的保護(hù)作用[25]。

臨床研究發(fā)現(xiàn),葶藶大棗瀉肺湯聯(lián)合五虎湯可通過降低血清炎性因子水平,減輕炎癥反應(yīng),有效緩解支氣管肺炎患者的臨床癥狀[26]。此外,加味葶藶大棗瀉肺湯可有效改善支氣管哮喘患者的肺功能及其預(yù)后[27]。研究發(fā)現(xiàn),葶藶子的重要活性成分槲皮素可通過調(diào)節(jié)Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)/NF-κB信號通路,抑制心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng),直接調(diào)節(jié)心臟一氧化氮代謝,從而減輕心肌損傷[28-29]。此外,葶藶大棗瀉肺湯可抑制PI3K/AKT和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路激活,在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、抗細(xì)胞凋亡、改善能量代謝等方面發(fā)揮心臟保護(hù)作用,從而改善心功能[30]。

綜上所述,葶藶大棗瀉肺湯可減輕急性肺損傷小鼠肺組織病變,其機(jī)制可能與調(diào)控PTEN/PI3K/AKT信號通路,抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。