◎ 靳 穎

（黃河交通學(xué)院，河南 焦作 454950）

大豆異黃酮（CatheRine Genistein）是黃酮類化合物的一種，它作為一種次生代謝產(chǎn)物，形成于大豆植物體生長(zhǎng)過(guò)程。大豆異黃酮結(jié)構(gòu)與雌激素相似，因此又稱植物雌激素[1]。大豆異黃酮不僅具有明顯的抗氧化作用，而且還可以起到預(yù)防骨質(zhì)疏松、多種癌癥、心血管疾病等功效[2]。大豆異黃酮母核為3-苯并吡喃酮，以游離型的苷元和結(jié)合型的糖苷形式存在[3]。糖苷占大豆異黃酮總量的97%～98%，苷元僅占大豆異黃酮總量的2%～3%。糖苷主要有大豆苷（daidzin）、料木苷（genistin），苷元主要有染料木素（genistein）、大豆苷元（daidzein）[4]。目前，紫外吸收法、氣相色譜法、高效液相色譜法等[5-7]是大豆異黃酮的主要檢測(cè)方法。其中，紫外吸收法靈敏度不高，只能測(cè)定大豆異黃酮總量。氣相色譜法前處理復(fù)雜，需要對(duì)異黃酮進(jìn)行衍生。高效液相色譜法具有樣品分離度好、定量準(zhǔn)確、操作容易、處理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[6]。因此，本文建立一種超高效液相色譜法，用于測(cè)定大豆中大豆異黃酮含量，以提供一種快速簡(jiǎn)便、靈敏度高的大豆異黃酮含量檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆（市購(gòu)），粉碎備用。

大豆苷（daidzin）、大豆苷元（daidzein）、染料木素（genistein）、染料木苷（genistin）（純度≥98%），成都曼思特生物科技有限公司；甲醇、乙腈，Merck公司，為色譜純；乙酸，Merck 公司，為分析純；超純水，一級(jí)水。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY Ultra Performance LC 超高效液相色譜儀，Waters 公司；2998 Photodiode Array Detector 光電二極管陣列檢測(cè)器，Waters 公司；渦旋混合器，IKA公司；超聲波儀，寧波東和超聲波科技有限公司；恒溫干燥箱，上海宏泰儀器設(shè)備廠；高速離心機(jī)，HITACHI 公司；分析天平，OHAUS 公司；PURELAB Chorus 超純水機(jī)，ELGA 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：用分析天平準(zhǔn)確稱取大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷0.01 g，置于100 mL 容量瓶中，加入70%甲醇溶解，并定容至刻度，制成0.1 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：臨用時(shí)，根據(jù)實(shí)際需要，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用進(jìn)行適當(dāng)?shù)臐舛认♂?，得到?biāo)準(zhǔn)工作液，保存于冰箱中備用。

1.3.2 樣品處理

用分析天平準(zhǔn)確稱取試樣10 g，精確到0.01 g，將試樣置于100 mL 離心管中。加入70%甲醇定容，渦旋混合60 s，超聲波儀中振蕩20 min，然后放入離心機(jī)內(nèi)，在離心機(jī)中以9 000 r·min-1離心5 min，取離心上清液，移至100 mL 容量瓶中。用0.45 μm 濾膜過(guò)濾，加入70%甲醇補(bǔ)至相應(yīng)刻度。吸取10 mL 樣品，將其置于100 mL 離心管中，恒溫干燥箱濃縮至干，用乙腈-0.2%乙酸溶液將濃縮樣品定容至5 mL，再用0.45 μm 濾膜過(guò)濾，移至進(jìn)樣瓶中。

1.3.3 色譜條件

色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEHC C18柱[8]（150 mm×2.1 mm，1.7 μm），進(jìn)樣量為5 μL；流速為0.15 mL·min-1；經(jīng)全波長(zhǎng)掃描大豆異黃酮成分，并比較了不同波長(zhǎng)的峰，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在260 nm 波長(zhǎng)處?kù)`敏度高，因此檢測(cè)波長(zhǎng)選擇260 nm；大豆異黃酮的保留值和分離度都受柱溫的影響，為了避免柱溫較高，縮短保留時(shí)間，選擇30 ℃柱溫；由于大豆異黃酮極性較弱，為實(shí)現(xiàn)完全分離，通過(guò)研究乙腈和不同濃度的乙酸對(duì)大豆異黃酮成分保留值和分離度的影響，流動(dòng)相選用乙腈-0.2%乙酸，梯度洗脫條件如表1所示。

表1 分離梯度程序表

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系及檢出限

吸取一定量的大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)工作液，用甲醇水溶液將其稀釋成1.0 μg·mL-1、3.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、7.0 μg·mL-1、9.0 μg·mL-1以及0 μg·mL-1的溶液，經(jīng)處理后進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)大豆異黃酮成分重復(fù)測(cè)定3 次。設(shè)定濃度為橫坐標(biāo)X，大豆異黃酮成分3 次測(cè)定峰面積平均值為縱坐標(biāo)Y，對(duì)其進(jìn)行線性回歸，得到大豆異黃酮成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如表2 所示。線性檢測(cè)范圍均為1.0 ～9.0 μg·mL-1。

表2 大豆異黃酮成分標(biāo)準(zhǔn)曲線表

2.2 精密度試驗(yàn)

分別精密吸取同一標(biāo)準(zhǔn)工作液，連續(xù)平行進(jìn)樣5 次，測(cè)定4 種大豆異黃酮成分的峰面積，如表3 所示。大豆苷的RSD 為0.28%，大豆苷元的RSD 為0.22%，染料木素的RSD 為0.32%，染料木苷的RSD 為0.26%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

表3 大豆異黃酮成分精密度表

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

在樣品溶液中，加入標(biāo)準(zhǔn)工作液，每隔4 h 進(jìn)一次樣，進(jìn)樣6 次，測(cè)定4 種大豆異黃酮成分的峰面積，如表4 所示。大豆苷的RSD 為0.33%，大豆苷元的RSD 為0.25%，染料木素的RSD 為0.88%，染料木苷的RSD 為0.46%，結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)工作液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

表4 大豆異黃酮成分穩(wěn)定性表

2.4 回收率試驗(yàn)

回收試驗(yàn)時(shí)，在樣品溶液中，準(zhǔn)確加入大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷的標(biāo)準(zhǔn)工作液，重復(fù)進(jìn)樣5次，得到4種大豆異黃酮成分的回收率，如表5所示。結(jié)果表明，大豆苷回收率為97.6%，RSD 為1.8%；大豆苷元回收率為98.2%，RSD 為1.7%；染料木素回收率為98.6%，RSD為2.1%；染料木苷回收率為97.6%，RSD 為1.4%。

表5 大豆異黃酮成分回收率表

2.5 樣品測(cè)定

精確吸取樣品溶液5 μL，對(duì)大豆異黃酮含量進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算得出大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷含量，具體如表6 所示。

表6 4 種大豆異黃酮含量表

3 結(jié)論

大豆異黃酮在我國(guó)藥品、保健品、食品等行業(yè)應(yīng)用廣泛，為滿足日常大豆異黃酮檢測(cè)的需求。通過(guò)試驗(yàn)建立了一種超高效液相色譜法檢測(cè)方法，用于測(cè)定大豆中大豆異黃酮的含量，該超高效液相色譜法采用BEHC C18色譜柱，能夠在較大的樣品流量下，保證色譜柱的柱效，實(shí)現(xiàn)快速分離，并保證峰形尖銳、對(duì)稱。線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性、回收率的試驗(yàn)結(jié)果表明，將該超高效液相色譜法用于檢測(cè)大豆異黃酮的含量，可以提高檢測(cè)的靈敏度和穩(wěn)定性。從樣品檢測(cè)結(jié)果得知，大豆中大豆異黃酮成分中，大豆苷含量最高，為352 μg ·g-1，大豆苷元含量最低，為19.5 μg·g-1。