◎ 楊?yuàn)檴?，趙海峰，英 瑜，王曉雯，金 偉

（青島市食品藥品檢驗(yàn)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局海洋中藥質(zhì)量研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071）

對(duì)羥基苯甲酸酯又稱(chēng)羥苯甲酯或尼泊金酯，因其存在酚羥基結(jié)構(gòu)，可破壞細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)變性，抑制微生物的酶系統(tǒng)活性，造成微生物的新陳代謝異常，從而阻止其正常生長(zhǎng)和繁殖，具有抑菌作用[1]；又因其晶體無(wú)色或白色、無(wú)味，不會(huì)影響產(chǎn)品的色澤和風(fēng)味，在人體內(nèi)代謝迅速、不會(huì)產(chǎn)生累積，所以被國(guó)際公認(rèn)為安全、高效、廣譜的防腐劑，在食品工業(yè)、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域得到了廣泛使用。隨著研究的深入，1978 年，ISHIDATE 等[2]研究表明對(duì)羥基苯甲酸酯可以引發(fā)染色體畸變；1998 年，ROUTLEDGE 等[3]發(fā)現(xiàn)對(duì)羥基苯甲酸酯存在雌激素活性；2002 年，日本東京都衛(wèi)生研究所報(bào)道，即使微量攝入對(duì)羥基苯甲酸丁酯，也會(huì)造成實(shí)驗(yàn)大鼠精子數(shù)量和濃度的顯著下降，對(duì)雄性小鼠生殖系統(tǒng)造成不良影響[4]；2008 年，DARBRE 等[5]的研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)羥基苯甲酸酯具有雌激素和抗雄激素活性，不僅會(huì)影響男性生殖功能，還有可能增加乳腺癌的發(fā)病率；2012 年，SUGANDHA 等[6]證實(shí)對(duì)羥基苯甲酸酯確實(shí)會(huì)增加女性患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)羥基苯甲酸酯的激素活性被越來(lái)越多的人所重視，在食品工業(yè)中的應(yīng)用也受到了一定的限制。

目前，我國(guó)要求醬油、醋中對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)及其鈉鹽（以對(duì)羥基苯甲酸計(jì)）最大使用量均為0.25 g·kg-1[7]，食品中對(duì)羥基苯甲酸酯的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法[8-11]、氣相色譜-質(zhì)譜法[12-15]、液相色譜法[16-19]、液相色譜-質(zhì)譜法[20-22]、毛細(xì)管電泳法等[23]。GB 5009.31—2016 是目前食品中檢測(cè)對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)的主要方法[24]，但是操作煩瑣，消耗時(shí)間長(zhǎng)、試劑用量大，不利于大批量樣品的檢測(cè)工作。本文研究建立了測(cè)定醬油、醋中對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)樣品前處理方法，該方法前處理工作操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中既能提高工作效率，又可減少試劑用量，適宜大批量樣品的檢測(cè)工作。同時(shí)，本文的研究?jī)?nèi)容也對(duì)其他品類(lèi)樣品的前處理方法具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4種對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 mg·L-1）：購(gòu)自國(guó)家標(biāo)物中心；乙酸乙酯：HPLC 級(jí)，德國(guó)Merk公司；NaCl、NaHCO3：均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水均為Millipore 現(xiàn)制水。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B 氣相色譜儀：美國(guó)Agilent；Multi Reax 渦旋振蕩器：德國(guó)Heidolph；3-18KS 高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)Sigma；電子天平：美國(guó)Ohaus。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

飽和NaCl 的飽和NaHCO3溶液：在飽和NaHCO3溶液中加入NaCl 至過(guò)飽和。

飽和NaHCO3的飽和NaCl 溶液：在飽和NaCl 溶液中加入NaHCO3至過(guò)飽和。

1.3.2 樣品前處理

稱(chēng)取5 g（精確至0.001 g）均勻樣品于50 mL 離心管中，加入10 mL 乙酸乙酯，振搖3 min 后，5 000 r·min-1離心5 min，取上清液于新的50 mL 離心管中，加入10 mL 飽和NaCl 的飽和NaHCO3溶液，振搖3 min 后，5 000 r·min-1離心5 min，取5 mL 上清液，氮吹至近干，加1 mL 乙醇復(fù)溶，過(guò)0.22 μm 有機(jī)濾膜，待測(cè)。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：HP-5（美國(guó)Agilent，30 m×0.32 mm，0.25 μm）；載氣：氮?dú)猓缓懔髂Ｊ剑? mL·min-1。

進(jìn)樣口溫度：250 ℃；進(jìn)樣模式：不分流；進(jìn)樣體積：1 μL。

程序升溫：100 ℃保持1 min；20 ℃·min-1升溫至170 ℃；12 ℃·min-1升溫至220 ℃，保持1 min；10 ℃·min-1升溫至250 ℃，保持8 min。

FID 檢 測(cè) 器 溫 度：280 ℃； 空 氣 流 速：450 mL·min-1；氫氣流速：40 mL·min-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽酸酸化步驟的去除

在樣品前處理過(guò)程中加入1 ∶1 鹽酸1 mL 對(duì)樣品進(jìn)行酸化，可以將對(duì)羥基苯甲酸的鈉鹽酸化為對(duì)羥基苯甲酸，但是對(duì)羥基苯甲酸的沸點(diǎn)為336.2 ℃，不易被汽化，需經(jīng)甲酯化后方能使用氣相色譜法進(jìn)行測(cè)定[10]。若不進(jìn)行甲酯化，由于對(duì)羥基苯甲酸的酸度比碳酸強(qiáng)，使用飽和碳酸氫鈉洗滌樣液時(shí)，樣液中的對(duì)羥基苯甲酸會(huì)與碳酸氫鈉反應(yīng)再次生成對(duì)羥基苯甲酸鈉鹽，因此原方法中加入1 ∶1 鹽酸1 mL 對(duì)樣品進(jìn)行酸化，對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響。本文使用含有對(duì)羥基苯甲酸甲酯和對(duì)羥基苯甲酸乙酯的醬油樣品就是否需要酸化樣品進(jìn)行了6 個(gè)平行樣的對(duì)比，結(jié)果如表1 所示。在樣品前處理過(guò)程中加入1 ∶1 鹽酸對(duì)樣品酸化和不進(jìn)行酸化，測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著差異。另外，考慮到節(jié)儉、環(huán)保的要求，本文方法不再進(jìn)行樣品酸化。

表1 樣品酸化比對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

2.2 萃取試劑的選擇

在實(shí)驗(yàn)用水和18%的NaCl 溶液（模擬醬油的含鹽量）中加入終濃度均為10 mg·L-1的4 種對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)，選擇常用試劑甲醇、乙醇、乙醚、乙酸乙酯和乙腈，分別進(jìn)行萃取。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，甲醇和乙醇均能分別與實(shí)驗(yàn)用水和NaCl 溶液互溶，無(wú)分層現(xiàn)象發(fā)生，不適宜作為對(duì)羥基苯甲酸酯的萃取試劑；乙腈可以與實(shí)驗(yàn)用水互溶，但與NaCl 溶液混勻后仍分層現(xiàn)象明顯，因此在提取過(guò)程中可以通過(guò)鹽析作用得到乙腈層，乙腈可以用作對(duì)羥基苯甲酸酯的萃取試劑；乙醚和乙酸乙酯與實(shí)驗(yàn)用水和NaCl 溶液混勻后均分層現(xiàn)象明顯，可以用作對(duì)羥基苯甲酸酯的萃取試劑。

按1.3.2 的操作經(jīng)離心、氮吹、復(fù)溶、過(guò)膜后測(cè)定，結(jié)果如圖1 所示，用乙醚和乙酸乙酯提取實(shí)驗(yàn)用水中的對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)，上機(jī)檢測(cè)，采用乙酸乙酯萃取時(shí)，4 種對(duì)羥基苯甲酸酯的加標(biāo)回收率基本在105%左右，明顯優(yōu)于乙醚；用乙醚、乙酸乙酯和乙腈提取18% NaCl 溶液中的對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)，使用乙酸乙酯萃取時(shí)，4 種對(duì)羥基苯甲酸酯的加標(biāo)回收率基本在100%～105%，整體上優(yōu)于乙醚和乙腈。因此，最終選擇乙酸乙酯作為萃取試劑。

圖1 不同提取溶劑的對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)回收率圖

乙酸乙酯提取18%NaCl 溶液中對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)的回收率相對(duì)提取實(shí)驗(yàn)用水的回收率偏低，可能是由于乙酸乙酯在實(shí)驗(yàn)用水和18% NaCl 溶液中的溶解度不同，溶于實(shí)驗(yàn)用水中的乙酸乙酯相對(duì)NaCl 溶液更多一些，造成乙酸乙酯層的體積減小，在溶質(zhì)基本不變的情況下，溶劑體積減小，必然導(dǎo)致濃度的增高。

2.3 凈化溶劑的選擇

在5 g 醬油樣品中加入10 mg 4 種對(duì)羥基苯甲酸酯的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，使用乙酸乙酯提取，分別采用20 mL 10 g·L-1的NaHCO3溶液、20 mL 飽和NaCl 溶液、10 mL飽和NaCl 溶液+10 mL 10 g·L-1NaHCO3溶液、10 mL 10 g·L-11的NaHCO3溶液、10 mL 飽和NaCl 溶液、5 mL飽和NaCl 溶液+5 mL 10 g·L-1NaHCO3溶液對(duì)提取液進(jìn)行凈化。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，提取液經(jīng)含有NaHCO3的溶液凈化后，有機(jī)層中的深色雜質(zhì)會(huì)轉(zhuǎn)移至水相中；若凈化液中無(wú)NaHCO3，深顏色的雜質(zhì)仍留存在有機(jī)層中，說(shuō)明NaHCO3對(duì)提取液中的深色雜質(zhì)有良好的去除作用，凈化溶液中應(yīng)含有NaHCO3。凈化后的有機(jī)層，按1.3.2 的操作氮吹、復(fù)溶、過(guò)膜后測(cè)定，結(jié)果如圖2 所示。使用20 mL 10 g·L-1的NaHCO3溶液凈化提取液后，4 種對(duì)羥基苯甲酸酯的加標(biāo)回收率大多高于110%，對(duì)羥基苯甲酸乙酯的加標(biāo)回收率高于120%，過(guò)高的回收率說(shuō)明20 mL 10 g·L-1的NaHCO3溶液不適宜用作本實(shí)驗(yàn)的凈化。同時(shí)，對(duì)比10 mL 10 g·L-1的NaHCO3溶液凈化，凈化溶液濃度相同，加入的體積不同導(dǎo)致加標(biāo)回收率明顯差異，再次驗(yàn)證了乙酸乙酯在水溶液中的溶解量增加，會(huì)導(dǎo)致加標(biāo)回收率的上升。同理，對(duì)比20 mL 飽和NaCl 溶液和10 mL飽和NaCl 溶液凈化后的加標(biāo)回收率，對(duì)比10 mL 飽和NaCl 溶液+10 mL 10 g·L-1NaHCO3溶液和5 mL 飽和NaCl溶液+5 mL 10 g·L-1NaHCO3溶液的加標(biāo)回收率，凈化溶液體積越大，其加標(biāo)回收率相對(duì)偏高，因此凈化過(guò)程中凈化溶液的體積應(yīng)控制在合理范圍內(nèi)。

圖2 不同凈化溶液的對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)回收率圖

前期的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明NaHCO3對(duì)去除提取液中雜質(zhì)具有重要的作用，而且凈化溶液的使用量會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的最終結(jié)果。為了進(jìn)一步驗(yàn)證凈化溶液體積相同，不同的溶質(zhì)組合對(duì)加標(biāo)回收率的影響，實(shí)驗(yàn)室比對(duì)飽和NaCl 的飽和NaHCO3溶液，飽和NaHCO3的飽和NaCl 溶液，飽和NaCl 的10 g·L-1NaHCO3溶液的凈化效果。分別取10 mL 凈化溶液凈化10 mL 提取液，提取液中的深色雜質(zhì)都能轉(zhuǎn)移至水相中。通過(guò)圖3 的加標(biāo)回收率比較，采用飽和NaCl 的飽和NaHCO3溶液凈化后，4 種對(duì)羥基苯甲酸酯的綜合回收率相對(duì)更優(yōu)。

圖3 不同凈化溶液的對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)回收率圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限、準(zhǔn)確度及精密度

用乙醇配制4 種目標(biāo)物混標(biāo)系列濃度4.0 mg·L-1、10.0 mg·L-1、20.0 mg·L-1、50.0 mg·L-1、100 mg·L-1、200 mg·L-1和300 mg·L-1進(jìn)行測(cè)試，分別以4 種對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)的峰面積A為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度ρ（mg·L-1）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，詳見(jiàn)表2。

表2 4 種目標(biāo)物的線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)表

在未檢出對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)的醬油樣品和醋樣品中，分別添加6 平行的0.6 mg·kg-1（GB 5009.31—2016的檢出限）、2.0 mg·kg-1、4.0 mg·kg-1和10.0 mg·kg-1的對(duì)羥基苯甲酸酯，按照1.3.2 進(jìn)行樣品前處理，檢測(cè)結(jié)果詳見(jiàn)表3。4 種目標(biāo)物在不同添加水平的回收率基本在70%～120%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.90%～7.06%，表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度均較好。按照國(guó)標(biāo)方法檢出限水平添加，也能準(zhǔn)確定量，能滿足日常檢測(cè)醬油、醋中對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)的要求。

表3 方法回收率和精密度實(shí)驗(yàn)表（n=6）

2.5 討論

本文樣品前處理方法可以準(zhǔn)確、快速高效、經(jīng)濟(jì)環(huán)保地測(cè)定醬油、醋中的對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)，單個(gè)樣品的前處理時(shí)間約30 min，批量樣品的前處理時(shí)間與單個(gè)樣品的區(qū)別主要在于試劑添加的耗時(shí)，同時(shí)有機(jī)試劑用量少，檢出限也滿足GB 5009.31—2016 的要求。然而存在的問(wèn)題是，GB 2760—2014 中的限量要求是針對(duì)“對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)及其鈉鹽”，而其指定檢測(cè)方法GB 5009.31—2016 為僅能測(cè)定“對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)”，本文樣品前處理方法也未考慮“對(duì)羥基苯甲酸鈉鹽”的測(cè)定，將在之后的研究中加以完善。

3 結(jié)論

對(duì)羥基苯甲酸酯是食品中常見(jiàn)的防腐劑，為保證食品質(zhì)量安全，建立一種快速高效、經(jīng)濟(jì)環(huán)保的檢測(cè)方法十分必要。本文研究了測(cè)定對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)的樣品前處理的操作機(jī)理、優(yōu)選了萃取試劑和凈化方法，并使用實(shí)際樣品驗(yàn)證了方法的檢出限、準(zhǔn)確度、精密度，建立了快速高效、經(jīng)濟(jì)環(huán)保測(cè)定醬油和醋中對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)的樣品前處理方法，適宜大批量樣品的快速測(cè)定。同時(shí)，本文的研究?jī)?nèi)容也對(duì)測(cè)定其他品類(lèi)樣品中對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)的前處理方法具有指導(dǎo)意義。