龍云平 劉晗笑 徐中昊 金連峰

膝骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis of the knee, KOA)是一種常見的慢性關(guān)節(jié)疾病, 以關(guān)節(jié)疼痛和活動受限為主要特征［1］。骨關(guān)節(jié)早期發(fā)生關(guān)節(jié)破壞導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎癥介質(zhì)失衡, 以軟骨變性、細胞外基質(zhì)變性、全身炎癥、軟骨細胞凋亡、骨贅形成和骨重塑為特征［2］。西醫(yī)治療KOA 早期常用非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素等［3］, 但長期服用會增加心臟、肝臟和腎臟疾病的風(fēng)險［4］, 晚期主要通過關(guān)節(jié)置換手術(shù)治療, 但手術(shù)費用較高且術(shù)后具有一定的感染風(fēng)險［5］。KOA 屬中醫(yī)學(xué)“骨痹”、“痹證”范疇, 即膝痹病, 以標本同治為治療原則, 基本治法為補益肝腎、活血化瘀, 兼祛風(fēng)寒、清熱利濕［6］。新止骨增生丸是由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院經(jīng)過長時間的臨床試驗總結(jié)成方［7］, 主要功效為補肝腎強筋壯骨、活血通絡(luò)止痛, 藥物成分包括熟地黃、雞血藤、骨碎補(制)、肉蓯蓉、劉寄奴、海桐皮等。方中熟地黃、骨碎補、肉蓯蓉共為君藥, 全方藥物相輔相成、標本兼治, 共奏補肝腎、強筋骨、通絡(luò)止痛的功效, 用于治療KOA 療效確切［8］。藥效學(xué)研究表明新止骨增生丸具有良好的鎮(zhèn)痛、抗炎消腫、祛瘀的作用,且能有效降低關(guān)節(jié)滑液中的IL-1β、IL-6、白細胞介素-17(IL-17)等炎性因子水平, 抑制KOA 的進展［9］。本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法進一步探討新止骨增生丸治療KOA 的作用機制, 以期為其進一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 新止骨增生丸的活性成分及其作用靶點篩選 借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(TCMSP, http://tcmspw.com/tcmsp.php/)和BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)檢索新止骨增生丸中各味中藥的化學(xué)成分, 并以口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18 為篩選條件, 獲取新止骨增生丸的活性成分。進一步通過TCMSP 平臺篩選活性成分的作用靶點, 并通過UniProt 數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)對蛋白靶點進行規(guī)范。

1.2 KOA 疾病相關(guān)靶點的預(yù)測 以“kneeosteoarthritis”為檢索詞, 通過GeneCards(https://www.genecards.org)、OMIM(https://omim.org) 和DisGeNet(https//www.disgenet.org/)數(shù)據(jù)庫獲取KOA 的疾病相關(guān)靶點, 并通過Uniport數(shù)據(jù)庫進行規(guī)范。然后將新止骨增生丸的活性成分作用靶點與KOA 疾病相關(guān)靶點通過Venny2.1.0 在線分析工具進行映射, 取交集基因(共同靶點), 即得到新止骨增生丸治療KOA 的關(guān)鍵靶點。

1.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將新止骨增生丸治療KOA 的共同靶點導(dǎo)入String 平臺(https://Stringdb.org), 設(shè)置物種為“Homosapiens(智人)”, 使用MultipleProtein(多種蛋白質(zhì)分析)功能, 蛋白相互作用分數(shù)(Minimumrequir edinteractionscore) 設(shè) 定“Mediumconfidence(＞0.400)”。下載PPI 網(wǎng)絡(luò)的TSV 文件, 將其導(dǎo)入Cytoscape3.7.1 軟件進行可視化分析, 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò), 使用CytoNCA 插件計算度中心性(DC)、特征向量中心性(EC)、介度中心性(BC)和接近中心性(CC), 并選擇DC、EC、BC 和CC 大于中位數(shù)的靶點, 經(jīng)過一次篩選, 得到的靶點被認為是核心靶點, 并建立核心靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)。

1.4 GO 功能及KEGG 通路富集分析 將“1.2”項下獲得的關(guān)鍵靶點(共同靶點)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)進行GO 功能及KEGG 通路富集分析。GO 功能富集分析包括生物過程(biological process, BP)、分子功能(molecular function, MF)和細胞組分(cellular component, CC)。設(shè)置P＜0.05, 并通過微生信在線平臺(http://www.bioinformatics.com.cn)對結(jié)果進行可視化處理。將共同靶點、信號通路信息導(dǎo)入Cytoscape3.7.1 軟件, 構(gòu)建“活性成分-關(guān)鍵靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 活性成分-關(guān)鍵靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將“1.1”項下獲得的新止骨增生丸活性成分、“1.2”項下獲得的關(guān)鍵靶點(共同靶點)及“1.4”項下獲得的前20 條通路導(dǎo)入Cytoscape3.7.1 軟件, 構(gòu)建新止骨增生丸治療KOA 的“活性成分-關(guān)鍵靶點-通路”網(wǎng)絡(luò), 通過插件CytoNAC 計算網(wǎng)絡(luò)中成分節(jié)點進行拓撲分析, 反向篩選新止骨增生丸治療KOA 的有效成分及關(guān)鍵基因。

2 結(jié)果

2.1 新止骨增生丸的活性成分及其作用靶點 篩選新止骨增生丸中符合條件的活性成分, 分別得到熟地黃2 個、雞血藤23 個、骨碎補(制)18 個、肉蓯蓉5 個、劉寄奴3 個、海桐皮7 個, 去除重復(fù)后共得到54 個活性成分。其中有50 個活性成分能夠在數(shù)據(jù)庫中匹配到作用靶點, 將其對應(yīng)的靶蛋白輸入UniProt 數(shù)據(jù)庫, 去除無效和重復(fù)靶點后共得到新止骨增生丸的活性成分作用靶點262 個。

2.2 新止骨增生丸治療KOA 的關(guān)鍵靶點 通過OMIM、GeneCards 和DisGeNet 數(shù) 據(jù) 庫 共 檢 索 得 到KOA 的疾病相關(guān)靶點2459 個, 與262 個新止骨增生丸活性成分作用靶點映射取交集, 共得到新止骨增生丸治療KOA 的關(guān)鍵靶點(共同靶點)142 個。見圖1。

圖1 新止骨增生丸活性成分靶點與KOA 靶點的韋恩圖

2.3 新止骨增生丸治療KOA 的共同靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)將新止骨增生丸治療KOA 的142 個共同靶點導(dǎo)入String 平臺, 設(shè)置最低相互作用閾值置信度(＞0.4)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖, 去掉1 個無連接的節(jié)點, 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò), 該網(wǎng)絡(luò)除去1 個游離靶點后, 共有141 個節(jié)點,3283 條邊。見圖2。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.1 軟件,使用CytoNCA 插件計算網(wǎng)絡(luò)節(jié)點DC、EC、BC 和CC 值。先選出DC、EC、BC 及CC 大于中位數(shù)45、0.07421736、40.130833 及0.58577406 的 靶 點。經(jīng) 過 一 次 篩 選,13 個靶點被確定為核心靶點。按DC 值排序依次為：TNF、AKT1、IL-6、VEGFA、腫 瘤 蛋 白53(TP53)、IL-1β、JUN、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9、胱天蛋白酶3(CASP3)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(STAT3)、絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、環(huán)加氧酶3(PTGS2)、表皮生長因子(EGF)。圖2 和圖3 顯示：蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用, 線條越多, 關(guān)聯(lián)性越強, 作用也就越強。靶點節(jié)點越大, 表明其degree 值越大, 與其相關(guān)的靶點蛋白數(shù)量越多, 在網(wǎng)絡(luò)中的位置越核心。

圖2 新止骨增生丸治療KOA 的全部靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)

圖3 新止骨增生丸治療KOA 的核心靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO 功能及KEGG 通路富集分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫和在線生物信息學(xué)分析工具, 富集分析了新止骨增生丸和KOA 的142 個共同靶標。富集結(jié)果顯示,GO 中BP 中有821 個詞條, CC 中有94 個詞條, MF 中有139 個詞條(P＜0.05)。通過重要性排序, 從CC、CC和MF 中選出了10 個最重要的詞條, 并繪制了條形圖。見圖4。新止骨增生丸治療KOA 所涉及的生物過程主要包括基因表達的正調(diào)節(jié)(positiveregulation of gene expression)、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控(positive regulation of transcrip-tion from RNA polymeraseⅡpromoter)、藥物反應(yīng)(response to drug)等；細胞組分方面包括細胞外間隙(extracellular space)、細胞外組分(extracellular region)、高 分 子 復(fù) 合 物(macromolecular complex)等；分子功能方面包括酶結(jié)合(enzyme binding)、相同蛋白質(zhì)結(jié)合(identical protein binding)、蛋白質(zhì)結(jié)合(protein binding)等。KEGG 通路富集分析得到167 條相關(guān)通路(P＜0.05), 根據(jù)顯著性進行排列, 選取排前20 位的條目繪制成氣泡圖, 見圖5。新止骨增生丸治療KOA 主要涉及癌癥通路(pathways in cancer)、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、乙型肝炎(HepatitisB)、脂質(zhì)與動脈硬化(lipid and atherosclerosis)、TNF 信號通路(TNF signaling pathway)等。

圖4 新止骨增生丸治療KOA 的 GO 功能富集分析

圖5 新止骨增生丸治療KOA 的KEGG 富集分析

2.5 新止骨增生丸“活性成分-關(guān)鍵靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將KEGG 中前20 條通路及其相關(guān)靶點與關(guān)鍵靶點及其相關(guān)活性成分導(dǎo)入Cytoscape3.7.1 軟件,并生成“活性成分-核心靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。見圖6。圖中顯示橢圓形節(jié)點代表通路, 菱形節(jié)點代表靶點, 八邊形節(jié)點代表新止骨增生丸藥物中的活性成分, 節(jié)點大小與degree 值呈正相關(guān)。運用CytoNCA 插件計算網(wǎng)絡(luò)圖節(jié)點成分的DC、EC、BC、CC 的值, 其中包含223 個節(jié)點和1263 條邊。

3 討論

本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的方法篩選得到新止骨增生丸中的活性成分54 個。其中關(guān)鍵活性成分包含槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚等。槲皮素是黃酮類化合物家族的一員, 在退行性疾病中具有抗氧化和抗炎特性。有研究表明槲皮素通過激活SIRT1/AMPK 信號通路來抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和相關(guān)的細胞凋亡［10］。槲皮素可以上調(diào)超氧化物歧化酶(SOD)和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物-1(TIMP-1), 下調(diào)MMP-13, 通過減弱氧化應(yīng)激反應(yīng)和抑制軟骨細胞外基質(zhì)的降解來改善骨關(guān)節(jié)炎(OA)［11］。另外一項研究表明槲皮素處理的KOA 大鼠的關(guān)節(jié)損傷模型中結(jié)節(jié)性硬化癥2(TSC2)和微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3B-Ⅱ(LC3B-Ⅱ)表達升高, 腦Ras 同源蛋白(RHEB)、p-mTOR、p-ULK1 和p62 表達下降, 通過介導(dǎo)TSC2-RHBE-mTOR 信號通路緩解了KOA［12］。有研究表明木犀草素可以影響原代兔關(guān)節(jié)軟骨細胞中MMP-3 的表達、分泌和活性, 起到潛在軟骨保護作用［13］。目前, 未見β-谷甾醇關(guān)于保護或緩解KOA 的直接報道。β-谷甾醇具有一定的抗炎、抗氧化作用［14］, 是否可以用于KOA 的治療有待驗證。

在基因數(shù)據(jù)庫中映射共同靶點, 并通過String 探索蛋白間相互作用關(guān)系, 得到TNF、AKT1、IL-6、VEGFA、TP53、IL-1β、JUN、MMP-9 等核心靶點。有研究通過測量KOA 患者軟骨和滑液中VEGFA 的表達水平, 證實了KOA 進展過程中VEGFA 表達的增加［15］。使用hUSC-Exos 外泌體過表達miR-140-5p通過下調(diào)大鼠模型中的VEGFA 來緩解膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎［15］。另外一項miRNA 和基因表達譜的綜合分析的研究［16］表明, BTG2、ABL2 和VEGFA 可被視為OA的潛在預(yù)測和治療生物標志物, 可能指導(dǎo)OA 的臨床治療。通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射木瓜蛋白酶建立大鼠OA 模型［17］,酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)法檢測到血清中高水平的TNF-α 和IL-1β, 使用槲皮素治療可明顯改善關(guān)節(jié)炎狀態(tài), 降低血清中炎性因子水平。在IL-1β 處理軟骨細胞構(gòu)建軟骨細胞關(guān)節(jié)炎模型中, 槲皮素還能緩解IL-1β 誘導(dǎo)的細胞活力下降和凋亡增加, 并促進軟骨細胞合成IL-1β 抑制的粘多糖［12］。IL-1β 誘導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)活化和軟骨細胞產(chǎn)生MMPs共同促進KOA 進展。有研究［18］表明異甘草素可以抑制IL-1β 誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細胞中MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13 的產(chǎn)生。新止骨增生丸治療的KOA的關(guān)鍵靶點可以用于開發(fā)靶向抑制劑。

KEGG 通路富集分析結(jié)果, 主要涉及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路、TNF 信號通路等。一項結(jié)合多組學(xué)數(shù)據(jù)的Meta 分析研究［19］表明, AGERAGE 信號失調(diào)是年齡相關(guān)KOA 性別依賴驅(qū)動因素。AGE 是晚期糖基化終產(chǎn)物, RAGE 是高級糖化終產(chǎn)物受體, 與各種慢性炎癥有關(guān), 靶向RAGE 可以抑制炎癥和多種疾病的進展和轉(zhuǎn)移［20］。Wnt/β-catenin 信號傳導(dǎo)通路是調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)炎發(fā)育和進展的獨特信號通路,通過直接影響骨骼、軟骨和滑膜組織, 在骨骼和關(guān)節(jié)病理學(xué)中發(fā)揮作用, 該特定通路中的分子可作為關(guān)節(jié)炎治療干預(yù)的靶標［21］, 源于富血小板血漿的外泌體通過Wnt/β-catenin 信號通路促進軟骨細胞的增殖和抑制軟骨細胞凋亡, 在緩解KOA方面展示出新的潛力［22］。此外, 物理性治療手段低強度脈沖超聲通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin 信號傳導(dǎo)抑制成纖維細胞樣滑膜細胞增殖,并減少滑膜纖維化也有報道［23］。

綜上所述, 新止骨增生丸可能通過槲皮素、木犀草素、山柰酚等活性成分作用于TNF、AKT1、IL-6、VEGFA、TP53、IL-1β、JUN、MMP-9 等核心靶點,通過AGE-RAGE、TNF 和Wnt/β-catenin 信號通路等發(fā)揮緩解KOA 的作用。