鮑亞玲 雷慧 馬君 趙新梅

摘要：目的 基于磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路探究黃芪陽(yáng)和湯對(duì)糖尿病足潰瘍（DFU）大鼠創(chuàng)面愈合的影響。方法 構(gòu)建DFU大鼠模型，將建模成功的48只大鼠隨機(jī)分為模型組，黃芪陽(yáng)和湯低（8.5 g/kg）、高（17 g/kg）劑量組，黃芪陽(yáng)和湯高劑量（17 g/kg）＋LY294002（PI3K/AKT通路抑制劑，0.3 mg/kg）組；每組12只；另取12只大鼠為對(duì)照組。各組大鼠給予對(duì)應(yīng)藥物干預(yù)，連續(xù)4周。第14、28天給藥后，觀察大鼠一般狀態(tài)及創(chuàng)面變化，計(jì)算創(chuàng)面愈合率，檢測(cè)大鼠空腹血糖（FBG）水平和大鼠創(chuàng)面周圍組織經(jīng)皮氧分壓（TcpO2）；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)大鼠血清血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）、C反應(yīng)蛋白（CRP）、白細(xì)胞介素（IL）-6水平；蘇木素-伊紅染色觀察大鼠創(chuàng)面組織病理學(xué)變化；免疫組織化學(xué)染色測(cè)定大鼠創(chuàng)面組織微血管密度；蛋白免疫印跡法檢測(cè)大鼠創(chuàng)面組織中PI3K、磷酸化PI3K（p-PI3K）、AKT、磷酸化AKT（p-AKT）、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）、NF-κB抑制蛋白α（IκB-α）蛋白表達(dá)。結(jié)果 對(duì)照組大鼠毛色光滑，飲食、飲水、排泄均正常，較活躍，創(chuàng)面愈合快，創(chuàng)面組織炎癥反應(yīng)較輕，新生血管較多，肉芽組織中成纖維細(xì)胞及膠原基質(zhì)豐富；模型組大鼠毛色暗淡無(wú)光澤，活動(dòng)減少，且出現(xiàn)多飲、多食、多尿癥狀，創(chuàng)面顏色較深，且周圍組織出現(xiàn)水腫、潰瘍，創(chuàng)面組織可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，伴組織壞死、滲出，新生血管及成纖維細(xì)胞較少，創(chuàng)面愈合率、創(chuàng)面周圍組織TcpO2、血清VEGF、HIF-1α、創(chuàng)面組織微血管密度、p-PI3K、p-AKT、IκB-α蛋白表達(dá)水平降低，F(xiàn)BG、血清CRP、IL-6、創(chuàng)面組織p-NF-κB p65蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與模型組相比，黃芪陽(yáng)和湯低、高劑量組大鼠狀態(tài)逐漸改善，創(chuàng)面組織病變程度依次減輕，創(chuàng)面愈合率、創(chuàng)面周圍組織TcpO2、血清VEGF、HIF-1α、創(chuàng)面組織微血管密度、p-PI3K、p-AKT、IκB-α蛋白表達(dá)水平依次升高，F(xiàn)BG、血清CRP、IL-6、創(chuàng)面組織p-NF-κB p65蛋白表達(dá)依次降低（P＜0.05）；LY294002能部分逆轉(zhuǎn)高劑量黃芪陽(yáng)和湯對(duì)DFU大鼠的治療作用（P＜0.05）。結(jié)論 黃芪陽(yáng)和湯能調(diào)控PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路，抑制DFU大鼠炎癥反應(yīng)，促進(jìn)血管新生，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

關(guān)鍵詞：黃芪陽(yáng)和湯；糖尿病足潰瘍；創(chuàng)面愈合；磷脂酰肌醇3-激酶；蛋白激酶B；NF-κB

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.11958/20230561

Huangqi Yanghe Decoction regulates PI3K/AKT/NF-κB signaling pathway to promote

wound healing in diabetes foot ulcer rats

BAO Yaling1， LEI Hui1△， MA Jun2， Zhao Xinmei2

1 Zhangjiakou University， Zhangjiakou 075000， China; 2 Department of Endocrinology， Zhangjiakou First Hospital

△Corresponding Author E-mail： 115386879@qq.com

Abstract： Objective To explore the effect of Huangqi Yanghe Decoction on wound healing of diabetic foot ulcer （DFU） rats based on phosphatidylinositol 3-kinase （PI3K）/protein kinase B （AKT）/nuclear factor-κB （NF-κB） signal pathway. Methods DFU rat model was constructed， and 48 rats successfully modeled were randomly divided into the model group， the Huangqi Yanghe Decoction low （8.5 g/kg） group， the Huangqi Yanghe Decoction high （17 g/kg） dose group and the Huangqi Yanghe Decoction high dose （17 g/kg）+LY294002 （PI3K/AKT pathway inhibitor， 0.3 mg/kg） group. There were 12 rats in each group. Another 12 rats were selected as the control group. Rats in each group were given corresponding drug intervention for 4 weeks. After the 14th and 28th day-administration， the general state and wound changes of rats were observed， and the wound healing rate was calculated. The fasting blood glucose （FBG） level of rats was measured， and the percutaneous partial pressure of oxygen （TcpO2） of tissue around the wound was detected. Serum levels of vascular endothelial growth factor （VEGF）， hypoxia inducible factor-1α （HIF-1α）， C-reactive protein （CRP） and interleukin （IL）-6 were determined by enzyme linked immunosorbent assay. Histopathological changes of the wound were observed by hematoxylin-eosin staining. Immunohistochemical staining was used to measure the microvascular density of rat wound tissue. The protein expression levels of PI3K， phosphorylated PI3K （p-PI3K）， AKT， phosphorylated AKT （p-AKT）， NF-κB p65， phosphorylated NF-κB p65 （p-NF-κB p65） and NF-κB inhibitory protein α （IκB-α） in rat wound tissue were determined by Western blot assay. Results Rats in the control group had smooth hair color， normal diet， drinking water and excretion， more active， wound healing fast， less inflammatory reaction in wound tissue， and there were more new blood vessels. Fibroblasts and collagen matrix were abundant in granulation tissue. In the model group， the fur color of rats was dull and matte， and the activity was reduced. The symptoms of polydipsia， polyphagia and polyuria were appeared in the model group， the wound color was dark， and edema and ulcer appeared in the surrounding tissue， a large number of inflammatory cells infiltrated in the wound tissue， accompanied by tissue necrosis and exudation， fewer neovascularization and fibroblasts were observed. Wound healing rate， TcpO2 in wound surrounding tissue， serum VEGF， HIF-1α， microvascular density， p-PI3K， p-AKT and IκB-α protein expression levels in wound tissue were decreased， and FBG， serum CRP， IL-6， p-NF-κB p65 protein expression in wound tissue were increased （P＜0.05）. Compared with the model group， the state of rats was gradually improved in the Huangqi Yanghe Decoction low and high dose groups， and the lesion degree of wound tissue was reduced successively， wound healing rate， TcpO2 in wound surrounding tissue， serum VEGF， HIF-1α， microvascular density， p-PI3K， p-AKT and IκB-α protein expression levels in wound tissue were increased in turn （P＜0.05）. The FBG， serum CRP， IL-6 and p-NF-κB p65 protein expression in wound tissue were decreased in turn （P＜0.05）. LY294002 could partially reverse the therapeutic effect of high-dose Huangqi Yanghe Decoction on DFU rats （P＜0.05）. Conclusion Huangqi Yanghe Decoction can regulate PI3K/AKT/NF-κB pathway， inhibit inflammatory response in DFU rats， promote angiogenesis and thus promote wound healing.

Key words： Huangqi Yanghe Decoction; diabetic foot ulcer; wound healing; phosphatidylinositol 3-kinase; protein kinase B; nuclear factor-κB

糖尿病足（DF）是糖尿病的常見(jiàn)并發(fā)癥，為下肢遠(yuǎn)端血管病變合并神經(jīng)病變，進(jìn)一步形成足部感染、潰瘍，稱為糖尿病足潰瘍（DFU）［1］。DFU是患者截肢和長(zhǎng)期住院的重要原因，糖尿病患者高位截肢發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較非糖尿病患者高10～30倍，且截肢后的5年病死率為39%～68%［2-3］。DFU的病理過(guò)程非常復(fù)雜，涉及受損的皮膚、肌肉、肌腱、骨骼、神經(jīng)和血管，并伴有持續(xù)的高血糖狀態(tài)［4］，這使DFU較正常傷口難以愈合，且治療費(fèi)用高，長(zhǎng)期創(chuàng)面存在會(huì)導(dǎo)致原病情加重。目前DFU的治療方法主要包括控制血糖、抗感染、外科清創(chuàng)術(shù)和外用生長(zhǎng)因子［5］，但治療效果并不理想。需要不斷研究促進(jìn)DFU疾病治愈的新方法以降低致殘率和病死率。有研究表明，中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥在治療糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥方面有顯著的作用［6］。陽(yáng)和湯出自清代王洪緒《外科證治全生集》，臨床上被廣泛應(yīng)用于治療DFU［7］、下肢血管病變［8］；且研究發(fā)現(xiàn)其可加速創(chuàng)面愈合，結(jié)合負(fù)壓技術(shù)能夠縮短DF患者創(chuàng)面愈合時(shí)間，臨床療效明顯［9］。黃芪及以黃芪為主藥的方劑可明顯促進(jìn)創(chuàng)面愈合，降低高血糖，有效提升早期DF的治療效果［10-11］。因此，本研究以陽(yáng)和湯為主方，加入生黃芪，簡(jiǎn)稱黃芪陽(yáng)和湯。通過(guò)構(gòu)建DFU大鼠模型，探究黃芪陽(yáng)和湯對(duì)DFU大鼠創(chuàng)面愈合的影響及可能的作用機(jī)制，為黃芪陽(yáng)和湯的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠，10周齡，體質(zhì)量353～379 g，購(gòu)自湖北綠雪生物產(chǎn)業(yè)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（鄂）2022-0015。將所有大鼠放在可控制的光照下保持12 h明暗交替，溫度22～26 ℃，相對(duì)濕度為45%～60%，可以自由獲取食物和水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)張家口學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：ZJKXY倫審2022-113）。

1.1.2 藥物與試劑 黃芪陽(yáng)和湯［組方：熟地50 g、肉桂5 g（去皮，研粉）、麻黃3 g、鹿角膠15 g、白芥子10 g、姜炭3 g、生甘草5 g、生黃芪100 g］，以上中藥均購(gòu)自河北豪通中藥飲片有限公司，加水500 mL煎煮1 h，過(guò)濾藥液；再加水500 mL繼續(xù)煎煮1 h，過(guò)濾第2次的藥液；將2次的藥液合并，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成生藥質(zhì)量濃度為0.85 g/mL、1.7 g/mL的藥液。鏈脲佐菌素（STZ）、PI3K/AKT通路抑制劑（LY294002）、HE染色試劑盒、山羊血清、BCA試劑盒、ECL試劑均購(gòu)自武漢科前生物技術(shù)有限公司；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）、C反應(yīng)蛋白（CRP）、白細(xì)胞介素（IL）-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒，蛋白裂解液均購(gòu)自深圳紐邦生物技術(shù)有限公司；兔抗大鼠CD31一抗，羊抗兔二抗，鼠源磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、磷酸化PI3K（p-PI3K）、蛋白激酶B（AKT）、磷酸化AKT（p-AKT）、核因子-κB p65（NF-κB p65）、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）、NF-κB抑制蛋白α（IκB-α）、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）一抗，羊抗鼠二抗均購(gòu)自濟(jì)南思科生物科技有限公司。

1.1.3 儀器 血糖儀（型號(hào)Accu-Chek Active）、酶標(biāo)儀（型號(hào)iMark680）、熒光顯微鏡（型號(hào)IX73）均購(gòu)自天津科德生物技術(shù)有限公司；經(jīng)皮氧分壓監(jiān)測(cè)儀（型號(hào)PeriFlux 5000）、凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)OmegaLum C）均購(gòu)自廣州威佳科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立及分組給藥 構(gòu)建DFU大鼠模型［12］：大鼠喂養(yǎng)高脂高糖飼料（含66.5%基礎(chǔ)飼料+10%豬油+20%蔗糖+ 2.5%膽固醇+1%膽酸鈉），4周后，一次性腹腔注射STZ 60 mg/kg（注射前大鼠禁食12 h），3 d后尾尖處取血檢測(cè)空腹血糖（FBG），若FBG＞16.7 mmol/L，且大鼠出現(xiàn)多食、多飲、多尿的表現(xiàn)，即為糖尿病大鼠建模成功。隨后麻醉大鼠，脫去右后足背部毛發(fā)，碘伏消毒，切除足背全層皮膚，創(chuàng)建5 mm×? ?2 mm的矩形全層傷口，完成DFU大鼠造模［12］。將造模成功的48只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組，黃芪陽(yáng)和湯低（8.5 g/kg）、高（17 g/kg）劑量組，黃芪陽(yáng)和湯高劑量（17 g/kg）＋LY294002（0.3 mg/kg）組［13］，每組12只。另取12只健康大鼠作為對(duì)照組，以普通飼料喂養(yǎng)，使用等量生理鹽水代替STZ腹腔注射，以上述方式創(chuàng)建足背傷口。

給藥劑量換算：黃芪陽(yáng)和湯根據(jù)臨床給藥劑量（70 kg成人給藥劑量191 g），按種屬間體表面積換算，大鼠對(duì)應(yīng)給藥劑量為成人的6.3倍，換算大鼠等效劑量約為17 g/kg，因此，設(shè)置黃芪陽(yáng)和湯低、高劑量為8.5、17 g/kg。

建模后，對(duì)照組、模型組大鼠不進(jìn)行藥物干預(yù)，灌胃蒸餾水早晚各1次；黃芪陽(yáng)和湯低、高劑量組大鼠每天分別給予8.5、17 g/kg的黃芪陽(yáng)和湯灌胃給藥（生藥含量為0.85、1.7 g/mL的藥液，灌胃體積10 mL/kg），早、晚各1次；黃芪陽(yáng)和湯高劑量＋LY294002組大鼠每天給予17 g/kg的黃芪陽(yáng)和湯灌胃給藥（灌胃體積10 mL/kg），早晚各1次，同時(shí)腹腔注射0.3 mg/kg的LY294002，每日注射1次。各組連續(xù)給藥4周。

1.2.2 大鼠一般狀態(tài)和傷口愈合情況觀察 實(shí)驗(yàn)期間觀察大鼠一般狀態(tài)及創(chuàng)面變化，并于第14、28天給藥后使用數(shù)碼相機(jī)拍照，記錄傷口創(chuàng)面的愈合情況，并通過(guò)Image-Pro Plus 6.0軟件分析潰瘍區(qū)域面積。計(jì)算大鼠創(chuàng)面愈合率，創(chuàng)面愈合率（%）=（1-給藥后潰瘍區(qū)域面積/給藥前潰瘍區(qū)域面積）×100%。

1.2.3 大鼠FBG水平的檢測(cè) 在第14、28天給藥后，采集大鼠尾靜脈血，采用血糖儀測(cè)量大鼠FBG水平。

1.2.4 大鼠創(chuàng)面周圍組織經(jīng)皮氧分壓（TcpO2）的檢測(cè) 于第14、28天給藥后，采用TcpO2監(jiān)測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)大鼠創(chuàng)面周圍組織TcpO2。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，將創(chuàng)面周圍毛發(fā)剃去，清洗干凈，將TcpO2探頭固定在大鼠創(chuàng)面周圍皮膚上（不漏氣），放置電極，連續(xù)監(jiān)測(cè)15 min。待TcpO2穩(wěn)定后，讀數(shù)并記錄監(jiān)測(cè)數(shù)值。

1.2.5 大鼠血清生長(zhǎng)因子（VEGF、HIF-1α）和炎性因子（CRP、IL-6）的檢測(cè) 末次給藥結(jié)束24 h后，腹主動(dòng)脈取血3 mL，靜置后以4 700 r/min離心17 min，取上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中VEGF、HIF-1α、CRP、IL-6水平。

1.2.6 大鼠創(chuàng)面組織病理學(xué)變化的檢測(cè) 取血完成后，頸椎脫臼處死大鼠，取大鼠創(chuàng)面及周圍3 mm組織，并將其分為2份，1份于-80 ℃冰箱中保存；另外1份固定于4%多聚甲醛溶液中，石蠟包埋，4 ?m厚度切片；取部分切片HE染色，在顯微鏡下觀察表皮再生、肉芽組織形成和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

1.2.7 免疫熒光染色測(cè)定創(chuàng)面組織微血管密度 使用兔抗大鼠CD31一抗進(jìn)行免疫熒光染色，分析創(chuàng)面組織微血管密度。取1.2.6中的切片，在3%正常山羊血清中封閉，然后與兔抗大鼠CD31一抗在4 ℃孵育24 h，洗去一抗，滴加羊抗兔二抗（1∶200），室溫下孵育1 h，洗去二抗，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并計(jì)算創(chuàng)面周圍組織微血管密度（微血管被染成紅色），微血管密度=微血管染色面積/視野區(qū)域面積×100%，用Image J軟件定量分析。每張切片觀察5個(gè)區(qū)域，取平均值。

1.2.8 Western blot檢測(cè)大鼠創(chuàng)面組織中PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 取1.2.6中-80 ℃保存的大鼠創(chuàng)面組織，解凍后研磨勻漿，蛋白裂解液裂解，BCA法進(jìn)行蛋白定量。取等量蛋白樣品上樣（30 μg），凝膠電泳分離，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，然后在4 ℃下與稀釋比例為1∶1 450的鼠源PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκB-α、β-actin一抗孵育過(guò)夜。TBST洗滌，加稀釋比例為1∶2 200的羊抗鼠二抗在室溫下孵育2 h。ECL顯色，分析膜上蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（[x] ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪陽(yáng)和湯對(duì)DFU大鼠一般狀態(tài)和創(chuàng)面愈合的影響 對(duì)照組大鼠毛色光滑，飲食、飲水、排泄均正常，較活躍，創(chuàng)面愈合快；與對(duì)照組相比，模型組大鼠毛色暗淡無(wú)光澤，活動(dòng)減少，且出現(xiàn)多飲、多食、多尿癥狀，創(chuàng)面顏色較深，周圍組織出現(xiàn)水腫、潰瘍，第14、28天給藥后創(chuàng)面愈合率降低（P＜0.05）；與模型組相比，黃芪陽(yáng)和湯低、高劑量組大鼠狀態(tài)逐漸改善，第14、28天給藥后創(chuàng)面愈合率依次升高（P＜0.05）；與黃芪陽(yáng)和湯高劑量組相比，黃芪陽(yáng)和湯高劑量＋LY294002組大鼠第14、28天給藥后創(chuàng)面愈合率降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖1、表1。

2.2 各組大鼠FBG水平變化 與對(duì)照組相比，模型組大鼠第14、28天給藥后FBG水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，黃芪陽(yáng)和湯低、高劑量組大鼠第14、28天給藥后FBG水平依次降低（P＜0.05）；與黃芪陽(yáng)和湯高劑量組相比，黃芪陽(yáng)和湯高劑量＋LY294002組大鼠第14、28天給藥后FBG水平升高（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 各組大鼠創(chuàng)面周圍組織TcpO2比較 與對(duì)照組相比，模型組大鼠第14、28天給藥后創(chuàng)面周圍組織TcpO2降低（P＜0.05）；與模型組相比，黃芪陽(yáng)和湯低、高劑量組大鼠第14、28天給藥后創(chuàng)面周圍組織TcpO2依次升高（P＜0.05）；與黃芪陽(yáng)和湯高劑量組相比，黃芪陽(yáng)和湯高劑量＋LY294002組大鼠第14、28天給藥后創(chuàng)面周圍組織TcpO2降低（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

2.4 各組大鼠血清VEGF、HIF-1α、CRP、IL-6水平比較 與對(duì)照組相比，模型組大鼠血清VEGF、HIF-1α水平降低，CRP、IL-6水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，黃芪陽(yáng)和湯低、高劑量組大鼠血清VEGF、HIF-1α水平依次升高，CRP、IL-6水平依次降低（P＜0.05）；與黃芪陽(yáng)和湯高劑量組相比，黃芪陽(yáng)和湯高劑量＋LY294002組血清VEGF、HIF-1α水平降低，CRP、IL-6水平升高（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

2.5 各組大鼠創(chuàng)面組織病理學(xué)變化 對(duì)照組大鼠創(chuàng)面組織炎癥反應(yīng)較輕，新生血管較多，肉芽組織中成纖維細(xì)胞及膠原基質(zhì)豐富；模型組大鼠創(chuàng)面組織可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，伴組織壞死、滲出，新生血管及成纖維細(xì)胞較少；與模型組相比，黃芪陽(yáng)和湯低、高劑量組大鼠創(chuàng)面炎性細(xì)胞減少，肉芽下方新生血管旺盛；與黃芪陽(yáng)和湯高劑量組相比，黃芪陽(yáng)和湯高劑量＋LY294002組大鼠創(chuàng)面組織炎性細(xì)胞增多，成纖維細(xì)胞及新生血管減少。見(jiàn)圖2。

2.6 各組大鼠創(chuàng)面組織微血管密度比較 對(duì)照組、模型組、黃芪陽(yáng)和湯低劑量組、黃芪陽(yáng)和湯高劑量組、黃芪陽(yáng)和湯高劑量＋LY294002組大鼠創(chuàng)面組織微血管密度分別為（34.92±5.45）%、（10.15±1.91）%、（18.24±3.15）%、（30.31±4.48）%、（20.09±3.06）%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=12，F(xiàn)=80.757，P＜0.01）。與對(duì)照組相比，模型組大鼠創(chuàng)面組織微血管密度降低（P＜0.05）；與模型組相比，黃芪陽(yáng)和湯低、高劑量組大鼠創(chuàng)面組織微血管密度依次升高（P＜0.05）；與黃芪陽(yáng)和湯高劑量組相比，黃芪陽(yáng)和湯高劑量＋LY294002組大鼠創(chuàng)面組織微血管密度降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

2.7 各組大鼠創(chuàng)面組織PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)變化 與對(duì)照組相比，模型組大鼠創(chuàng)面組織p-PI3K、p-AKT、IκB-α蛋白表達(dá)水平降低，p-NF-κB p65蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與模型組相比，黃芪陽(yáng)和湯低、高劑量組大鼠創(chuàng)面組織p-PI3K、p-AKT、IκB-α蛋白表達(dá)水平依次升高，p-NF-κB p65蛋白表達(dá)依次降低（P＜0.05）；與黃芪陽(yáng)和湯高劑量組相比，黃芪陽(yáng)和湯高劑量＋LY294002組大鼠創(chuàng)面組織p-PI3K、p-AKT、IκB-α蛋白表達(dá)水平降低，p-NF-κB p65蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖4、表5。

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為DFU屬于“脫疽”范疇，其發(fā)病機(jī)制為陰陽(yáng)俱虛、氣陰兩虛、血脈瘀阻。而腎主骨、生髓，腎陽(yáng)不足則缺少溫煦生發(fā)之力，導(dǎo)致寒阻血凝，血液運(yùn)行不暢［14］。因此，可從補(bǔ)腎、益氣、溫陽(yáng)、活血角度出發(fā)尋找DFU的治療方法。

陽(yáng)和湯具有溫陽(yáng)散寒、補(bǔ)血通滯的功效，方中熟地可滋陰補(bǔ)血，鹿角膠溫陽(yáng)補(bǔ)腎，肉桂、姜炭可溫通血脈，麻黃散寒通絡(luò)，白芥子驅(qū)寒通滯。已有研究表明，陽(yáng)和湯治療DFU效果顯著，可明顯縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間［9］。本研究所用黃芪陽(yáng)和湯是在陽(yáng)和湯的基礎(chǔ)上加黃芪以增加其益氣排膿的功效，而且黃芪在臨床上也被廣泛用于糖尿病及其并發(fā)癥的治療［15］。TcpO2可用于評(píng)估糖尿病周圍血管病變的狀況，可以有效反映下肢動(dòng)脈病變所致的微循環(huán)狀態(tài)，具有敏感度和特異度高，檢測(cè)方便、經(jīng)濟(jì)、可靠、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，目前已有研究應(yīng)用TcpO2預(yù)測(cè)DFU潰瘍愈合情況［16］。本研究結(jié)果顯示，DFU大鼠一般狀態(tài)較差，創(chuàng)面組織病理?yè)p傷嚴(yán)重，創(chuàng)面愈合率、創(chuàng)面周圍組織TcpO2較健康大鼠降低，F(xiàn)BG水平較健康大鼠升高，表明DFU模型建立成功；而經(jīng)黃芪陽(yáng)和湯治療后，大鼠一般狀態(tài)好轉(zhuǎn)，創(chuàng)面組織病變程度減輕，且創(chuàng)面愈合率、創(chuàng)面周圍組織TcpO2升高，F(xiàn)BG降低，且劑量越高效果越好，提示黃芪陽(yáng)和湯用于治療DFU可發(fā)揮降血糖、促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用。黃芪陽(yáng)和湯組方中麻黃、甘草、黃芪等中藥及其主要成分均被報(bào)道有降血糖作用［17-19］，推測(cè)其降糖作用可能與方中的一些中藥或活性成分有關(guān)，究竟是何種成分發(fā)揮降血糖作用及其機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

高血糖通過(guò)升高促炎細(xì)胞因子水平和降低生長(zhǎng)因子水平，并通過(guò)減少血液循環(huán)及傷口中的細(xì)胞增殖、遷移延遲創(chuàng)面愈合［20］。血管生成是傷口愈合過(guò)程中必不可少的部分。研究表明高糖可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，抑制血管生成和傷口愈合，而促進(jìn)血管生成可加速糖尿病大鼠的傷口愈合［21］。本研究結(jié)果顯示，DFU大鼠創(chuàng)面組織微血管密度較低，而黃芪陽(yáng)和湯干預(yù)后，大鼠創(chuàng)面組織微血管密度升高。HE染色亦顯示黃芪陽(yáng)和湯可減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，促進(jìn)肉芽組織形成、成纖維細(xì)胞增殖和血管生成，加速傷口愈合。CRP是糖尿病及大血管病變的危險(xiǎn)因子，DF創(chuàng)面愈合緩慢與CRP、IL-6過(guò)高表達(dá)有關(guān)［22］。HIF-1α可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧代謝，是唯一能在缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的轉(zhuǎn)錄因子；VEGF是HIF-1α的下游基因，可特異性地促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)及血管新生，有利于血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖［23］。本研究結(jié)果顯示，黃芪陽(yáng)和湯可降低血清炎性因子CRP、IL-6水平，升高生長(zhǎng)因子VEGF、HIF-1α水平，提示黃芪陽(yáng)和湯可抑制局部組織炎癥反應(yīng)，促進(jìn)血管生成并增加血液運(yùn)輸氧氣的功能，進(jìn)而加速DFU大鼠創(chuàng)面愈合。

PI3K/AKT和NF-κB信號(hào)在炎癥及血管生成中起關(guān)鍵作用。LY294002為PI3K/AKT通路的阻斷劑，可抑制PI3K磷酸化，阻斷PI3K/AKT通路影響血管生成。PI3K是PI3K/AKT/NF-κB通路的上游啟動(dòng)子，在生長(zhǎng)因子刺激下可進(jìn)一步激活A(yù)KT，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移，進(jìn)而產(chǎn)生新的微血管［24］。研究表明，PI3K/AKT通路在糖尿病中會(huì)受到抑制，激活PI3K/AKT通路可促進(jìn)血管新生，從而促進(jìn)傷口愈合［25］。NF-κB是涉及先天免疫和炎癥反應(yīng)的多效調(diào)節(jié)劑，可調(diào)節(jié)炎性因子的分泌，抑制PI3K/AKT通路可導(dǎo)致NF-κB抑制性蛋白IκBα表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)NF-κB磷酸化，進(jìn)而調(diào)節(jié)促炎因子的表達(dá)［26］。本研究結(jié)果顯示，黃芪陽(yáng)和湯可升高DFU大鼠創(chuàng)面組織中p-PI3K、p-AKT、IκB-α蛋白表達(dá)水平，降低p-NF-κB p65蛋白表達(dá)，提示黃芪陽(yáng)和湯可激活PI3K/AKT通路，抑制NF-κB的活化。為了進(jìn)一步驗(yàn)證黃芪陽(yáng)和湯的作用機(jī)制，本研究在高劑量黃芪陽(yáng)和湯干預(yù)的基礎(chǔ)上使用LY294002來(lái)抑制PI3K/AKT通路的激活，結(jié)果顯示，LY294002可部分逆轉(zhuǎn)高劑量黃芪陽(yáng)和湯對(duì)DFU大鼠的治療效果，提示黃芪陽(yáng)和湯對(duì)DFU大鼠創(chuàng)面愈合的促進(jìn)作用可能與激活PI3K/AKT通路，抑制NF-κB的活化，進(jìn)而降低炎癥反應(yīng)，促進(jìn)血管新生有關(guān)。但黃芪陽(yáng)和湯能否通過(guò)其他信號(hào)通路起作用還有待后續(xù)研究。

參考文獻(xiàn)

［1］ DAYYA D，O'NEILL O J，HUEDO-MEDINA T B，et al. Debridement of diabetic foot ulcers［J］. Adv Wound Care （New Rochelle），2022，11（12）：666-686. doi：10.1089/wound.2021.0016.

［2］ YANG S L，HU L Y，HAN R，et al. Neuropeptides，inflammation，biofilms，and diabetic foot ulcers［J］. Exp Clin Endocrinol Diabetes，2022，130（7）：439-446. doi：10.1055/a-1493-0458.

［3］ BIZ C，RUGGIERI P. Distal metatarsal osteotomies for chronic plantar diabetic foot ulcers［J］. Foot Ankle Clin，2022，27（3）：545-566. doi：10.1016/j.fcl.2022.02.003.

［4］ ALDANA P C，CARTRON A M，KHACHEMOUNE A. Reappraising diabetic foot ulcers：a focus on mechanisms of ulceration and clinical evaluation［J］. Int J Low Extrem Wounds，2022，21（3）：294-302. doi：10.1177/1534734620944514.

［5］ BOLTON L. Diabetic foot ulcer：treatment challenges［J］. Wounds，2022，34（6）：175-177. doi：10.25270/wnds/2022.175177.

［6］ 張榮榮，王剛，李夢(mèng)虎. 中西醫(yī)結(jié)合治療糖尿病足的研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合外科雜志，2022，28（5）：740-743. ZHANG R R，WANG G，LI M L. Research progress in the treatment of diabetes foot with integrated traditional Chinese medicine and western medicine［J］. Chinese Journal of Surgery of Integrated Traditional and Western Medicine，2022，28（5）：740-743. doi：10.3969/j.issn.1007-6948.2022.05.029.

［7］ 陳晶，劉欣欣，李瑒，等. 陽(yáng)和湯的臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究進(jìn)展［J］. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2022，40（8）：10-13. CHEN J，LIU X X，LI Y，et al. Research progress on indications of yanghe decoction（陽(yáng)和湯）［J］. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine，2022，40（8）：10-13. doi：10.13193/j.issn.1673-7717.2022.08.003.

［8］ 侯俊杰，李大勇，李世征，等. 加味陽(yáng)和湯治療寒凝血瘀證下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的臨床療效及對(duì)血清ET-1、NO水平變化的影響［J］. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2019，37（9）：2093-2097. HOU J J，LI D Y，LI S Z，et al. Clinical efficacy of Jiawei Yanghe Decoction in treating lower extremity arteriosclerosis obliterans with cold coagulation and blood stasis syndrome and its effect on serum levels of ET-1 and NO［J］. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine，2019，37（9）：2093-2097. doi：10.13193/j.issn.1673-7717.2019.09.010.

［9］ 王永靈，廖明娟，李琰，等. 陽(yáng)和湯加減結(jié)合負(fù)壓技術(shù)治療糖尿病足65例［J］. 中醫(yī)外治雜志，2020，29（2）：50-51. WANG Y L，LIAO M J，LI Y，et al. Treatment of 65 cases of diabetes foot with Yanghe decoction plus negative pressure technique［J］. Journal of External Therapy of Traditional Chinese Medicine，2020，29（2）：50-51. doi：10.3969/j.issn.1006-978X.2020.02.026

［10］ 牛文晶，劉鵬，王軍. 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討黃芪-當(dāng)歸治療糖尿病足的作用機(jī)制［J］. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合外科雜志，2022，28（2）：252-257. NIU W J，LI P，WANG J. Mechanism of Huangqi-Danggui on diabetic foot based on network pharmacology［J］. Chinese Journal of Surgery of Integrated Traditional and Western Medicine，2022，28（2）：252-257. doi：10.3969/j.issn.1007-6948.2022.02.020.

［11］ 馬艷春，段瑩，胡建輝，等. 黃芪治療糖尿病及其并發(fā)癥研究進(jìn)展［J］. 中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2022，50（6）：103-107. MA Y C，DUAN Y，HU J H，et al. Research progress of astragalus membranaceus in treating dm and its complications［J］. Acta Chinese Medicine and Pharmacology，2022，50（6）：103-107. doi：10.19664/j.cnki.1002-2392.220141.

［12］ 張春玲，陳露，趙偉，等. 基于轉(zhuǎn)換生長(zhǎng)因子-β1/Smad3信號(hào)通路觀察丹黃散在糖尿病大鼠足潰瘍創(chuàng)面愈合中的作用［J］. 中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2020，36（21）：3473-3476，3480. ZHANG C L，CHEN L，ZHAO W，et al. Danhuang powder promotes the wound healing of diabetic foot ulcer through transforming growth factor-β1/Smad3 signaling pathway in rats［J］. The Chinese Journal of Clinical Pharmacology，2020，36（21）：3473-3476，3480. doi：10.13699/j.cnki.1001-6821.2020.21.019.

［13］ 賈湘隆，徐旭英. 基于PI3K/AKT通路對(duì)回陽(yáng)生肌膏促進(jìn)糖尿病陰證瘡面的微血管新生作用機(jī)制的初探［J］. 中華中醫(yī)藥雜志，2020，35（2）：646-649. JIA X L，XU X Y. Preliminary mechanism study of Huiyang Shengji Ointment on affecting microvascular neogenesis of yin syndrome wound of diabetes based on PI3K/AKT pathway［J］. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy，2020，35（2）：646-649.

［14］ 耿樹(shù)軍，楊軍，莫爵飛. 132例缺血性糖尿病足潰瘍患者局部病變的中醫(yī)證候特征［J］. 中醫(yī)雜志，2022，63（20）：1958-1964. GENG S J，YANG J，MO J F. Characteristics of traditional Chinese medicine syndromes of local lesions in 132 patients with ischemic diabetic foot ulcer［J］. Journal of Traditional Chinese Medicine，2022，63（20）：1958-1964. doi：10.13288/j.11-2166/r.2022.20.011.

［15］ 馬斌，柴智，王金虹. 基于VOSviewer軟件的黃芪治療糖尿病研究文獻(xiàn)計(jì)量分析［J］. 中國(guó)藥房，2020，31（21）：2634-2639. MA B，CHAI Z，WANG J H. Bibliometric analysis of astragalus membranaceus in the treatment of diabetes based on VOSviewer software［J］. China Pharmacy，2020，31（21）：2634-2639. doi：10.6039/j.issn.1001-0408.2020.21.13.

［16］ 莫嘉敏，顏曉東，黃秀祿，等. 下肢動(dòng)脈病變和組織微循環(huán)狀況對(duì)傷口負(fù)壓治療糖尿病足潰瘍的療效影響［J］. 中華糖尿病雜志，2021，13（3）：209-214. MO J M，YAN X D，HUANG X L，et al. Effects of different lower extremity arterial disease and tissue microcirculation on negative pressure therapy for diabetic foot ulcer［J］. Chinese Journal of Diabetes，2021，13（3）：209-214. doi：10.3760/cma.j.cn115791-20200713-00439.

［17］ 卓小玉，陳晶，田明，等. 麻黃的化學(xué)成分與藥理作用研究進(jìn)展［J］. 中醫(yī)藥信息，2021，38（2）：80-83. ZHUO X Y，CHEN J，TIAN M，et al. Research progress on chemical constituents and pharmacological effects of ephedra sinica［J］. Information on Traditional Chinese Medicine，2021，38（2）：80-83. doi：10.19656/j.cnki.1002-2406.210216.

［18］ 肖先，李春燕，劉曉龍，等. 甘草的主要化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2023，40（3）：280-285. XIAO X，LI C Y，LIU X L，et al. Research progress of main chemical constituents and pharmacological effects of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma［J］. Journal of Xinxiang Medical University，2023，40（3）：280-285. doi：10.7683/xxyxyxb.2023.03.016.

［19］ 馬艷春，胡建輝，吳文軒，等. 黃芪化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］. 中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2022，50（4）：92-95. MA Y C，HU J H，WU W X，et al. Research progress on chemical constituents and pharmacological effects of Radix Astragali［J］. Acta Chinese Medicine and Pharmacology，2022，50（4）：92-95. doi：10.19664/j.cnki.1002-2392.220092.

［20］ AITCHESON S M，F(xiàn)RENTIU F D，HURN S E，et al. Skin wound healing：normal macrophage function and macrophage dysfunction in diabetic wounds［J］. Molecules，2021，26（16）：4917. doi：10.3390/molecules26164917.

［21］ WANG B S，MA X F，ZHANG C Y，et al. Astragaloside IV improves angiogenesis and promotes wound healing in diabetic rats via the activation of the SUMOylation Pathway［J］. Biomed Environ Sci，2021，34（2）：124-129. doi：10.3967/bes2021.018.

［22］ BASIRI R，SPICER M，LEVENSON C，et al. Improving dietary intake of essential nutrients can ameliorate inflammation in patients with diabetic foot ulcers［J］. Nutrients，2022，14（12）：2393-2403. doi：10.3390/nu14122393.

［23］ ZHAO K，JIANG Y P，ZHANG J，et al. Celastrol inhibits pathologic neovascularization in oxygen-induced retinopathy by targeting the miR-17-5p/HIF-1α/VEGF pathway［J］. Cell Cycle，2022，21（19）：2091-2108. doi：10.1080/15384101.2022.2087277.

［24］ LUO L，LIANG H，LIU L. Myristicin regulates proliferation and apoptosis in oxidized low-density lipoprotein-stimulated human vascular smooth muscle cells and human umbilical vein endothelial cells by regulating the PI3K/Akt/NF-κB signalling pathway［J］. Pharm Biol，2022，60（1）：56-64. doi：10.1080/13880209.2021.2010775.

［25］ WANG J，WU H，PENG Y X，et al. Hypoxia adipose stem cell-derived exosomes promote high-quality healing of diabetic wound involves activation of PI3K/Akt pathways［J］. J Nanobiotechnology，2021，19（1）：202-214. doi：10.1186/s12951-021-00942-0.

［26］ ZHONG R，XIA T，WANG Y，et al. Physalin B ameliorates inflammatory responses in lipopolysaccharide-induced acute lung injury mice by inhibiting NF-κB and NLRP3 via the activation of the PI3K/Akt pathway［J］. J Ethnopharmacol，2022，284（1）：114777. doi：10.1016/j.jep.2021.114777.

（2023-04-23收稿 2023-07-13修回）

（本文編輯 陳麗潔）