李偉 陳亮 呂昌迎

摘要：目的 分析環(huán)狀RNA同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白激酶3（circ_HIPK3）靶向miR-381-3p/鋅指蛋白217（ZNF217）軸對β淀粉樣蛋白（Aβ）誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元功能和形態(tài)的影響。方法 制備新生大鼠海馬神經(jīng)元，分為對照組、Aβ組、si NC1組、si HIPK3組、si HIPK3+inhibitor NC組、si HIPK3+miR-381-3p inhibitor組、si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si NC2組、si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217組，除對照組外其余組均通過40 μmol/L Aβ1～42誘導(dǎo)。qRT-PCR法測定海馬神經(jīng)元circ_HIPK3、miR-381-3p、ZNF217 mRNA表達(dá)，透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，CCK-8法測定海馬神經(jīng)元存活率，Hochesst 33342法測定海馬神經(jīng)元凋亡，流式細(xì)胞儀檢測海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度，Western blot法測定海馬神經(jīng)元磷酸化Tau蛋白（P-Tau）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶-3（Caspase-3）、ZNF217蛋白表達(dá)，雙螢光素酶報告基因分析miR-381-3p與circ_HIPK3、ZNF217靶向關(guān)系。結(jié)果 對照組海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常，胞核形態(tài)正常，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無病理改變；Aβ組海馬神經(jīng)元呈退行性改變，核形態(tài)異常，膜內(nèi)陷，可見大量線粒體腫脹，胞漿內(nèi)含大量脂滴空泡；與Aβ組相比，si HIPK3組海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)部分恢復(fù)；與si HIPK3組相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor組海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重；與si HIPK3+miR-381-3p inhibitor組相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217組海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷減輕。與對照組相比，Aβ組海馬神經(jīng)元circ_HIPK3、ZNF217 mRNA和蛋白表達(dá)、凋亡率、Ca2+熒光強(qiáng)度、P-Tau、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)升高，miR-381-3p表達(dá)、存活率、Bcl-2蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與Aβ組相比，si HIPK3組海馬神經(jīng)元circ_HIPK3、ZNF217 mRNA和蛋白表達(dá)、凋亡率、Ca2+熒光強(qiáng)度、P-Tau、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)降低，miR-381-3p表達(dá)、存活率、Bcl-2蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與si HIPK3組相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor組海馬神經(jīng)元circ_HIPK3、ZNF217 mRNA和蛋白表達(dá)、凋亡率、Ca2+熒光強(qiáng)度、P-Tau、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)升高，miR-381-3p水平、存活率、Bcl-2蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與si HIPK3+miR-381-3p inhibitor組相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217組海馬神經(jīng)元ZNF217 mRNA和蛋白表達(dá)水平、凋亡率、Ca2+熒光強(qiáng)度、P-Tau、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)降低，存活率、Bcl-2蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；miR-381-3p與circ_HIPK3、ZNF217均靶向結(jié)合。結(jié)論 circ_HIPK3沉默可能通過調(diào)控miR-381-3p/ZNF217軸改善Aβ誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)功能損傷。

關(guān)鍵詞：海馬；神經(jīng)元；Tristetraprolin蛋白；circ_HIPK3；miR-381-3p；ZNF217

中圖分類號：R749.16文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.11958/20231013

circ_HIPK3 regulates function and morphology of Aβ induced hippocampal neurons by targeting miR-381-3p/ZNF217 axis

LI Wei1， CHEN Liang1， LYU Changying2△

1 Department 1 of Encephalopathy， 2 Department 3 of Encephalopathy， Jinan Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Hospital， Jinan 271100， China

△Corresponding Author E-mail： lvchangying@sohu.com

Abstract： Objective To analyze the influence of cyclic RNA homologous domain interacting protein kinase 3 （circ_HIPK3） on function and morphology of myloid β-protein （Aβ） induced hippocampal neurons by targeting miR-381-3p/zinc finger protein 217 （ZNF217） axis. Methods Hippocampal neurons of neonatal rats were prepared and divided into the control group， the Aβ group， the si NC1 group， the si HIPK3 group， the si HIPK3+inhibitor NC group， the si HIPK3+miR-381-3p inhibitor group， the si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si NC2 group and the si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217 group. Except the control group， all the other groups were modeled by 40 μmol/L Aβ1～42. qRT-PCR was used to determine the circ of hippocampal neurons circ_HIPK3， miR-381-3p and ZNF217 mRNA levels. Cell morphology was observed by transmission electron microscope， and the survival rate of hippocampal neurons was measured by CCK-8 method. Hochesst 33342 method was used to measure apoptosis of hippocampal neurons. The intracellular Ca2+ fluorescence intensity of hippocampal neurons was detected by flow cytometry. The expression levels of P-Tau， B-cell lymphoma-2 （Bcl-2）， Bcl-2-associated X protein （Bax）， Caspase-3 and ZNF217 proteins in hippocampal neurons were measured by Western blot assay. Double luciferase reporter genes were used to analyze the targeting relationship between miR-381-3p and circ_HIPK3， ZNF217. Results In the control group， the structure of hippocampal neurons was normal， the morphology of nucleus was normal， and there were no pathological changes in mitochondria and endoplasmic reticulum. In the Aβ group， hippocampal neurons showed degenerative changes， abnormal nuclear morphology， membrane invagination， a large number of mitochondria swelling and a large number of lipid droplets vacuoles in cytoplasm. Compared with the Aβ group， the hippocampal neuronal structure was partially restored in the si HIPK3 group. Compared with the si HIPK3 group， the hippocampal neuronal structure was severely damaged in the si HIPK3+miR-381-3p inhibitor group. Compared with the si HIPK3+miR-381-3p inhibitor group， the damage of hippocampal neurons in the si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217 group was reduced. Compared with the control group， the circ_HIPK3， ZNF217 mRNA and ZNF217 protein levels， apoptosis rate， Ca2+ fluorescence intensity， P-Tau， Bax， Caspase-3 protein expression of hippocampal neurons were increased in the Aβ group， and the miR-381-3p level， survival rate and Bcl-2 protein expression decreased （P＜0.05）. Compared with the Aβ group， the circ_HIPK3， ZNF217 mRNA and ZNF217 protein levels， apoptosis rate， Ca2+ fluorescence intensity， P-Tau， Bax and Caspase-3 protein expression of hippocampal neurons were decreased in the si HIPK3 group， and? miR-381-3p level， survival rate and Bcl-2 protein expression increased （P＜0.05）. Compared with the si HIPK3 group， the circ_HIPK3， ZNF217 mRNA and ZNF217 protein levels， apoptosis rate， Ca2+ fluorescence intensity， P-Tau， Bax and Caspase-3 protein expression of hippocampal neurons in the si HIPK3+miR-381-3p inhibitor group were increased， and the miR-381-3p level， survival rate and Bcl-2 protein expression decreased （P＜0.05）. Compared with the si HIPK3+miR-381-3p inhibitor group， the ZNF217 mRNA and ZNF217 protein levels， apoptosis rate， Ca2+ fluorescence intensity， P-Tau， Bax and Caspase-3 protein expression of hippocampal neurons in the si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217 group were decreased， and the survival rate and Bcl-2 protein expression increased （P＜0.05）. miR-381-3p targeted and combined with HIPK3 and ZNF217. Conclusion circ_HIPK3 silencing may ameliorate Aβ-induced damage of hippocampal neuronal structure and function by regulating miR-381-3p/ZNF217 axis.

Key words： hippocampus; neurons; tristetraprolin; circ_HIPK3; miR-381-3p; ZNF217

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是臨床上表現(xiàn)為記憶衰退、失語、行為障礙等癡呆行為的神經(jīng)進(jìn)展性疾病，隨著人口老齡化進(jìn)程加快，AD發(fā)病率呈上升趨勢［1-2］。β淀粉樣蛋白（Amyloid β-protein，Aβ）是由β-淀粉樣前體蛋白水解而來，在腦脊液中大量存在，在細(xì)胞基質(zhì)沉淀聚積后具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性作用，可刺激海馬神經(jīng)元變性和死亡，被認(rèn)定為AD發(fā)病的因素之一［3］?；诖藰?gòu)建AD損傷細(xì)胞模型并進(jìn)行分子靶向分析是研究AD病理的重要方式。環(huán)狀RNA（circRNA）在生物體內(nèi)廣泛存在，在各種細(xì)胞活動中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可與miRNA競爭性結(jié)合參與對下游靶基因的調(diào)控，環(huán)狀RNA同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白激酶3（circRNA homologous domain-interacting protein kinase 3，circ_HIPK3）是一種circRNA，可促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移［4］，減輕CoCl2誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡［5］。miR-381-3p在AD患者體內(nèi)呈低表達(dá)，其過表達(dá)可減弱Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性和炎癥反應(yīng)［6］。鋅指蛋白217（Zinc finger protein 217，ZNF217）屬于鋅指基因家族成員之一，與AD發(fā)病風(fēng)險有關(guān)聯(lián)［7］；調(diào)節(jié)miR-200/ZNF217軸可防止Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞神經(jīng)毒性［8］。經(jīng)查詢StarBase生物信息學(xué)網(wǎng)站（https：//rnasysu.com/encori/）發(fā)現(xiàn)，miR-381-3p與circ_HIPK3、ZNF217均存在結(jié)合位點(diǎn)，circ_HIPK3能否通過miR-381-3p/ZNF217軸參與對Aβ誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)與功能造成影響仍未知，本研究將對此進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性SPF級新生SD大鼠10只，1日齡，體質(zhì)量6.0～7.0 g，購自廣東萊迪生物醫(yī)藥研究院有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2022-0064。實(shí)驗(yàn)前將其與母鼠飼養(yǎng)于同籠，母鼠均正常喂養(yǎng)，動物飼養(yǎng)溫度為22～24 ℃，光照/黑暗時間為12 h，相對濕度40%～60%，大鼠自由攝食、飲水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)濟(jì)南市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)［（2022）倫審第（044）號-KY］，在實(shí)驗(yàn)過程中按照動物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.1.2 主要試劑與儀器 CCK-8試劑盒、Hochesst 33342染色液、鈣熒光探針fluo-3 AM、TRIzol試劑、Lipo脂質(zhì)體高效轉(zhuǎn)染試劑購自北京索萊寶生物科技有限公司；cDNA第一鏈合成/RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green qPCR Mix（2×）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗微管相關(guān)蛋白2（Microtubule associated protein 2，MAP2）、磷酸化Tau蛋白（P-Tau）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）、胱天蛋白酶-3（Caspase-3）、ZNF217購自英國Abcam公司。Gallios流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼公司；7500熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司；Spectra S/TEM透射電子顯微鏡購自美國Thermo Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠海馬神經(jīng)元分離與分組 將新生大鼠斷頭處死，無菌環(huán)境下分離大鼠海馬組織并剪碎，胰酶消化，終止消化并吹打細(xì)胞后進(jìn)行過濾初篩，調(diào)整細(xì)胞濃度（1×106個/mL），接種至L-多聚賴氨酸處理的6孔板，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，48 h后加入5 g/L阿糖胞苷抑制神經(jīng)元活性，隔3 d換液（1/2原培養(yǎng)基），第5天采用神經(jīng)元特異性標(biāo)志物MAP2進(jìn)行免疫熒光染色鑒定神經(jīng)元，陽性率高于90%為神經(jīng)元［9］。

將神經(jīng)元分為對照組（正常培養(yǎng)）、Aβ組（40 μmol/L Aβ1～42培養(yǎng)48 h［10］）、si NC1組（轉(zhuǎn)染si NC1）、si HIPK3組（轉(zhuǎn)染si HIPK3）、si HIPK3+inhibitor NC組（si HIPK3與inhibitor NC共轉(zhuǎn)染）、si HIPK3+miR-381-3p inhibitor組（si HIPK3與miR-381-3p inhibitor共轉(zhuǎn)染）、si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si NC2組（si HIPK3、miR-381-3p inhibitor、si NC2共轉(zhuǎn)染）、si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217組（si HIPK3、miR-381-3p inhibitor、si ZNF217共轉(zhuǎn)染）。除對照組外，其余組均采用Lipo轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6 h后細(xì)胞加入40 μmol/L Aβ1～42培養(yǎng)48 h。

1.2.2 qRT-PCR法測定海馬神經(jīng)元circ_HIPK3、miR-381-3p、ZNF217 mRNA水平 取各組海馬神經(jīng)元總RNA（TRIzol試劑），并將一定量RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行擴(kuò)增，測定程序?yàn)?4 ℃預(yù)處理3 min；94 ℃ 20 s，58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，40個循環(huán)；72 ℃ 5 min。circ_HIPK3、ZNF217（內(nèi)參GAPDH）、miR-381-3p（內(nèi)參U6）水平以2-ΔΔCt法確定。引物序列見表1。

1.2.3 透射電子顯微鏡觀察海馬神經(jīng)元形態(tài) 制備細(xì)胞涂片：將蓋玻片（10 mm×10 mm）在95%乙醇（含1%鹽酸）中浸泡過夜，然后用95%乙醇沖洗2次，滅菌備用。將瓊脂糖滴在蓋玻片上，使蓋玻片表面覆蓋一層瓊脂糖（約20 μm厚），再將多聚賴氨酸（0.01 mol/L硼酸溶解）鋪在包被有瓊脂糖的蓋玻片上，將蓋玻片置于無菌條件下的24孔培養(yǎng)板中，加入細(xì)胞懸液（1×105個/mL）進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞長至鋪滿孔底后取出蓋玻片，戊二醛預(yù)固定30 min后，用細(xì)胞刮子輕輕將細(xì)胞連同瓊脂糖膜刮下，繼續(xù)用戊二醛2 h，鋨酸再次固定，經(jīng)乙醇丙酮梯度脫水、浸透、包埋等步驟后，制備超薄切片（70 nm），透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.4 CCK-8法測定海馬神經(jīng)元存活率 將各組細(xì)胞以每孔4 000個的密度接種到96孔板中，培養(yǎng)48 h后，加入CCK-8試劑，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，使用酶標(biāo)儀測定各組細(xì)胞在450 nm處的光密度（OD）值，計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值×100%。

1.2.5 海馬神經(jīng)元凋亡率測定 胰酶消化細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗并重懸，取1 mL細(xì)胞懸液（1×105個/mL）接種至24孔板后，PBS清洗細(xì)胞，4%多聚甲醛固定細(xì)胞5 min，加入Hochesst 33342染色液孵育5 min，PBS清洗細(xì)胞，加入抗熒光淬滅封片液封固，熒光顯微鏡下觀察并確定細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6 熒光探針fluo-3 AM法檢測海馬神經(jīng)元內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度 無Ca2+細(xì)胞外液（135 mmol/L NaCl、KCl、MgCl2、10 mmol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸、4 g/L葡萄糖）稀釋熒光探針fluo-3 AM（5 μmol/L），分組處理后收集各組細(xì)胞（1×105個/mL）至不同管中，加入1 mmol/L fluo-3 AM 5 μL，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌3次，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度（以發(fā)出熒光細(xì)胞的比例計）。

1.2.7 Western blot檢測細(xì)胞中P-Tau、Bcl-2、Bax、Caspase-3、ZNF217蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測總蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳分離總蛋白，濕法轉(zhuǎn)模，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入兔抗P-Tau、Bcl-2、Bax、Caspase-3、ZNF217（稀釋比1∶1 000），4 ℃過夜，洗滌3次，加入山羊抗兔IgG（稀釋比1∶5 000），室溫下孵育1.5 h，TBST洗滌3次。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光底物顯色，用Image-Pro Plus 6.0分析蛋白質(zhì)條帶灰度，計算目的蛋白的相對表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以β-actin作為內(nèi)參。

1.2.8 雙螢光素酶鑒定靶向關(guān)系 構(gòu)建circ_HIPK3和ZNF217的野生型（WT）與突變型（MUT）質(zhì)粒，分別命名為WT HIPK3、MUT HIPK3、WT ZNF217、MUT ZNF217，將其分別與mimic NC、miR-381-3p mimic共轉(zhuǎn)染，分別作為mimics NC+WT HIPK3組、miR-381-3p mimics+WT HIPK3組、mimics NC+MUT HIPK3組、miR-381-3p mimics+MUT HIPK3組；mimics NC+WT ZNF217組、miR-381-3p mimics+WT ZNF217組、mimics NC+MUT ZNF217組、miR-381-3p mimics+MUT ZNF217組，轉(zhuǎn)染48 h，雙螢光素酶試劑盒測定螢光素酶相對活性。檢測circ_HIPK3沉默表達(dá)對miR-381-3p表達(dá)及miR-381-3p過表達(dá)對ZNF217 mRNA與蛋白表達(dá)的影響。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（[x] ±s）表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 海馬神經(jīng)元鑒定 海馬神經(jīng)元培養(yǎng)7 d后，熒光顯微鏡下觀察MAP-2蛋白陽性率>90%，見圖1。

2.2 各組海馬神經(jīng)元circ_HIPK3、miR-381-3p、ZNF217 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較 與對照組相比，Aβ組海馬神經(jīng)元circ_HIPK3、ZNF217 mRNA和ZNF217蛋白表達(dá)水平升高，miR-381-3p表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與Aβ組相比，si HIPK3組海馬神經(jīng)元circ_HIPK3、ZNF217 mRNA和ZNF217蛋白表達(dá)水平降低，miR-381-3p表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與si HIPK3組相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor組海馬神經(jīng)元circ_HIPK3、ZNF217 mRNA和ZNF217蛋白表達(dá)水平升高，miR-381-3p表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與si HIPK3+miR-381-3p inhibitor組相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217組海馬神經(jīng)元ZNF217 mRNA和ZNF217蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），見圖2、表2。

2.3 各組海馬神經(jīng)元形態(tài)觀察 對照組海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常，胞核形態(tài)正常，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無病理改變；Aβ組海馬神經(jīng)元呈退行性改變，核形態(tài)異常，膜內(nèi)陷，可見大量線粒體腫脹，胞漿內(nèi)含大量脂滴空泡；與Aβ組相比，si HIPK3組海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)部分恢復(fù)；與si HIPK3組相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor組海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重；與si HIPK3+miR-381-3p inhibitor組相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217組海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷減輕，見圖3。

2.4 各組海馬神經(jīng)元活力比較 與對照組相比，Aβ組神經(jīng)元存活率降低（P＜0.05）；與Aβ組相比，si HIPK3組神經(jīng)元存活率升高（P＜0.05）；與si HIPK3組相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor組神經(jīng)元存活率降低（P＜0.05）；與si HIPK3+miR-381-3p inhibitor組相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217組神經(jīng)元存活率升高（P＜0.05），見表3。

2.5 各組海馬神經(jīng)元凋亡比較 對照組神經(jīng)元凋亡極少，染色極少；與對照組相比，Aβ組海馬神經(jīng)元凋亡率升高，呈現(xiàn)藍(lán)色熒光（P＜0.05）；與Aβ組相比，si HIPK3組海馬神經(jīng)元凋亡率降低（P＜0.05）；與si HIPK3組相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor組海馬神經(jīng)元凋亡率升高（P＜0.05）；與si HIPK3+miR-381-3p inhibitor組相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217組海馬神經(jīng)元凋亡率降低（P＜0.05），見圖4、表3。

2.6 各組海馬神經(jīng)元Ca2+熒光強(qiáng)度比較 與對照組相比，Aβ組海馬神經(jīng)元Ca2+熒光強(qiáng)度升高（P＜0.05）；與Aβ組相比，si HIPK3組海馬神經(jīng)元Ca2+熒光強(qiáng)度降低（P＜0.05）；與si HIPK3組相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor組海馬神經(jīng)元Ca2+熒光強(qiáng)度升高（P＜0.05）；與si HIPK3+miR-381-3p inhibitor組相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217組Ca2+熒光強(qiáng)度降低（P＜0.05），見圖5、表3。

2.7 各組海馬神經(jīng)元相關(guān)蛋白、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與對照組相比，Aβ組海馬神經(jīng)元P-Tau、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與Aβ組相比，si HIPK3組海馬神經(jīng)元P-Tau、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與si HIPK3組相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor組海馬神經(jīng)元P-Tau、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與si HIPK3+miR-381-3p inhibitor組相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217組海馬神經(jīng)元P-Tau、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），見表4、圖6。

2.8 靶向關(guān)系結(jié)果 miR-381-3p與circ_HIPK3、ZNF217均具有結(jié)合位點(diǎn)，見圖7。雙螢光素酶顯示，miR-381-3p mimics+WT HIPK3組螢光素酶活性低于mimics NC+WT HIPK3組（P＜0.05），miR-381-3p mimics+MUT HIPK3組與mimics NC+MUT HIPK3組螢光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；miR-128-3p mimics+WT ZNF217組螢光素酶活性低于mimics NC+WT ZNF217組（P＜0.05），miR-128-3p mimics+MUT ZNF217組螢光素酶活性與mimics NC+MUT ZNF217組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表5。

與sh NC組相比，sh HIPK3組miR-381-3p表達(dá)水平升高（1.41±0.13 vs. 0.82±0.08，t=9.468，P＜0.05）；與mimics NC組相比，miR-381-3p mimics組ZNF217 mRNA（0.46±0.04 vs. 1.06±0.17，t=8.415，P＜0.05）與蛋白降低（0.33±0.04 vs. 0.83±0.09，t=12.435，P＜0.05），見圖8。

3 討論

海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)、功能損傷是AD發(fā)病基礎(chǔ)之一［11］，控制海馬神經(jīng)元凋亡是延緩AD發(fā)展的方式。Aβ誘導(dǎo)學(xué)說是目前主流觀點(diǎn)之一，神經(jīng)外Aβ沉積誘導(dǎo)神經(jīng)衰老、細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。本研究通過構(gòu)建Aβ誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元，構(gòu)建海馬神經(jīng)元損傷模型，探討AD相關(guān)分子機(jī)制。

circ_HIPK3在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞［12］、結(jié)直腸癌［13］凋亡的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。Zhao等［14］研究顯示，circ_HIPK3可通過競爭性內(nèi)源性RNA（ceRNA）模式減輕脊髓損傷中神經(jīng)元凋亡。有報道稱，敲低HIPK3可通過增強(qiáng)自噬，降低HTT蛋白表達(dá)水平，改善亨廷頓病小鼠神經(jīng)損傷［15］。在本研究中，Aβ誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元呈退行性改變，核形態(tài)異常，膜內(nèi)陷，可見大量線粒體腫脹，胞漿內(nèi)含大量脂滴空泡，且細(xì)胞存活率降低，凋亡率增高，并伴隨Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低及Bax蛋白表達(dá)水平升高，證明模型構(gòu)建成功。采用小分子干擾技術(shù)敲低circ_HIPK3后，Aβ誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元形態(tài)有所恢復(fù)，細(xì)胞存活率升高，凋亡率降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高及Bax蛋白表達(dá)水平降低，提示沉默circ_HIPK3可對AD神經(jīng)元損傷發(fā)揮保護(hù)作用。Ca2+可維持神經(jīng)細(xì)胞正常功能，Aβ沉積會引起神經(jīng)元Ca2+超載，激活一系列級聯(lián)反應(yīng)，在AD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用［16］。本研究中沉默circ_HIPK3可降低Aβ誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元Ca2+超載，表現(xiàn)為Ca2+熒光強(qiáng)度降低，推測其可能原因是沉默circ_HIPK3可抑制細(xì)胞膜上Ca2+通道，使Ca2+內(nèi)流減少，改善Ca2+超載現(xiàn)象。此外，神經(jīng)元相關(guān)蛋白P-Tau蛋白表達(dá)水平降低亦證明沉默circ_HIPK3可發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。

CircRNA可通過海綿化吸附miRNA調(diào)控下游靶基因表達(dá)發(fā)揮作用。miRNA是一種高度穩(wěn)定、小而短的非編碼RNA分子，參與細(xì)胞生長、代謝、分化和發(fā)育的調(diào)節(jié)。miR-381-3p是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種miRNA。在AD患者血清和細(xì)胞模型中檢測到miR-381-3p低表達(dá)，過表達(dá)miR-381-3p可減弱Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性和炎癥反應(yīng)［6］。本研究中Aβ誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元中miR-381-3p表達(dá)水平降低，與既往研究結(jié)果［6］一致；沉默circ_HIPK3可上調(diào)Aβ誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元中miR-381-3p表達(dá)，且miR-381-3p與circ_HIPK3存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)；推測沉默circ_HIPK3對Aβ誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元損傷的改善作用可能與miR-381-3p表達(dá)有關(guān)。本研究采用雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-381-3p與circ_HIPK3之間存在靶向結(jié)合關(guān)系，miR-381-3p低表達(dá)可逆轉(zhuǎn)circ_HIPK3沉默對海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用，提示circ_HIPK3沉默可能通過上調(diào)miR-381-3p表達(dá)對Aβ誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)作用。

ZNF217定位于人染色體20q 13.2，表達(dá)產(chǎn)物為ZNF217蛋白。Wu等［17］研究顯示，ZNF217在AD中參與Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。lncRNA SNHG1敲除可通過上調(diào)miR-361-3p表達(dá)，降低ZNF217表達(dá)，減輕神經(jīng)元損傷［18］。本研究結(jié)果顯示，Aβ誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元中ZNF217 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高，與miR-381-3p表達(dá)趨勢相反；miR-381-3p與ZNF217存在結(jié)合位點(diǎn)，雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)亦驗(yàn)證了miR-381-3p與ZNF217之間存在靶向結(jié)合關(guān)系，且miR-381-3p過表達(dá)后ZNF217 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，miR-381-3p低表達(dá)可逆轉(zhuǎn)circ_HIPK3沉默對海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用，而此逆轉(zhuǎn)作用又可被ZNF217沉默恢復(fù)，即ZNF217沉默亦可發(fā)揮對海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用，提示circ_HIPK3沉默可能通過上調(diào)miR-381-3p表達(dá)，抑制ZNF217表達(dá)發(fā)揮對海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用。

綜上所述，沉默circ_HIPK3可能通過調(diào)控miR-381-3p/ZNF217軸改善Aβ誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)功能損傷。后續(xù)將在動物模型中對本研究結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，此外，circRNA可調(diào)控的下游靶miRNA眾多，circ_HIPK3能否通過其他分子通路發(fā)揮作用仍有待進(jìn)一步探究。

參考文獻(xiàn)

［1］ 劉書雨，張巍. 阿爾茨海默病相關(guān)心臟結(jié)構(gòu)和功能損害［J］. 中國現(xiàn)代神經(jīng)疾病雜志，2023，23（4）：282-286. LIU S Y， ZHANG W. Alzheimer's disease related heart structural and functional damage[J]. Chinese Journal of Contemporary Neurology and Neurosurgery，2023，23（4）：282-286. doi： 10.3969/j.issn.1672-6731.2023.04.003.

［2］ ERATNE D，LOI S M，F(xiàn)ARRAND S，et al. Alzheimer's disease：clinical update on epidemiology，pathophysiology and diagnosis［J］. Australas Psychiaty，2018，26（4）：347-357. doi：1177.1039856218762308/2018.

［3］ PINHEIRO L，F(xiàn)AUSTINO C. Therapeutic strategies targeting amyloid-β in Alzheimer's disease［J］. Curr Alzheimer Res，2019，16（5）：418-452. doi：10.2174/1567205016666190321163438.

［4］ 夏立軍，衣服新，翟旭，等. 環(huán)狀RNA同源域相互作用蛋白激酶3（circHIPK3）通過吸附miR-124-3p促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移［J］. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2020，36（7）：609-615. XIA L J，YI F X，ZHAI X，et al. circHIPK3 promotes the proliferation and metastasis of glioma cells by adsorption of miR-124-3p ［J］. Journal of Cellular and Molecular Immunology，2020，36（7）：609-615. doi：10.13423/j.cnki.cjcmi.009032.

［5］ LIU Y，AO S，ZHANG H，et al. Circ_HIPK3 alleviates CoCl2-induced apoptotic injury in neuronal cells by depending on the regulation of the miR-222-3p/DUSP19 axis［J］. Biochem Biophys Res Commun，2021，553（1）：126-133. doi：10.1016/j.bbrc.2021.03.070.

［6］ ZHANG M，LIU Y，TENG P，et al. Differential expression of miR-381-3p in Alzheimer's disease patients and its role in Beta-amyloid-induced neurotoxicity and inflammation［J］. Neuroimminomodulation，2022，29（3）：211-219. doi：10.1159/000519780.

［7］ 惠娟，王娜娜，張毓洪，等. ZNF224基因與阿爾茨海默病風(fēng)險關(guān)聯(lián)的研究［J］. 中國老年保健醫(yī)學(xué)，2014，12（2）：5-9. HUI J，WANG N N，ZHANG Y H，et al. Association between ZNF224 gene and risk of Alzheimer's disease ［J］. Chinese Journal of Geriatric Medicine，2014，12（2）：5-9. doi：10.3969/j.issn.1672-4860.2014.02.001.

［8］ WANG J，ZHOU T，WANG T，et al. Suppression of lncRNA-ATB prevents amyloid-β-induced neurotoxicity in PC12 cells via regulating miR-200/ZNF217 axis［J］. Biomed Pharmacother，2018，108：707-715. doi：10.1016/j.biopha.2018.08.155.

［9］ 趙美英，史文倩，汪桂青. 長鏈非編碼RNA生長抑制特異因子5調(diào)控微小RNA-137對Aβ誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響［J］. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志 2021，31（9）：64-71. ZHAO M Y，SHI W Q，WANG G Q. Effect of long non-coding RNA growth inhibition factor 5 on MicrornA-137 induced hippocampal neuron injury in rats ［J］. Chinese Journal of Comparative Medicine，2021，31（9）：64-71. doi：10.3969/j.issn.1671-7856.2021.09.010.

［10］ 劉鎮(zhèn)，郝凱敏，祁文秀. HDAC6通過調(diào)控HSP90影響Aβ誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞功能和形態(tài)的研究［J］. 中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報，2020，42（4）：8. LIU Z，HAO K M，QI W X. Effect of HDAC6 on the function and morphology of rat hippocampal neurons induced by Aβ through regulation of HSP90 ［J］. Chinese Journal of Cell Biology，2020，42（4）：8. doi：10.11844/cjcb.2020.04.0001.

［11］ RUAN Z，PATHAK D，KALAVAI S，et al. Alzheimer's disease brain-derived extracellular vesicles spread tau pathology in interneurons［J］. Brain，2021，144（1）：288-309. doi：10.1093/brain/awaa376.

［12］ 田芳，王云，肖哲，等. 環(huán)狀RNA CircHIPK3通過miR-379調(diào)控IGF1表達(dá)促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H1299與NCI-H2170的細(xì)胞增殖［J］. 中國肺癌雜志，2017，20（7）：459-467. TIAN F，WANG Y，XIAO Z，et al. CircHIPK3 promotes cell proliferation of non-small cell lung cancer cell lines NCI-H1299 and NCI-H2170 by regulating IGF1 expression through miR-379 ［J］. Chinese Journal of Lung Cancer，2017，20（7）：459-467. doi：10.3779/j.issn.1009-3419.2017.07.04.

［13］ 徐宇飛，曾俊杰，鄧翰林. circ-HIPK3通過調(diào)控miR-1207-5p促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制［J］. 貴州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2022，47（7）：852-857. XU Y F，ZENG J J，DENG H L. circ-HIPK3 promotes the proliferation and metastasis of colorectal cancer cells by regulating miR-1207-5p ［J］. Journal of Guizhou Medical University，2022，47（7）：852-857. doi：10.19367/j.cnki.2096-8388.2022.07.019.

［14］ ZHAO J，QI X，BAI J，et al. A circRNA derived from linear HIPK3 relieves the neuronal cell apoptosis in spinal cord injury via ceRNA pattern［J］. Biochem Biophys Res Commun，2020，528（2）：359-367. doi：10.1016/j.bbrc.2020.02.108.

［15］ FU Y，SUN X，LU B. HIPK3 modulates autophagy and HTT protein levels in neuronal and mouse models of Huntington disease［J］. Autophagy，2018，14（1）：169-170. doi：10.1080/15548627.

2017.1393130.

［16］ FEDRIZZI L，CARAFOLI E. Ca2+ dysfunction in neurodegenerative disorders：Alzheimer's disease［J］. Biofactors，2011，37（3）：189-196. doi：10.1002/biof.157.

［17］ WU L，DU Q，WU C，et al. CircLPAR1/miR-212-3p/ZNF217 feedback loop promotes amyloid β-induced neuronal injury in Alzheimer's Disease［J］. Brain Res，2021，1770：147622. doi：10.1016/j.brainres.2021.147622.

［18］ GAO Y，ZHANG N，LV C，et al. lncRNA SNHG1 knockdown alleviates amyloid-β-induced neuronal injury by regulating ZNF217 via sponging miR-361-3p in Alzheimer's disease［J］. J Alzheimers Dis，2020，77（1）：85-98. doi：10.3233/JAD-191303.

（2023-07-27收稿 2023-09-18修回）

（本文編輯 陳麗潔）