滿君 高艷艷 宋龍飛 高福生

摘要：目的 探討FEZ家族鋅指1-反義RNA1（LncRNA FEZF1-AS1）靶向調(diào)控miR-200c-3p對(duì)人肺成纖維細(xì)胞HLF生物學(xué)行為的影響。方法 采用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）誘導(dǎo)HLF向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，分為空白對(duì)照組（Blank組）和造模組（HLF+TGF-β1組），另根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒不同將細(xì)胞分為Blank組、TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC組和TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1組。采用Western blot法檢測(cè)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、Ⅰ型膠原蛋白（CollagenⅠ）和波形蛋白（Vimentin）蛋白的表達(dá)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)LncRNA FEZF1-AS1和miR-200c-3p的表達(dá)。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)遷移能力，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)侵襲能力；采用雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FEZF1-AS1與miR-200c-3p的靶向作用關(guān)系。結(jié)果 與Blank組比較，HLF+TGF-β1組α-SMA、CollagenⅠ、Vimentin蛋白表達(dá)及LncRNA FEZF1-AS1表達(dá)水平升高，miR-200c-3p表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC組比較，TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1組細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力下降，LncRNA FEZF1-AS1表達(dá)及α-SMA、CollagenⅠ、Vimentin蛋白表達(dá)水平降低，miR-200c-3p表達(dá)水平升高（P＜0.05）；FEZF1-AS1與miR-200c-3p基因序列上存在結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)論 LncRNA FEZF1-AS1通過(guò)抑制miR-200c-3p促進(jìn)特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展。

關(guān)鍵詞：特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化；肺成纖維細(xì)胞；肌成纖維細(xì)胞；FEZ家族鋅指1-反義RNA1；微小RNA-200c-3p

中圖分類號(hào)：R563.9文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.11958/20230719

The effect of lncRNA FEZF1-AS1 targeting regulation of miR-200c-3p on biological

behaviors of human lung fibroblasts

MAN Jun1， GAO Yanyan1， SONG Longfei2， GAO Fusheng1△

1 Department of Respiratory Medicine， 2 Department of Rehabilitation Medicine， Affiliated Hospital of Weifang Medical University， Weifang 261035， China

△Corresponding Author E-mail： gaofs888@163.com

Abstract： Objective To investigate the effect of FEZ family zinc finger 1-antisense RNA 1 （LncRNA FEZF1-AS1） targeting regulation of miR-200c-3p expression on biological behaviors of human lung fibroblasts （HLF）. Methods Transforming growth factor β1 （TGF-β1） was used to induce the transformation of HLF into myofibroblasts， which were divided into the Blank group and the model group （HLF+TGF-β1 group）. According to different transfection plasmid， cells were divided into the Blank group， the TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC group and the TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 group. The protein expressions of α-SMA， Collagen Ⅰ and Vimentin were detected by Western blot assay. The expressions of LncRNA FEZF1-AS1 and miR-200c-3p were detected by quantitative real-time PCR （qRT-PCR）.? Cell proliferation ability was detected by CCK-8 method， migration ability was detected by cell scratch experiment and invasion ability was detected by Transwell assay. The targeting relationship between FEZF1-AS1 and miR-200c-3p was detected by dual-luciferase reporter assay. Results Compared with the Blank group， protein expressions of α-SMA， Collagen Ⅰ， Vimentin and the expression of LncRNA FEZF1-AS1 were increased in the HLF+TGF-β1 group （P＜0.05）， and the expression of miR-200c-3p was decreased （P＜0.05）. Compared with the TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC group， cell proliferation， migration， invasion ability， LncRNA FEZF1-AS1 expression， protein expressions of α-SMA， Collagen Ⅰ and Vimentin were decreased in the TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 group （P＜0.05）， and the expression of miR-200c-3p was increased （P＜0.05）. There were binding sites between miR-200c-3p and FEZF1-AS1 gene sequence. Conclusion LncRNA FEZF1-AS1 promotes the formation and progression of idiopathic pulmonary interstitial fibrosis by inhibiting miR-200c-3p.

Key words： idiopathic pulmonary interstitial fibrosis；lung fibroblasts; myofibroblasts; FEZ family zinc finger 1-antisense RNA1；microRNA-200c-3p

特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化（IPF）是呼吸系統(tǒng)疑難疾病，肺泡上皮細(xì)胞反復(fù)損傷、異常修復(fù)和成纖維細(xì)胞激活是IPF病理過(guò)程的關(guān)鍵因素，其導(dǎo)致上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程被異常啟動(dòng)［1］。IPF患者確診后存活期僅為3年左右，5年生存率為30%～50%，吡非尼酮和尼達(dá)尼布可以緩解IPF的進(jìn)展，但目前尚無(wú)被廣泛接受的治療IPF方法［2-4］。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是一類長(zhǎng)度超過(guò)200 nt的非編碼RNA，參與生物體內(nèi)各種重要的生理過(guò)程［5］。FEZ家族鋅指1-反義RNA 1（LncRNA FEZF1-AS1）在肝癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤中過(guò)表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲過(guò)程，調(diào)控腫瘤細(xì)胞EMT［6］。miRNA參與多種生物學(xué)功能的調(diào)控，研究發(fā)現(xiàn)miR-200c-3p在肝纖維化、心肌梗死、腫瘤等疾病的發(fā)病機(jī)制中均發(fā)揮重要作用［7-8］。然而，LncRNA FEZF1-AS1在IPF中的表達(dá)情況及作用機(jī)制研究尚鮮見(jiàn)，且LncRNA FEZF1-AS1是否通過(guò)miR-200c-3p發(fā)揮作用尚不清楚。本研究分析了LncRNA FEZF1-AS1在IPF中的表達(dá)模式和生物學(xué)功能，探討IPF的發(fā)病機(jī)制，為尋找有價(jià)值的治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及培養(yǎng) 人肺成纖維細(xì)胞HLF購(gòu)自中國(guó)科學(xué)研究院昆明細(xì)胞庫(kù)（KCB 200695），HLF細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、0.1 g/L鏈霉素、100 U/mL青霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，以5%CO2、37 ℃飽和濕度環(huán)境下在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～2 d將細(xì)胞換液1次，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要試劑 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）（CA59，上海近岸生物科技有限公司）；胎牛血清［cat：10099141，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司］；DMEM/F12液體培養(yǎng)基（SH30023.01，思拓）；CCK-8檢測(cè)試劑盒（CK04，同仁化學(xué)研究所）；Transwell嵌套小室（3422，康寧公司）；TRIzol（H10318）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑盒（AQ131-01）均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒和Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR Starter Kit試劑盒（C10211-1）購(gòu)自蘇州銳博生物科技有限公司；Si LncRNA FEZF1-AS1轉(zhuǎn)染質(zhì)粒（siB160705032412）、Si LncRNA FEZF1-AS1 NC（對(duì)照）轉(zhuǎn)染質(zhì)粒（siN0000001-1-1）、miR-200c-3p引物序列（MQPS0000783-1-100）均購(gòu)自廣州市銳博生物科技有限公司；Lipo6000TM 轉(zhuǎn)染試劑（C0526-1.5ml）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、Ⅰ型膠原蛋白（CollagenⅠ）、波形蛋白（Vimentin）及GAPDH抗體均購(gòu)自Proteintech；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的二抗、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；螢光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自翌圣生物科技（上海）股份有限公司。

1.2.2 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱（XD-101，日本SANYO）；酶標(biāo)儀（MULTISKAN FC，美國(guó)Thermo）；離心機(jī)（centrifuge 5415R，Eppendorf）；電泳儀（EPS300，Tanon）；qRT-PCR儀（7500，ABI）；96微孔板發(fā)光檢測(cè)儀（GloMax，Promega）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞造模、轉(zhuǎn)染及分組 將10 mg/L TGF-β1采用DMEM/F12液體培養(yǎng)基稀釋500倍即形成質(zhì)量濃度為20 μg/L的TGF-β1，誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞，促使其異?；罨蚣〕衫w維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組（Blank組，HLF細(xì)胞不進(jìn)行任何處理）和造模組（HLF+TGF-β1組）。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HLF細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，每孔2×106個(gè)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)70%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，參照Lipofectamine6000TM試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，構(gòu)建Si LncRNA FEZF1-AS1轉(zhuǎn)染質(zhì)粒及對(duì)照質(zhì)粒，采用qRT-PCR法檢測(cè)LncRNA FEZF1-AS1的表達(dá)水平，從而檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展。

將轉(zhuǎn)染Si LncRNA FEZF1-AS1轉(zhuǎn)染質(zhì)粒及對(duì)照質(zhì)粒的HLF細(xì)胞加入20 μg/L TGF-β1，分為TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1組和TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC組，另設(shè)空白對(duì)照組（Blank組，HLF細(xì)胞不進(jìn)行任何處理），進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)觀察LncRNA FEZF1-AS1對(duì)細(xì)胞的影響。

1.3.2 Western blot檢測(cè)α-SMA、Collagen Ⅰ、Vimentin蛋白的表達(dá) 各組細(xì)胞采用裂解液裂解，裂解完成后，在4 ℃下12 000 r/min離心15 min，提取細(xì)胞蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液煮沸5 min，放于-80 ℃保存。SDS-PAGE分離后，采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)到PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST（封閉液）浸泡PVDF膜，室溫下?lián)u床封閉2 h，加入α-SMA、Collagen Ⅰ一抗（1∶1 000）、Vimentin一抗（1∶2 000），4 ℃孵育過(guò)夜，TBST充分洗滌PVDF膜后加入HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（1∶1 000），于37 ℃搖床孵育2 h。TBST再次洗滌后加入ECL顯影，Image J軟件進(jìn)行灰度值分析，GAPDH作為內(nèi)參蛋白，計(jì)算目的蛋白表達(dá)量。目的蛋白表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.3.3 qRT-PCR法檢測(cè)LncRNA FEZF1-AS1和miR-200c-3p表達(dá) 將細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，每孔2×105個(gè)細(xì)胞，采用TRIzol法提取總RNA，分別應(yīng)用FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒及miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明書(shū)操作將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)體系（20 μL）：上、下游引物各0.4 μL，2×Supermix 10 μL，PASSIVE DYE 0.4 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6.8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析，分別以GAPDH和U6作為內(nèi)參計(jì)算LncRNA FEZF1-AS1 mRNA和miR-200c-3p的表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物序列見(jiàn)表1。

1.3.4 CCK-8法檢測(cè)LncRNA FEZF1-AS1對(duì)細(xì)胞增殖的影響 HLF細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，胰酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為4×104個(gè)/mL，將100 μL的細(xì)胞懸液接種于96孔板中，加入20 μg/L TGF-β1，置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)0 h、24 h、48 h時(shí)每孔加入10 μL CCK-8溶液，再次置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定各個(gè)孔在450 nm波長(zhǎng)下的光密度（OD）值。

1.3.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LncRNA FEZF1-AS1對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響 HLF細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，按細(xì)胞密度2×105個(gè)/mL接種至6孔板，加入20 μg/L TGF-β1，細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿孔底后，用10 μL移液器吸頭垂直在細(xì)胞板上劃痕，充分洗去漂洗細(xì)胞，加入無(wú)血清的培養(yǎng)基，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞0 h、48 h的變化，拍照記錄劃痕面積。劃痕愈合率（%）=（0 h劃痕面積-48 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。

1.3.6 Transwell小室法檢測(cè)LncRNA FEZF1-AS1對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響 胰酶消化細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，將細(xì)胞接種于小室中，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/mL，每組細(xì)胞數(shù)為1×104個(gè)/孔。Transwell上室加入無(wú)血清培養(yǎng)基，下室加入含20 μg/L TGF-β1和10%血清的完全培養(yǎng)基，上室液每孔200 μL，下室液每孔800 μL。將上層小室放入下層小室，細(xì)胞計(jì)數(shù)后將細(xì)胞鋪在上層小室中。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，取出上室，用棉簽擦去上室底部膜表面的細(xì)胞，用PBS洗滌，然后將其置于800 μL甲醇中固定，10 min后采用吉姆薩染色液染細(xì)胞，去離子水進(jìn)行適度漂洗，去除浮色，最后熒光倒置顯微鏡計(jì)數(shù)、拍照。

1.3.7 雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證FEZF1-AS1與miR-200c-3p的靶向作用關(guān)系 將FEZF1-AS1基因插入到螢光素酶基因上游，構(gòu)建FEZF1-AS1-WT（野生型）、FEZF1-AS1-Mut（突變型）的雙螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒，采用NC mimic質(zhì)粒及miR-200c-3p mimic質(zhì)粒，與FEZF1-AS1-WT、FEZF1-AS1-Mut質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HLF細(xì)胞，最終得到FEZF1-AS1-WT+NC mimic組、FEZF1-AS1-WT+miR-200c-3p mimic組、FEZF1-AS1-Mut+NC mimic組、FEZF1-AS1-Mut+miR-200c-3p mimic組。轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，使用雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)各組細(xì)胞螢火蟲(chóng)和海腎熒光強(qiáng)度，以海腎熒光值作為內(nèi)參，計(jì)算各組細(xì)胞螢光素酶活性的比值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（[x] ±s）表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Blank組和HLF+TGF-β1組細(xì)胞α-SMA、Collagen Ⅰ、Vimentin蛋白表達(dá)水平 HLF+TGF-β1組細(xì)胞α-SMA、CollagenⅠ、Vimentin蛋白表達(dá)水平均高于Blank組（P＜0.05），見(jiàn)表2、圖1。

2.2 Blank組和HLF+TGF-β1組細(xì)胞LncRNA FEZF1-AS1、miR-200c-3p表達(dá) 與Blank組相比，HLF+TGF-β1組細(xì)胞LncRNA FEZF1-AS1表達(dá)水平升高（2.23±0.05 vs. 1.11±0.01，n=3，t=24.260，P＜0.05），miR-200c-3p表達(dá)水平降低（0.20±0.01 vs. 1.10±0.03，n=3，t=33.740，P＜0.05）。

2.3 Blank組、Si LncRNA FEZF1-AS1轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組和對(duì)照質(zhì)粒組LncRNA FEZF1-AS1的表達(dá)水平 與Blank組（1.00±0.05）和Si LncRNA FEZF1-AS1 NC組（1.01±0.10）相比，Si LncRNA FEZF1-AS1組（0.31±0.02）LncRNA FEZF1-AS1表達(dá)水平降低（n=3，F(xiàn)=36.360，P＜0.05）。

2.4 沉默LncRNA FEZF1-AS1表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Blank組相比，TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC組24、48 h細(xì)胞增殖能力升高（P＜0.05）；與TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC組相比，TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1組24、48 h細(xì)胞增殖能力降低（P＜0.05）；3組細(xì)胞0、24、48 h細(xì)胞增殖能力依次升高（P＜0.05），見(jiàn)表3。

2.5 沉默LncRNA FEZF1-AS1表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移的影響 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Blank組相比，TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC組細(xì)胞劃痕愈合率升高（P＜0.05）；與TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC組比較，TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1組細(xì)胞劃痕愈合率降低（P＜0.05），見(jiàn)表4、圖2。

2.6 沉默LncRNA FEZF1-AS1表達(dá)對(duì)細(xì)胞侵襲的影響 Transwell實(shí)驗(yàn)表明，與Blank組相比，TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC組細(xì)胞侵襲數(shù)升高（P＜0.05）；與TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC組相比，TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1組細(xì)胞侵襲數(shù)降低（P＜0.05），見(jiàn)表4、圖3。

2.7 沉默LncRNA FEZF1-AS1表達(dá)對(duì)肺間質(zhì)纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與Blank組相比，TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC組Vimentin、α-SMA、CollagenⅠ蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC組相比，TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1組Vimentin、α-SMA、CollagenⅠ蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），見(jiàn)圖4、表5。

2.8 沉默LncRNA FEZF1-AS1表達(dá)對(duì)miR-200c-3p表達(dá)的影響 與TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1 NC組比較，TGF-β1+Si LncRNA FEZF1-AS1組LncRNA FEZF1-AS1表達(dá)水平降低，miR-200c-3p表達(dá)水平升高（P＜0.05），見(jiàn)表6。

2.9 雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LncRNA FEZF1-AS1與miR-200c-3p的關(guān)系 采用RNAhybrid軟件預(yù)測(cè)LncRNA FEZF1-AS1與miR-200c-3p具有結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖5。FEZF1-AS1-WT+miR-200c-3p mimic組螢光素酶活性低于FEZF1-AS1-WT+NC mimic組（0.44±0.01 vs. 1.00±0.01，n=3，t=58.460，P＜0.05）；FEZF1-AS1-Mut+miR-200c-3p mimic組螢光素酶活性與FEZF1-AS1-Mut+NC mimic差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.95±0.03 vs. 1.00±0.05，n=3，t=1.415，P＞0.05）。

3 討論

IPF的病理過(guò)程與EMT激活和成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化等密切相關(guān)，成纖維細(xì)胞可分泌大量促纖維化因子以及膠原為代表的細(xì)胞外基質(zhì)，這些物質(zhì)可繼續(xù)作用于成纖維細(xì)胞，發(fā)揮正反饋?zhàn)饔茫?］。LncRNA參與染色體沉默、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活與干擾等過(guò)程，這些過(guò)程與人類疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［10］。目前研究發(fā)現(xiàn)LncRNA FEZF1-AS1在胰腺癌、結(jié)直腸癌、肺腺癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，且與患者不良預(yù)后相關(guān)［6，11］。作為一種癌基因，LncRNA FEZF1-AS1可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［12］。LncRNA FEZF1-AS1可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，且其在NSCLC中通過(guò)抑制E-cadherin表達(dá)及調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin通路增強(qiáng)EMT［13］。另有研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA FEZF1-AS1通過(guò)調(diào)控miR-25-3p/ITGB8軸促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞EMT［14］。在肝癌中LncRNA FEZF1-AS1可通過(guò)JAK2/STAT3信號(hào)通路促進(jìn)EMT，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［15］。然而，目前鮮見(jiàn)有關(guān)LncRNA FEZF1-AS1在IPF中作用的研究。本研究結(jié)果顯示，LncRNA FEZF1-AS1在肺間質(zhì)纖維化細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，提示LncRNA FEZF1-AS1可能與肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生有關(guān)；沉默肺間質(zhì)纖維化細(xì)胞中LncRNA FEZF1-AS1表達(dá)后，細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力降低，表明LncRNA FEZF1-AS1在肺間質(zhì)纖維化中發(fā)揮促纖維化基因的作用。

α-SMA是成纖維細(xì)胞表達(dá)的微絲蛋白，亦是肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化的標(biāo)志蛋白，故肺間質(zhì)纖維化中α-SMA蛋白表達(dá)水平顯著升高。CollagenⅠ為細(xì)胞外基質(zhì)主要成分之一，異常膠原沉積是肺間質(zhì)纖維化的重要特征，故IPF中CollagenⅠ蛋白表達(dá)水平顯著升高。Vimentin是間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，具有維持細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定，促進(jìn)細(xì)胞黏附、侵襲與轉(zhuǎn)移等作用。本研究結(jié)果顯示，肺間質(zhì)纖維化細(xì)胞中α-SMA、CollagenⅠ和Vimentin表達(dá)明顯升高，且沉默LncRNA FEZF1-AS1表達(dá)后，細(xì)胞α-SMA、CollagenⅠ、Vimentin表達(dá)水平降低，提示沉默LncRNA FEZF1-AS1表達(dá)后，肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可能受到抑制，進(jìn)而抑制了肺間質(zhì)纖維化細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。由此筆者推測(cè)，LncRNA FEZF1-AS1通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移、侵襲與肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)肺間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展。

miRNA可選擇性與mRNA結(jié)合，抑制mRNA翻譯或促進(jìn)mRNA降解，從而調(diào)控靶基因表達(dá)。有研究報(bào)道，miR-200c-3p通過(guò)逆轉(zhuǎn)肺成纖維細(xì)胞的纖維原活性及抑制肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞向肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而抑制肺間質(zhì)纖維化［16］。LncRNA通過(guò)海綿效應(yīng)調(diào)控miRNA表達(dá)來(lái)參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展。Lin等［17］研究表明，IPF中LncRNA Hoxaas3高表達(dá)可下調(diào)miR-450b-5p，上調(diào)Runx1表達(dá)，從而促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究結(jié)果顯示，miR-200c-3p在肺間質(zhì)纖維化細(xì)胞中表達(dá)水平降低，且LncRNA FEZF1-AS1與miR-200c-3p存在靶向關(guān)系，沉默LncRNA FEZF1-AS1后細(xì)胞中miR-200c-3p表達(dá)水平升高，提示LncRNA FEZF1-AS1基因可靶向抑制miR-200c-3p基因表達(dá)，促進(jìn)肺間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，LncRNA FEZF1-AS1基因通過(guò)靶向抑制miR-200c-3p促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲及向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)肺間質(zhì)纖維化。本研究?jī)H初步探討了LncRNA FEZF1-AS1基因調(diào)控miR-200c-3p對(duì)肺成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，該結(jié)論未在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證，后續(xù)研究將利用小鼠肺纖維化模型進(jìn)行臨床前分析。

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（2023-05-19收稿 2023-08-12修回）

（本文編輯 陳麗潔）