李秋葉，李國祥，韋繼雯，張容溶，梁光會

（云南省文山壯族苗族自治州食品藥品檢驗研究院，云南文山 663099）

中藥三七為五加科植物三七Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen 的干燥根和根莖［1］，具有活血化瘀、消腫止痛等功效，民間常用于治療跌打損傷，現(xiàn)代醫(yī)學常用其防治心腦血管疾?。?-3］。文山三七為地理標志產(chǎn)品［4］，近年來，隨著社會需求的增加，三七藥材種植區(qū)域已由道地產(chǎn)地文山壯族苗族自治州（簡稱文山州）擴展至鄰近的紅河哈尼族彝族自治州（簡稱紅河州）、曲靖市、昆明市、楚雄彝族自治州（簡稱楚雄州）等地，四川、貴州等地也開始引進栽培［5-6］。三七作為典型的陰生草本植物，分布區(qū)域狹窄，生長狀況易受地域、氣候、土壤等因素的影響。2020 年版《中國藥典（一部）》收載的以三七藥材為原料的提取物、成方制劑及單味制劑上百種。多項研究測定了不同產(chǎn)地三七藥材中皂苷、重金屬、營養(yǎng)成分等的含量［7-12］。水分、總灰分、酸不溶性灰分等指標可反映三七藥材在采收、加工、運輸、儲存、摻質(zhì)等方面的質(zhì)量控制水平。灰色關(guān)聯(lián)度分析法作為多因素的分析方法，可根據(jù)各批樣品的相對關(guān)聯(lián)度對藥材質(zhì)量排序［13-14］；熵權(quán)法可為灰色關(guān)聯(lián)度法中各指標的權(quán)重客觀賦值。本研究中以藥典【檢查】項水分、總灰分、酸不溶性灰分，【浸出物】項醇溶性浸出物，以及三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1含量和此3 種皂苷（合稱總皂苷）含量為檢測指標，采用熵權(quán)法計算各指標權(quán)重，結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)度分析法綜合評價不同地區(qū)三七藥材的質(zhì)量，以期為其質(zhì)量評價提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

U3000 型高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司），配有紫外吸收檢測器；MS205DU 型電子分析天平（德國Mettler Toledo 公司，精度為0.01 mg）；XMTD - 4000 型電熱恒溫水浴鍋（泰州市商華儀表有限公司）；DHG - 9101 - 2A 型電熱恒溫干燥箱（揚州市三發(fā)電子有限公司）；SX2-4-10 型箱式電阻爐（上海雷韻試驗儀器制造有限公司）。

1.2 試藥

三七皂苷R1對照品（批號為110745-201921，含量90.4%），人參皂苷Rg1對照品（批號為110703 -202034，含量93.4%），人參皂苷Rb1對照品（批號為110704-202028，含量93.1%），均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純，乙醇為分析純，水為超純水。三七藥材樣品共44批，均為3年生、摘除花薹后采挖的春三七栽培品，來源于云南省不同種植基地，經(jīng)我院閆倩玲主任中藥師鑒定為正品。樣品信息見表1。

表1 藥材樣品信息Tab.1 Information of medicinal material samples

2 方法與結(jié)果

2.1 藥典【檢查】項及【浸出物】項指標

取藥材樣品各適量，分別按2020 年版《中國藥典（四部）》通則項下0832 水分測定法、2302 灰分測定法、2201浸出物測定法進行檢測。結(jié)果見表2。水分、總灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物含量分別為5.13%～8.84%、2.11%～4.96%、0.10%～1.89%、20.18%～28.69%。

表2 藥材樣品各項指標含量測定結(jié)果（%，n=3）Tab.2 Results of content determination of various indicators in medicinal material samples（%，n=3）

2.2 含量測定

色譜條件：色譜柱為Waters SunFire C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）- 水（B），梯度洗脫（0～12 min 時20%A，12～60 min 時20%A →36%A）；流速為1.0 mL/min；檢測波長為203 nm；柱溫為25 ℃；進樣量為10 μL。

溶液制備：分別稱取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1對照品各適量，精密稱定，置同一容量瓶中，加75%甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度分別為0.101 3，0.410 7，0.421 3 mg/mL的混合對照品溶液。稱取藥材樣品粉末（過4 號篩）0.6 g，精密稱定，加75%甲醇50 mL，過夜，水浴加熱保持微沸2 h，放冷至室溫，用75%甲醇補足減失的質(zhì)量，室溫下4 000 r/min 離心10 min，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

方法學考察：按相關(guān)要求進行方法學考察。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與混合對照品溶液色譜相應位置有吸收峰，詳見圖1。以三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的質(zhì)量濃度（X，μg/ mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程分別為Y1=0.058 46X1-0.210 5（R2=0.999 9）、Y2=0.065 45X2-0.697 4（R2= 0.999 6）、Y3= 0.046 83X3+ 0.369 8（R2= 0.999 3）。結(jié)果表明，3 種成分質(zhì)量濃度分別在20.26～253.25 μg/mL、82.14～1 026.80 μg/mL、84.26～1 053.20 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗結(jié)果的RSD均小于2.0%，表明儀器精密度良好，供試品溶液在室溫放置24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定，方法重復性良好。平均加樣回收率分別為100.84%，99.53%，98.87%，RSD分別為0.59%，0.78%，1.02%（n=6）。

1. 三七皂苷R1 2. 人參皂苷Rg1 3. 人參皂苷Rb1A. 混合對照品溶液 B. 供試品溶液圖1 高效液相色譜圖1.Notoginsenoside R1 2.Ginsenoside Rg1 3.Ginsenoside Rb1A.Mixed reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

樣品含量測定：取藥材樣品各適量，按擬訂方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件項進樣測定，平行2次，記錄峰面積，按外標法計算樣品中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及總皂苷含量。結(jié)果分別為0.80%～1.58%、2.82%～5.20%、2.79%～5.00%、6.54%～11.44%，詳見表2。

2.3 數(shù)據(jù)分析

2.3.1 各地樣品含量比較

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學軟件對不同地區(qū)藥材樣品的3種皂苷及總皂苷含量進行單因素方差分析（見表3）。結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地藥材樣品的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1含量及總皂苷含量無顯著差異（P＞0.05），人參皂苷Rb1含量有顯著差異（P＜0.05）；不同地區(qū)藥材樣品的人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1含量及總皂苷含量排序均為文山州＞紅河州＞曲靖市＞昆明市＞楚雄州；但文山州藥材樣品的三七皂苷R1含量與其他地區(qū)相比較低。

表3 各地藥材樣品含量比較（±s，%）Tab.3 Comparison of content determination of relevant components in samples from different areas（X ± s，%）

表3 各地藥材樣品含量比較（±s，%）Tab.3 Comparison of content determination of relevant components in samples from different areas（X ± s，%）

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2.3.2 權(quán)重

采用熵權(quán)法計算權(quán)重。設(shè)有m個研究樣本，每個研究樣本的評價指標有n項，形成評價單元序列｛Xij｝。其中，i= 1，2，3，…，m；j= 1，2，3，…，n［15-17］（本研究中m=44，n=8；后文同）。

數(shù)據(jù)同向化處理：由于各指標量綱不一致，從三七藥材質(zhì)量評價角度分析，水分、總灰分、酸不溶性灰分屬低優(yōu)指標；其余指標屬高優(yōu)指標。分別按公式Y(jié)ij=［max（Xi）-Xij］/［max（Xi）-min（Xi）］或［Xij-min（Xi）］/［max（Xi）-min（Xi）］對2 種指標進行同向化處理［18］。其中，Yij為同向化處理后數(shù)據(jù)，Xij為第i個樣品第j個指標值。

各指標的信息熵：信息熵（Ej）是數(shù)據(jù)無序程度的度量，數(shù)據(jù)離散程度越高，熵值越小。按公式和計算各指標的Ej（若Pij=0，定義

各指標的權(quán)重：按公式Wi=（1-Ej）/（j-∑Ej）［19］計算各指標的權(quán)重（Wi），即灰色關(guān)聯(lián)度分析中各指標對應的分辨系數(shù)（ρ），見表4。結(jié)果顯示，高優(yōu)指標的權(quán)重均較大，低優(yōu)指標的權(quán)重均較小，提示皂苷及醇溶性浸出物對三七藥材質(zhì)量評價結(jié)果的影響較大。

表4 三七藥材各指標的信息熵及權(quán)重Tab.4 Information entropy and weight of various indicators of Notoginseng Radix et Rhizoma

2.3.3 相對關(guān)聯(lián)度計算

采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法計算相對關(guān)聯(lián)度。統(tǒng)一各評價指標，將低優(yōu)指標高優(yōu)化（即倒數(shù)轉(zhuǎn)換），再與其他指標形成評價單元序列｛Xik｝，其中，i= 1，2，3，…，m；k= 1，2，3，…，n。對數(shù)據(jù)｛Xik｝進行規(guī)格化處理后，計算各指標相對于最優(yōu)、最差參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)（ρ取值為Wi）及最優(yōu)、最差關(guān)聯(lián)度，獲得相對關(guān)聯(lián)度（ri），詳見表5 至表7［20-21］。結(jié)果44 批藥材樣品的相對關(guān)聯(lián)度為0.163 7～0.773 9，提示不同產(chǎn)地三七藥材質(zhì)量有差異。

表5 相對于最優(yōu)參考序列的藥材樣品關(guān)聯(lián)系數(shù)Tab.5 Relation coefficient of medicinal material samples relative to the optimal reference sequence

表7 各地藥材樣品關(guān)聯(lián)度Tab.7 Relation degree of medicinal material samples from different areas

2.3.4 樣品質(zhì)量排序及等級

以ri為樣品質(zhì)量綜合測評排序的依據(jù)，并與44 批三七藥材總皂苷含量比較，結(jié)果見表8?？傇碥蘸颗判蚺c綜合測評排序結(jié)果整體趨勢相近，但存在一定差異，尤其是W4，K2，K3，排序的絕對差值為14～16，提示除皂苷含量外，其他檢測指標對藥材樣品質(zhì)量也有影響，故僅以皂苷含量來評價三七藥材質(zhì)量有一定局限性。根據(jù)ri劃分等級（ri≥0.55，0.45 ≤ri＜0.55，0.35 ≤ri＜0.45，0.25 ≤ri＜0.35，ri＜0.25分別為Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級、Ⅴ級，其中Ⅰ級質(zhì)量最好）。結(jié)果Ⅰ級至Ⅴ級藥材樣品分別有11 批、14 批、8 批、8 批、3 批；紅河州藥材樣品5 種等級均有，文山州、昆明市和曲靖市均無Ⅴ級，楚雄州無Ⅰ級。

表8 各地藥材樣品質(zhì)量排序及等級Tab.8 Quality ranking and grading of medicinal material samples from different areas

3 討論

在檢測總灰分、酸不溶性灰分時，需對藥材樣品進行炭化，該過程需緩慢加熱，炭化溫度過高時，易使局部產(chǎn)生大量氣體，造成部分微粒及鉀、鈉、氯等元素散失，從而導致檢測結(jié)果偏低。

預試驗中考察了皂苷的提取溶劑，在其余條件相同的前提下，分別比較了50%，75%，100%甲醇提取的皂苷含量。結(jié)果顯示，75%甲醇為提取溶劑時，皂苷含量最高，故選擇75%甲醇。

熵權(quán)法是一種客觀賦權(quán)法，能避免人為因素帶來的偏差，所得權(quán)重系數(shù)可反映各指標對其質(zhì)量評價的權(quán)重。本研究中采用熵權(quán)法結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)度分析法，通過相對關(guān)聯(lián)度將三七藥材的8個檢測指標轉(zhuǎn)化為1個綜合指標，從而避免了僅以皂苷含量為評價指標的局限性。

文山州作為三七藥材的道地產(chǎn)區(qū)，連作障礙限制了其在本地區(qū)的發(fā)展，故被迫向臨近區(qū)域轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，云南其他產(chǎn)區(qū)的三七藥材均符合2020 年版《中國藥典（一部）》要求，可為發(fā)展多地區(qū)種植三七藥材提供參考。但由于各地區(qū)間地理環(huán)境、氣候等有差異，故后續(xù)需引入多糖、氨基酸、黃酮、多種稀有皂苷、重金屬、農(nóng)藥殘留等檢測指標，并結(jié)合多指標綜合評價模式，從而全面評價不同地區(qū)三七藥材的質(zhì)量。

綜上所述，本研究中所建立的質(zhì)量評價方法能客觀地評價不同產(chǎn)地三七藥材的質(zhì)量，可為其質(zhì)量研究提供參考。