蘇章軒，劉瀟瀟，張愷東，陸 佳

（廣東省藥品檢驗(yàn)所，廣東廣州 510180）

龍澤熊膽膠囊由龍膽、黃連、黃芩、防風(fēng)等17 味中藥材組成，有清熱散風(fēng)、止痛退翳功效，臨床用于治療風(fēng)熱或肝經(jīng)濕熱引起的目赤腫痛、羞明多淚［1］。龍澤熊膽膠囊現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載于2020 年版《中國(guó)藥典（一部）》，其中鑒別項(xiàng)目以當(dāng)歸、梔子、防風(fēng)、黃連為對(duì)照藥材，阿魏酸、梔子苷、鹽酸小檗堿、熊去氧膽酸為對(duì)照品進(jìn)行薄層色譜（TLC）鑒別，但在檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，防風(fēng)的TLC 鑒別方法存在色譜拖尾嚴(yán)重、專屬性不強(qiáng)等問(wèn)題，嚴(yán)重影響對(duì)樣品結(jié)果的判定。而在含量測(cè)定項(xiàng)中，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)龍膽苦苷的含量進(jìn)行測(cè)定，指標(biāo)偏少。鑒于防風(fēng)質(zhì)量控制方法專屬性不強(qiáng)，且藥材來(lái)源較混亂的現(xiàn)狀［2-5］，存在部分企業(yè)誤投少投的可能，本研究中對(duì)防風(fēng)特征性成分升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇進(jìn)行TLC鑒別及含量測(cè)定［6-10］，為進(jìn)一步完善和優(yōu)化制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC - 20AT 型高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司），含SPD-M20A型二極管陣列檢測(cè)器；KQ-300DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CP224S 型和CP225D 型電子天平（德國(guó)Sartorius 公司，精度均為0.01 mg）。

1.2 試藥

龍澤熊膽膠囊（20 批，廣東省藥品檢驗(yàn)所抽檢樣品，來(lái)自11個(gè)生產(chǎn)廠家，樣品信息見(jiàn)表1，其中，樣品1-9分別來(lái)自廠家a-I，樣品10-20均來(lái)自廠家k）；防風(fēng)對(duì)照藥材（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為120947 -201810）；升麻素對(duì)照品（批號(hào)為AF21092804，含量98.0%），5 -O- 甲基維斯阿米醇對(duì)照品（批號(hào)為AF20100511，含量98.0%），均購(gòu)于成都埃法生物科技有限公司；預(yù)制硅膠G 薄層板（德國(guó)Merck 公司，青島海洋化工廠分廠）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 鑒別

2.1.1 方法建立

稱取樣品內(nèi)容物2.5 g，加乙醇50 mL，加熱回流30 min，冷卻至室溫，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)影痹囈?0 mL 使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3 次（20，20，10 mL），合并正丁醇液，用正丁醇飽和的水20 mL洗滌，取正丁醇液蒸干，殘?jiān)右掖? mL 使溶解，加在中性氧化鋁柱上（100～200目，3 g，內(nèi)徑為1.0～1.5 cm），用乙醇100 mL 洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状?0 mL 使溶解，即得供試品溶液；取升麻素、5 -O- 甲基維斯阿米醇對(duì)照品各適量，加甲醇制成每1 mL 各含1 mg的單一對(duì)照品溶液；取防風(fēng)對(duì)照藥材0.5 g，加甲醇20 mL，超聲（功率300 W，頻率40 kHz）處理20 min，濾過(guò)，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，即得對(duì)照藥材溶液；按龍澤熊膽膠囊處方及工藝制備缺防風(fēng)的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。將硅膠G薄層板于105 ℃活化20 min，吸取上述溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯- 乙酸乙酯- 丙酮（2∶4∶3，V/V/V）為展開(kāi)劑，預(yù)飽和20 min，取出，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃加熱1 min，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜和對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置均顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。

2.1.2 耐用性考察

展開(kāi)溫度：取上述溶液各5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，保持相對(duì)濕度為65%，分別置4 ℃和25 ℃下展開(kāi)，按擬訂展開(kāi)方法操作，結(jié)果見(jiàn)圖1?？梢?jiàn)分離效果在2 種溫度下無(wú)明顯差異，表明本方法在不同溫度條件下適應(yīng)性均較好。

1 - 9. 供試品溶液（樣品1 - 9） 10. 對(duì)照藥材溶液 11. 升麻素對(duì)照品溶液 12.5 - O - 甲基維斯阿米醇對(duì)照品溶液13. 陰性對(duì)照品溶液A.25 ℃ B.4 ℃圖1 展開(kāi)溫度考察1 - 9.Test solution（samples 1 - 9） 10.Medicinal materials reference solution 11.Cimifugin reference solution 12.5 - O - methylvisamminol reference solution 13.Negative reference solutionA.25 ℃ B.4 ℃Fig.1 Investigation of temperature

展開(kāi)濕度：取上述溶液各5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，保持展開(kāi)溫度為25 ℃，分別在相對(duì)濕度32%和88%的展開(kāi)缸內(nèi)展開(kāi)（展開(kāi)缸內(nèi)提前用不同比例的硫酸- 水混合液調(diào)節(jié)相對(duì)濕度），按擬訂展開(kāi)方法操作，結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果相對(duì)濕度為88%時(shí)比移值較小，但并未影響分離與鑒別效果。

1 - 9. 供試品溶液（樣品1 - 9） 10. 對(duì)照藥材溶液 11. 升麻素對(duì)照品溶液 12.5 - O - 甲基維斯阿米醇對(duì)照品溶液13. 陰性對(duì)照品溶液A.32% B.88%圖2 展開(kāi)濕度考察1 - 9.Test solution（samples 1 - 9） 10.Medicinal materials reference solution 11.Cimifugin reference solution 12.5 - O - methylvisamminol reference solution 13.Negative reference solutionA.32% B.88%Fig.2 Investigation of humidity

硅膠G 薄層板：取上述溶液各5 μL，保持展開(kāi)溫度為25 ℃，相對(duì)濕度為65%，點(diǎn)于2 個(gè)廠家的硅膠G 薄層板上，按擬訂展開(kāi)方法操作，結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果2 個(gè)廠家的硅膠G薄層板的分離效果差異不大，故本方法對(duì)薄層板的品牌無(wú)特殊要求。

1 - 9. 供試品溶液（樣品1 - 9） 10. 對(duì)照藥材溶液 11. 升麻素對(duì)照品溶液 12.5 - O - 甲基維斯阿米醇對(duì)照品溶液13. 陰性對(duì)照品溶液A. 德國(guó)Merck公司 B. 青島海洋化工廠分廠圖3 不同硅膠G薄層板考察1 - 9.Test solution（samples 1 - 9） 10.Medicinal materials reference solution 11.Cimifugin reference solution 12.5 - O - methylvisamminol reference solution 13.Negative reference solutionA.Merck Company from Germany B.Qingdao Ocean Chemical Plant BranchFig.3 Investigation of different silica gel G plates for TLC

2.1.3 鑒別

按擬訂的TLC 方法，對(duì)k 廠生產(chǎn)的11 批樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果未檢出防風(fēng)的特征斑點(diǎn)，詳見(jiàn)圖4。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Wondasil C18柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）- 水（B），梯度洗脫（0～25 min 時(shí)5%A →20%A，25～30 min時(shí)20%A →25%A，30～50 min時(shí)25%A →40%A，50～51 min 時(shí)40%A →90%A，51～70 min 時(shí)90%A，70～71 min 時(shí)90%A →5%A，71～85 min時(shí)5%A）；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.2 溶液制備

分別稱取升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇對(duì)照品各適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含升麻素50 μg、5 -O- 甲基維斯阿米醇25 μg 的混合對(duì)照品溶液。按2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.2.2 項(xiàng)下3 種溶液各適量，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果陰性對(duì)照無(wú)干擾，表明方法專屬性良好。詳見(jiàn)圖5。

線性關(guān)系考察：取升麻素對(duì)照品0.0104 1 g、5-O-甲基維斯阿米醇對(duì)照品0.010 18 g，精密稱定，加甲醇制得每1 mL 分別含1 020 μg和998 μg的單一對(duì)照品貯備液，分別精密吸取2，1 mL，加甲醇制成每1 mL含升麻素102 μg、5-O-甲基維斯阿米醇50 μg的系列混合對(duì)照品貯備液，分別精密吸取0.5，1，2，5，8，10 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，制成系列混合對(duì)照品溶液。按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以待測(cè)成分進(jìn)樣量（X，ng）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y1= 3 782 748.389X1+4 207.351（R2= 1.000），Y2= 3 178 861.258X2+1 202.569（R2=1.000）。結(jié)果表明，升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇進(jìn)樣量分別在0.051～1.020 μg 和0.025～0.499 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測(cè)限與定量限考察：取2.2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，逐級(jí)稀釋，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比（S/N）為3.0和10.0時(shí)待測(cè)成分的質(zhì)量濃度分別為檢測(cè)限和定量限。結(jié)果升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇的檢測(cè)限均為0.1 μg/mL，定量限均為0.3 μg/mL。

精密度試驗(yàn)：取“線性關(guān)系考察”項(xiàng)下系列混合對(duì)照品貯備液適量，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇峰面積的RSD分別為1.12%和1.20%（n= 6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)2）適量，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，1，3，6，10，12，24 h 時(shí)按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果升麻素和5 -O- 甲基維斯阿米醇峰面積的RSD分別為1.21%和0.96%（n= 7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)2）適量，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6份，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇含量的RSD分別為0.42%和1.24%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)2）內(nèi)容物2.5 g，精密稱定，各6 份，加入系列混合對(duì)照品貯備液1 mL（每1 mL含升麻素102 μg、5-O-甲基維斯阿米醇50 μg），按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n = 6）

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取樣品各適量，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行3 次，記錄峰面積。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（μg/g，n=3）Tab.3 Results of content determination of cimifugin and 5 - O -methylvisamminol in samples（μg / g，n = 3）

3 討論

龍澤熊膽膠囊現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中防風(fēng)的TLC 鑒別方法分離效果差，并缺乏對(duì)防風(fēng)的定量控制。鑒于此，本研究中優(yōu)化了現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中防風(fēng)的TLC鑒別方法［11］，并對(duì)不同展開(kāi)溫度、相對(duì)濕度、硅膠G薄層板進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本研究中建立的方法適用性較好，且均對(duì)結(jié)果無(wú)干擾。同時(shí)，針對(duì)該復(fù)方中升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇的定量分析填補(bǔ)了制劑中防風(fēng)含量測(cè)定的空白［12-13］。

采用本研究中所建立的方法對(duì)樣品進(jìn)行含量測(cè)定時(shí)，發(fā)現(xiàn)升麻素和5 -O- 甲基維斯阿米醇僅在廠家k樣品中未檢出，故對(duì)該廠家樣品存疑，其有效物質(zhì)成分的顯著差異可能對(duì)該藥品的有效性、安全性及臨床療效有較大影響。其原因可能為：1）生產(chǎn)企業(yè)為降低成本未按處方投料或少投料［14］；2）防風(fēng)的地方習(xí)用品及栽培品較多，如水防風(fēng)［15］、陜防風(fēng)、川防風(fēng)等，生產(chǎn)企業(yè)使用其他防風(fēng)摻偽投料，或生產(chǎn)企業(yè)藥材鑒定水平較低，存在誤買(mǎi)誤用情況；3）原標(biāo)準(zhǔn)TLC 圖譜存在拖尾現(xiàn)象，導(dǎo)致企業(yè)誤判。

綜上所述，本研究中所建立的方法專屬性強(qiáng)，耐用性、重復(fù)性好，可發(fā)現(xiàn)該品種防風(fēng)少投料誤投料等問(wèn)題，能有效控制龍澤熊膽膠囊的質(zhì)量。