洪 穎，翁鷺娜，林麗花，蓋雅婷

（福建省廈門市食品藥品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建廈門 361000）

乳腺癌為女性最常見的惡性腫瘤，68%～78%的患者表達(dá)雌激素受體（ER）和/ 或孕激素受體（PR）［1］。氟維司群屬雌激素受體拮抗劑［2］，其通過(guò)直接與ER 結(jié)合來(lái)抵消雌激素的作用［3］，對(duì)Luminal 亞型的療效確切，可直接用于導(dǎo)管內(nèi)注射，給藥頻率相對(duì)較低，從而提高了患者的治療依從性［4］。鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)多在水中進(jìn)行，氟維司群為油注射液，在水中不溶，不宜直接作為樣品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。鑒于氟維司群注射液尚未被各國(guó)藥典收載，本研究中采用加水萃取的前處理方法，考察水相干擾試驗(yàn)、加水萃取過(guò)程中油溶液的內(nèi)毒素回收比，采用凝膠法、動(dòng)態(tài)顯色法、動(dòng)態(tài)濁度法等檢查細(xì)菌內(nèi)毒素，為該產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BET-48G 型細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀（天津天大天發(fā)科技有限公司）；Research plus 型微量移液器（德國(guó)Eppendorf公司，移液范圍50～1 000 μL）；M3 basic 型渦旋混合器（德國(guó)IKA公司）；3-15 Operating Manual型高速離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）。

1.2 試藥

氟維司群注射液（某公司，共3 批，批號(hào)分別以A，B，C 指代，規(guī)格為每支5 mL∶250 mg）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE，湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)為2205050，規(guī)格為每支10 EU）；鱟試劑1，2（TAL1，TAL2，湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)分別為2203160，2202230，靈敏度分別為0.125 EU/ mL 和0.005～50 EU/ mL）；鱟試劑3（TAL3，福州新北生化工業(yè)有限公司，批號(hào)為21101012，靈敏度為0.125 EU/ mL）；鱟試劑4（TAL4，廈門鱟試劑生物科技股份有限公司，批號(hào)為22034102，靈敏度為0.005～10 EU/ mL）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET用水，湛江安度斯生物有限公司、福州新北生化工業(yè)有限公司，批號(hào)分別為2105260，21070105，規(guī)格均為每支5 mL）。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）的確定

計(jì)算公式為L(zhǎng)=K/M。其中，K為人每千克體質(zhì)量每小時(shí)最大可接受內(nèi)毒素劑量，M為人用每千克體質(zhì)量每小時(shí)的最大供試品劑量。根據(jù)藥品說(shuō)明書，本品的每日最大劑量為500 mg，按第43 版美國(guó)藥典（2020 年），M= 500 mg / 1.8 m2= 277.78 mg / m2，L=K/M=100（EU·m2）/ 277.78（mg/ m2）= 0.36 EU/ mg；按2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則1143（以下簡(jiǎn)稱通則1143）［5］，K= 5 EU/（kg·h），體質(zhì)量按60 kg 計(jì)算，注射時(shí)間＜1 h（按1 h計(jì)），計(jì)算得M=8.33 mg/（kg·h），L=0.60 EU/mg。從嚴(yán)要求，將L定為0.36 EU/mg。

測(cè)定樣品中的內(nèi)毒素，需將其與水充分渦旋混勻后，測(cè)定水相中內(nèi)毒素的含量。水萃取條件：取氟維司群注射液0.5 mL，加BET 用水5 mL，2 000 r/ min 振蕩5 min，3 000 r/min 離心5 min，取上層水相溶液進(jìn)行檢測(cè)。水相溶液的內(nèi)毒素限值（Lc）與氟維司群注射液的內(nèi)毒素限值（L）存在以下關(guān)系：Lc水×V水=L油×V油×內(nèi)毒素回收比（%），假設(shè)回收比為100%，則Lc水=L油×V油/V水=1.8 EU/mL。

2.2 凝膠法試驗(yàn)

2.2.1 靈敏度復(fù)核

依據(jù)通則1143 對(duì)所用鱟試劑進(jìn)行復(fù)核，結(jié)果TAL1與TAL3的靈敏度（λc）分別為λ和1.68λ，在0.5λ～2λ范圍內(nèi)，符合規(guī)定。

2.2.2 水相干擾試驗(yàn)

干擾試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)：內(nèi)毒素檢查時(shí)的最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）=cL/λ，c為供試品溶液體積分?jǐn)?shù)（1.0 mL/mL），λ為市售鱟試劑的標(biāo)示靈敏度（通常為0.03～0.5EU/mL），則水相對(duì)應(yīng)的MVD為3.6，7.2，14.4，28.8，57.6 倍。取3 批樣品，按2.1 項(xiàng)下方法水萃取后用BET 用水稀釋至2，4，8，16 倍系列溶液，記為供試品陰性對(duì)照（NPC）。同時(shí)制備相同稀釋倍數(shù)含0.25 EU/mL內(nèi)毒素系列溶液，記為供試品陽(yáng)性對(duì)照（PPC）。取TAL1 與TAL3，分別與上述NPC 和PPC 系列溶液反應(yīng)，每一濃度平行2 支，同時(shí)做陽(yáng)性對(duì)照（PC）和陰性對(duì)照（NC）。結(jié)果顯示，水相稀釋至2倍及以上對(duì)鱟試劑無(wú)干擾，可以該濃度進(jìn)行正式干擾試驗(yàn)。詳見表1（+為陽(yáng)性反應(yīng)，-為陰性反應(yīng)；表2同）。

表1 氟維司群凝膠法水相干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of interference pre - test of aqueous phase for fulvestrant by gel - clot method

表2 氟維司群凝膠法水相干擾正式試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of interference test of aqueous phase for fulvestrant by gel - clot method

正式干擾試驗(yàn)：取3 批樣品0.5 mL，按2.1 項(xiàng)下方法水萃取后，取水相，用BET用水倍比稀釋至2倍，加入CSE，制備含0.25，0.125，0.06，0.03 EU/mL 內(nèi)毒素的供試品溶液，每一濃度平行4 支，同時(shí)做內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液和NC，每一濃度平行做2 支。結(jié)果見表2。可見，水相稀釋至2倍對(duì)鱟試劑無(wú)干擾，即水相可稀釋至2倍進(jìn)行內(nèi)毒素檢查。

2.2.3 油相中內(nèi)毒素回收比試驗(yàn)

取CSE 3 支，分別加入3 批樣品各0.5 mL，渦旋混勻，按2.1 項(xiàng)下方法水萃取得水相，加BET 用水稀釋得8 倍、16 倍、32 倍、64 倍系列濃度，進(jìn)行內(nèi)毒素含量檢測(cè)，每一濃度平行4 支。加入CSE 的樣品溶液濃度為20 EU/mL，萃取入水相后水相中內(nèi)毒素含量為2 EU/mL，即16λ。取CSE 1支，加BET用水配制至2 EU/mL，再進(jìn)行8 倍（0.25 EU/ mL）、16 倍（0.125 EU/ mL）、32 倍（0.06 EU/mL）和64 倍（0.03 EU/mL）系列稀釋，每一濃度平行2 支，另做NC。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)品溶液系列結(jié)果符合鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)要求，各批次水相8 倍稀釋（理論值0.25 EU/mL）下與鱟試劑反應(yīng)均為陽(yáng)性，64 倍稀釋（理論值0.03 EU/mL）下與鱟試劑反應(yīng)均為陰性，內(nèi)毒素回收比范圍在50%～200%，符合要求。詳見表3。

表3 氟維司群凝膠法油相中內(nèi)毒素回收比試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of endotoxin recovery - ratio test in oily phase for fulvestrant by gel - clot method

2.2.4 凝膠限度試驗(yàn)

按通則1143 用TAL1 對(duì)3 批樣品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，按2.1 項(xiàng)下方法水萃取后，取水相加BET 用水稀釋2 倍后進(jìn)行檢查，NPC 結(jié)果均為陰性，PPC 結(jié)果均為陽(yáng)性，結(jié)果表明3 批樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)結(jié)果均符合規(guī)定。

2.3 動(dòng)態(tài)顯色法試驗(yàn)

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗(yàn)

按通則1143，制備濃度分別為2.0，0.5，0.125，0.031 25 EU/ mL 的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，各取0.1 mL，分別加入預(yù)先添加0.1 mL 鱟試劑（TAL2）的試管中，混勻，檢測(cè)，每個(gè)濃度平行3 支，另做2 支NC。工作波長(zhǎng)405 nm，預(yù)設(shè)吸光度0.05，結(jié)果見表4。以反應(yīng)時(shí)間（t）的對(duì)數(shù)（lg）值為橫坐標(biāo)、溶液中內(nèi)毒素濃度（C）的lg 值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程lgt1=2.493 55-0.389 09 lgC1（r= - 1.000）。|r| ＞0.98，NC 反應(yīng)時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)的反應(yīng)時(shí)間，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗(yàn)有效。

表4 動(dòng)態(tài)顯色法標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Tab.4 Results of reliability test of standard curve by kinetic chromogenic assay（n = 3）

2.3.2 水相干擾試驗(yàn)

取3 批樣品，按2.1 項(xiàng)下方法水萃取，水相用BET用水稀釋至2倍、4倍、8倍、16倍系列溶液，記為a液，同時(shí)制備同樣稀釋倍數(shù)的含0.5 EU/mL內(nèi)毒素的系列溶液，記為b液，進(jìn)行回收試驗(yàn)，分別取上述溶液各0.1 mL，加入預(yù)先添加0.1 mL鱟試劑的試管內(nèi)中，混勻，每個(gè)濃度平行2支，同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液管和NC管。測(cè)定結(jié)束后，按標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程分別計(jì)算a 液和b 液的細(xì)菌內(nèi)毒素含量，回收比按公式回收比=（Cb液-Ca液）/0.5×100%計(jì)算。結(jié)果見表5（其中a 液各溶液結(jié)果均小于檢測(cè)限，但儀器仍會(huì)有實(shí)測(cè)值，并根據(jù)實(shí)測(cè)值計(jì)算回收比）。表明各批次水相溶液的各稀釋倍數(shù)回收比均在50%～200%范圍內(nèi)，即水相在稀釋至2 倍及以上時(shí)對(duì)鱟試劑無(wú)干擾。

表5 動(dòng)態(tài)顯色法水相干擾試驗(yàn)結(jié)果（n=2）Tab.5 Results of interference test of aqueous phase by kinetic chromogenic assay（n = 2）

2.3.3 油相中內(nèi)毒素回收比試驗(yàn)

預(yù)添加CSE 的樣品制備同2.2.3 項(xiàng)下方法，按前法進(jìn)行水萃取。取水相，加BET 用水稀釋至8 倍、16 倍、32 倍、64 倍系列濃度，進(jìn)行內(nèi)毒素含量檢測(cè)，每個(gè)濃度平行2 支。水相中內(nèi)毒素含量理論值為2 EU/mL，原液內(nèi)毒素含量= 實(shí)測(cè)值× 稀釋倍數(shù)，絕對(duì)回收比= 原液內(nèi)毒素含量/（2 EU/mL）×100%。結(jié)果見表6。可見，樣品外加內(nèi)毒素20 EU/mL經(jīng)振蕩萃取后，用顯色法檢測(cè)內(nèi)毒素回收比在65.04%～98.02%范圍內(nèi)，均符合要求（在50%～200%范圍內(nèi)）。隨著稀釋倍數(shù)的增大，絕對(duì)回收比有下降趨勢(shì)。

表6 動(dòng)態(tài)顯色法油相中內(nèi)毒素回收比試驗(yàn)結(jié)果（n=2）Tab.6 Results of endotoxin recovery - ratio test in oily phase by kinetic chromogenic assay（n = 2）

2.4 動(dòng)態(tài)濁度法試驗(yàn)

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗(yàn)

按2.3.1 項(xiàng)下方法制備系列濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，各取0.1 mL，分別加入預(yù)先添加0.1 mL 鱟試劑（TAL4）的試管中，混勻，檢測(cè)，每個(gè)濃度平行3 支，另做2支NC。工作條件同2.3.1項(xiàng)，結(jié)果見表7。以lgt為橫坐標(biāo)、lgC為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程lgt2=2.501 16 - 0.373 4 lgC2（r= - 0.997），表明標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗(yàn)有效。

表7 動(dòng)態(tài)濁度法標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Tab.7 Results of reliability test of standard curve by kinetic turbidimetric assay（n = 3）

2.4.2 水相干擾試驗(yàn)

試驗(yàn)方法同2.3.2 項(xiàng)下，結(jié)果見表8。可見，各批次水相溶液的各稀釋倍數(shù)回收比均在50%～200%范圍內(nèi)，表明水相稀釋至2倍及以上時(shí)對(duì)鱟試劑無(wú)干擾。

表8 動(dòng)態(tài)濁度法水相干擾試驗(yàn)結(jié)果（n=2）Tab.8 Results of interference test of aqueous phase by kinetic turbidimetric assay（n = 2）

2.4.3 油相中內(nèi)毒素回收比試驗(yàn)

試驗(yàn)方法同2.3.3 項(xiàng)下，結(jié)果見表9?？梢?，樣品外加內(nèi)毒素20 EU/mL經(jīng)振蕩萃取后，用動(dòng)態(tài)濁度法檢測(cè)內(nèi)毒素絕對(duì)回收比在62.52%～113.64%范圍內(nèi)，均符合要求（在50%～200%范圍內(nèi)）。

表9 動(dòng)態(tài)濁度法油相中內(nèi)毒素回收比試驗(yàn)結(jié)果（n=2）Tab.9 Results of endotoxin recovery - ratio test in oily phase by kinetic turbidimetric assay（n = 2）

3 討論

細(xì)菌內(nèi)毒素與鱟試劑的系列酶促反應(yīng)需在水中進(jìn)行［6］，如待測(cè)樣品水溶性差，則需進(jìn)行前處理后再進(jìn)行檢測(cè)［7-9］。氟維司群注射劑為油注射劑，如直接用水稀釋進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)，存在稀釋濃度不準(zhǔn)確、內(nèi)毒素被油包裹釋放不完全等問題，很可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。因此，找到該類制劑合適的前處理方法是進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的必要前提。前期探索研究時(shí)曾參考原料藥的處理方法［10］，采用二甲基亞砜、甲醇等有機(jī)溶劑溶解注射液后，再用BET 用水稀釋進(jìn)行檢查，但出現(xiàn)溶劑對(duì)鱟試劑有干擾、內(nèi)毒素絕對(duì)回收比無(wú)法達(dá)到要求等問題。

對(duì)于油溶液，萃取亦是常用的前處理方法，由于內(nèi)毒素溶于水，首先考慮用水作為溶劑進(jìn)行萃取，在進(jìn)行干擾試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)考慮以下兩點(diǎn)。一是萃取后的水相可見些許渾濁，提示油相中有部分輔料和藥物可能溶解于水中，應(yīng)驗(yàn)證水相溶液對(duì)鱟試劑與內(nèi)毒素的凝集反應(yīng)是否有干擾作用［11-12］。二是對(duì)于需前處理的樣品，為確保所選擇的處理方法能有效地排除干擾且不會(huì)使內(nèi)毒素失去活性，要考察萃取后油液中內(nèi)毒素的絕對(duì)回收比［13］，即要使用預(yù)先添加了標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素再經(jīng)過(guò)處理的供試品溶液進(jìn)行干擾試驗(yàn)或檢測(cè)，絕對(duì)回收比應(yīng)在50%～200%范圍內(nèi)。

凝膠法為我國(guó)目前內(nèi)毒素檢測(cè)的“仲裁法”，檢驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，在日常檢驗(yàn)中采用較多，但凝膠法僅可定性檢測(cè)內(nèi)毒素含量是否超過(guò)限值，無(wú)法準(zhǔn)確定量。動(dòng)態(tài)光度測(cè)定法能得到較確切的數(shù)值，在檢驗(yàn)、生產(chǎn)質(zhì)量控制中應(yīng)用較廣泛［14］。本研究中分別采用凝膠法、動(dòng)態(tài)顯色法、動(dòng)態(tài)濁度法等對(duì)萃取后的水相溶液進(jìn)行干擾試驗(yàn)，確認(rèn)水相溶液稀釋至2倍及以上時(shí)，在各方法下對(duì)鱟試劑反應(yīng)均無(wú)干擾，且油液中內(nèi)毒素絕對(duì)回收比滿足要求。表明本研究采用的前處理方法操作簡(jiǎn)便、水相干擾小，適用于目前常用的3種細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法，能較準(zhǔn)確地檢測(cè)氟維司群注射液中內(nèi)毒素的含量。

綜上所述，氟維司群注射液采用凝膠法、動(dòng)態(tài)顯色法、動(dòng)態(tài)濁度法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查均可行，擬訂的檢查方法為取樣品0.5 mL，加入BET用水5 mL，2 000 r/min振蕩5 min，3 000 r/min離心5 min，取水相，按2020年版《中國(guó)藥典（四部）》通則1143 檢查，每1 mg 氟維司群中內(nèi)毒素含量應(yīng)小于0.36 EU。