崔夢(mèng)茹，趙翡翠，聶繼紅，張海英，趙生俊△

（1. 新疆醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830000； 2. 新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆烏魯木齊 830000； 3. 新疆中藥炮制研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊 830000）

快速型心律失?？蓪?dǎo)致心排血量驟減甚至出現(xiàn)循環(huán)中斷，繼而發(fā)生重要器官缺血缺氧，臨床表現(xiàn)為心源性休克、心絞痛。其中，持續(xù)性室性快型性心律失常和心房顫動(dòng)（簡(jiǎn)稱房顫）伴快速心室率可導(dǎo)致血流動(dòng)力學(xué)惡化，需緊急治療［1］。目前，臨床常用的抗心律失常藥物有鈉離子通道阻滯劑、β 腎上腺素能受體阻滯劑、延長(zhǎng)動(dòng)作電位間期藥物和鈣離子通道阻滯劑。多數(shù)抗心律失常藥物有致心律失常、損害心功能及心外臟器的副作用［2］。藥用植物中存在許多具有顯著藥理活性的天然成分，在抑制心律失常方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)［3］。白喉烏頭收載于《哈薩克藥志》［4］等文獻(xiàn)，為毛茛科烏頭屬的多年生草本植物，主要分布于甘肅、新疆及東北地區(qū)。該藥材根部供藥用，其性大熱，味辛、苦，有毒，有祛風(fēng)散寒、消腫止痛、通經(jīng)活絡(luò)之功，多用于風(fēng)寒濕痹等疾病的治療。白喉烏頭主要成分高烏甲素還具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗心律失常、抗腫瘤等作用［5-7］。高烏甲素及其水解產(chǎn)物刺烏寧在相應(yīng)的有效劑量范圍內(nèi)，室性期前收縮（又稱室性早搏）潛伏期、室性心動(dòng)過(guò)速（簡(jiǎn)稱室速）發(fā)生率、心律失常完全抑制率等與其呈劑量相關(guān)性［8-9］。白喉烏頭生品毒性較大，可通過(guò)炮制降低毒性，其中以藥典法和哈薩克族炮制法炮制品的毒性較小，前期研究表明，哈薩克族炮制法對(duì)白喉烏頭具有較好的減毒增效作用［10-11］。為此，本研究中基于快速型心律失常大鼠模型優(yōu)選白喉烏頭哈薩克族炮制法炮制品?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：BL-420S型生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；FA2004N 型精密電子天平（上海菁海儀器有限公司，精度0.1 mg）；xMarkTM型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；E200型生物顯微鏡（日本Nikon公司）。

試藥：烏頭堿對(duì)照品（成都曼思特科技有限公司，批號(hào)為A0196，含量≥98%）；注射用胺碘酮（法國(guó)Sanofi - Aventis 公司，批號(hào)為DA019）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、肌酸激酶同工酶MB（CK -MB）、心肌肌鈣蛋白I（cTnI）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）及三磷酸腺苷（ATP）酶檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為A001-3-2，A003-1-2，A016-2-2，H197，H197）；免疫組化染色孵育盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，批號(hào)為BOX-1001）。白喉烏頭，采自新疆伊犁哈薩克自治州尼勒克縣，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院李永和主任中藥師鑒定為正品。

動(dòng)物：Wistar 大鼠96 只，4～6 周齡，雌雄各半，體質(zhì)量（180±20）g，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（新）2018-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（新）2018 - 0003。飼養(yǎng)環(huán)境溫度（23±3）℃，相對(duì)濕度40%～70%。

1.2 方法

1.2.1 藥液制備

白喉烏頭炮制品：采用哈薩克族炮制法炮制。分別稱取500 g 白喉烏頭生品8 份，分為2 組；第1 組每份加10倍量水浸泡24 h后，加入8%甘草和10%黑豆與其共同煎煮1，2，3，4 h，分別命名為24 h - 1 h 組、24 h -2 h 組、24 h-3 h 組、24 h-4 h 組。第2 組每份僅浸泡時(shí)間縮短為12 h，其余條件不變，分別命名為12 h-1 h組、12 h-2 h 組、12 h-3 h 組、12 h-4 h 組。煎煮完成后取出切片，晾干，烘箱烘干備用。

白喉烏頭炮制品藥液：取白喉烏頭生品及8種炮制品各200 g，加8 倍量水浸泡0.5 h，加熱煮沸30 min，4層紗布重合平鋪過(guò)濾，濾渣加8倍量水煎煮，重復(fù)2次，合并3 次濾液，制成水煎液-95%乙醇（2.5∶1，V/V）成品，置4 ℃下80 h，2 000 r/min 離心12 min，取上清液，置65 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)，濃縮成300%的藥液。

1.2.2 建模、分組及給藥

將96 只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（等體積生理鹽水），模型組（等體積生理鹽水），白喉烏頭生品藥物組（簡(jiǎn)稱生藥組，0.4 g/kg），白喉烏頭炮制品8 個(gè)組（1.2 g/kg，分別記為12 h-1 h 組、12 h-2 h 組、12 h-3 h組、12 h-4 h組、24 h-1 h組、24 h-2 h組、24 h-3 h組、24 h - 4 h 組），胺碘酮組（5 mg/kg），各8 只。各組大鼠每天1次灌胃相應(yīng)藥物或生理鹽水，連續(xù)14 d后空白對(duì)照組大鼠尾靜脈注射等體積生理鹽水，其余各組大鼠均注射10 mg/mL烏頭堿（3.125 mg/kg）以復(fù)制快速型心律失常模型。

1.2.3 觀察指標(biāo)

心電圖（ECG）：末次給藥1 h 后，麻醉，仰臥固定大鼠，皮下插針，以生物信號(hào)采集系統(tǒng)記錄大鼠Ⅱ?qū)?lián)ECG，先記錄穩(wěn)定5 min 的ECG，動(dòng)態(tài)記錄大鼠ECG 20～30 min，記錄大鼠心律失常［早搏、室速、心室顫動(dòng)（室顫）］的持續(xù)時(shí)間，以及大鼠死亡時(shí)間（如未死亡，僅記錄為“未死亡”）。

心臟組織病理形態(tài)：取大鼠心臟組織，用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切5 μm厚片，用二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水后，蘇木素-伊紅（HE）復(fù)染，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

血清學(xué)指標(biāo)：取大鼠腹主動(dòng)脈血，4 ℃下，3 000 r/min離心15 min，收集上清液，采用ELISA 法檢測(cè)大鼠血清中的SOD，MDA，CK-MB，cTnI的水平。

心臟組織ATP酶：取大鼠心臟組織適量，勻漿，檢測(cè)Na+，K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶的活性。

心臟組織Cx45 蛋白表達(dá)：取“心臟組織病理形態(tài)”項(xiàng)下二甲苯脫蠟成品，梯度乙醇水化，抗原修復(fù)，去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，孵育（一抗、二抗分別稀釋1 000倍、2 000倍），染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 ECG

模型組大鼠均出現(xiàn)早搏、室顫、室速癥狀。12 h-1 h組、12 h-2 h 組、12 h-3 h 組、12 h-4 h 組、24 h-2 h 組、24 h - 3 h 組、24 h - 4 h 組、胺碘酮組大鼠均僅出現(xiàn)早搏及室速癥狀，但平均出現(xiàn)時(shí)間均顯著晚于模型組（P＜0.01）；24 h-1 h 組大鼠未出現(xiàn)室顫、室速和早搏癥狀。詳見表1。

表1 各組大鼠早搏、室速、室顫出現(xiàn)時(shí)間比較Tab.1 Comparison of the occurrence time of premature beats，ventricular tachycardia and ventricular fibrillation in each group

2.2 血清學(xué)指標(biāo)

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠的血清SOD 水平顯著降低，MDA，cTnI，CK - MB 水平均顯著升高；與模型組比較，生藥組、炮制品8個(gè)組、胺碘酮組大鼠的血清SOD水平均顯著升高，生藥組、12 h-1 h組、12 h-2 h組、24 h-1 h組大鼠的血清MDA水平均顯著降低（P＜0.05），各給藥組（除24 h-2 h 組、24 h-3 h 組外）cTnI 水平均顯著降低（P＜0.05），各給藥組（除24 h - 3 h 組外）大鼠血清CK-MB水平均顯著降低（P＜0.05）。詳見表2。

表2 各組大鼠血清學(xué)指標(biāo)比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of serological indicators in each group（X ± s，n = 6）

表2 各組大鼠血清學(xué)指標(biāo)比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of serological indicators in each group（X ± s，n = 6）

注：與空白對(duì)照組比較，#P ＜0.05。表3同。Note：Compared with those in the blank control group，#P ＜0.05（for Tab.2 - 3）.

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2.3 心臟組織ATP 酶

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠心臟組織的Na+，K+-ATP 酶及Ca2+-ATP 酶、Mg2+-ATP 酶活性均顯著減弱（P＜0.05）。與模型組比較，24 h-2 h 組、24 h-3 h 組、胺碘酮組大鼠心臟組織的Ca2+-ATP 酶活性均顯著增強(qiáng)（P＜0.05）。詳見表3。

表3 各組大鼠心臟組織ATP酶活性比較［±s，μmol/（mg·h），n=6］Tab.3 Comparison of ATPase activity in cardiac tissue in each group［X ± s，μmol /（mg·h），n = 6］

表3 各組大鼠心臟組織ATP酶活性比較［±s，μmol/（mg·h），n=6］Tab.3 Comparison of ATPase activity in cardiac tissue in each group［X ± s，μmol /（mg·h），n = 6］

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2.4 心臟組織病理形態(tài)

空白對(duì)照組大鼠的心肌纖維排列規(guī)則，心肌細(xì)胞形態(tài)正常，可見橫紋，細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)染色均勻，間質(zhì)緊密，未見明顯異常。模型組大鼠的心肌纖維排列紊亂，部分纖維斷裂，消失，心肌細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，可見較多核固縮，細(xì)胞質(zhì)紅染，間質(zhì)疏松，出血，可見炎性細(xì)胞散在或灶狀浸潤(rùn)。與模型組比較，生藥組大鼠的心肌細(xì)胞水腫，空泡變性，壞死區(qū)域增大，浸潤(rùn)炎性細(xì)胞數(shù)量增多，間質(zhì)疏松程度增加；炮制品8 個(gè)組大鼠的心肌纖維排列紊亂程度降低，心肌細(xì)胞水腫、損傷程度降低，損傷范圍縮小，浸潤(rùn)炎性細(xì)胞數(shù)量未明顯減少。詳見圖1。

A. 空白對(duì)照組 B. 模型組 C. 胺碘酮組 D. 生藥組 E - L. 炮制品8個(gè)組圖1 大鼠心臟組織病理形態(tài)（HE，×400）A.Blank control group B.Model group C.Amiodarone group D.Raw drug group E - L.Eight processed product groupsFig.1 Pathological morphology of cardiac tissue in rats（HE，× 400）

2.5 Cx45 蛋白表達(dá)

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠的Cx45 蛋白表達(dá)水平顯著降低；與模型組比較，胺碘酮組、炮制品8個(gè)組大鼠的Cx45 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；生藥組大鼠的Cx45 蛋白表達(dá)水平稍升高，但無(wú)顯著差異（P＞0.05）。詳見圖2。

3 討論

烏頭堿所誘導(dǎo)的心律失常動(dòng)物模型是經(jīng)典的藥理學(xué)建模方法［12］，烏頭堿激活心肌細(xì)胞Na+通道，使Na+內(nèi)流增加，從而影響心肌細(xì)胞線粒體功能、細(xì)胞膜離子通道、縫隙連接及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和氧化損傷等，誘發(fā)心律失常（如早搏、室速、室顫）。SOD 的主要功能是催化超氧陰離子的歧化反應(yīng)，被看作活性氧防御的第一線；MDA 是過(guò)氧化脂質(zhì)的一種重要的分解產(chǎn)物，兩者用作評(píng)價(jià)脂質(zhì)過(guò)氧化程度。心肌缺血后SOD 活性減弱，而MDA 含量增加，細(xì)胞受氧自由基攻擊的程度加重，且清除超氧陰離子的能力減弱，導(dǎo)致心肌細(xì)胞受損加劇。CK-MB 主要位于心肌組織中，心肌壞死后被釋放入外周血中，而cTnI 是心肌細(xì)胞死亡最敏感和最特異的標(biāo)志物，兩者均作為心肌損傷的標(biāo)志性診斷指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，白喉烏頭炮制品對(duì)烏頭堿所致心肌損傷有一定修復(fù)能力，并可提高心臟組織抗氧化損傷的能力。

心肌細(xì)胞幾乎全部依賴有氧代謝產(chǎn)生的ATP以供細(xì)胞生存及做功的需要，ATP的產(chǎn)生和儲(chǔ)存均在線粒體中進(jìn)行，線粒體中ATP 酶的活性在維持心肌細(xì)胞及胞內(nèi)鈣鎂的穩(wěn)態(tài)方面可發(fā)揮重要作用。心肌缺血缺氧時(shí)，線粒體中Mg2+含量減少，而Na+和Ca2+含量增多，可能引起能量代謝障礙，使依賴于ATP 的Na+，K+-ATP 酶及Ca2+，Mg2+-ATP 酶活性減弱，致使心肌能量代謝出現(xiàn)障礙［13-14］。本研究結(jié)果表明，白喉烏頭炮制品對(duì)烏頭堿所致心肌細(xì)胞能量代謝障礙有一定修復(fù)能力，可促進(jìn)能量代謝。

HE 染色主要用于觀察細(xì)胞內(nèi)部的形態(tài)結(jié)構(gòu)；顯微鏡下大體可觀察到心肌纖維的排列、心肌細(xì)胞的形態(tài)及細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)染色是否均勻，間質(zhì)是否緊密；借此可判定心肌損傷的程度。本研究結(jié)果可知，生藥組小鼠的心肌細(xì)胞水腫，空泡變性，壞死區(qū)域增大，表明生藥對(duì)心肌細(xì)胞毒性較大；炮制品8個(gè)組大鼠的心肌纖維排列紊亂程度降低，心肌細(xì)胞水腫、損傷程度降低，損傷范圍減小，表明白喉烏頭經(jīng)炮制后毒性降低，對(duì)烏頭堿所致心肌細(xì)胞損害有一定防護(hù)作用。

縫隙連接（GJ）是由連接相鄰2 個(gè)細(xì)胞之間的連接通道排列而成的一種特殊膜結(jié)構(gòu)，構(gòu)成縫隙連接的基本單位是連接蛋白Cx。研究顯示，在成年人心臟組織中Cx43 含量最豐富，主要存在于工作心肌細(xì)胞內(nèi)。Cx40 及Cx45 含量較少，Cx40 主要分布于心房及近端傳導(dǎo)系，Cx45 分布于整個(gè)傳導(dǎo)系統(tǒng)，是竇房結(jié)和房室結(jié)縫隙連接的主要成分。可見，心臟不同部位Cx 的表達(dá)和分布情況與其電傳導(dǎo)功能密切相關(guān)［15］。顯微鏡下觀察Cx45 的表達(dá)，可對(duì)比心肌損傷程度的差異［16］。本研究結(jié)果表明，白喉烏頭炮制品可修復(fù)烏頭堿所致心肌損傷。

綜上所述，哈薩克族炮制法制成的白喉烏頭炮制品對(duì)模型大鼠快速型心律失常均有一定預(yù)防作用，其中以24 h-1 h炮制品效果較顯著。