王 紅，蔣 征，劉 玲，付媛媛，崔永偉，瞿 城△

（1. 江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院南部院區(qū)·南京市溧水區(qū)中醫(yī)院藥學部，江蘇南京 211200； 2. 揚州大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院藥學部，江蘇南京 211200； 3. 南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇南京 210046）

缺血性腦卒中（CIS）常表現(xiàn)為平衡或協(xié)調(diào)能力的喪失、口眼喎斜、言語困難，甚至突然暈倒，意識障礙等［1］。由于溶栓時間窗及溶栓風險等原因，西醫(yī)治療存在一定局限。中醫(yī)稱CIS 為“中風”，認為瘀血存在于中風發(fā)生的各個時期，血虛血瘀是中風發(fā)病過程中的致病因素，現(xiàn)代中醫(yī)多從該角度來治療，如使用活血化瘀藥治療能取得良好效果［2-3］。丹參-當歸藥對為常見的活血化瘀類藥物，兩者一溫一涼，相使配伍，具有活血化瘀、益氣強心、通脈止痛功效，常用于治療血瘀血虛諸證，也是經(jīng)典復方活絡(luò)效靈丹的重要組方藥材［4］。現(xiàn)代藥理學研究表明，丹參主要含有丹酚酸類、丹參酮類成分，具有保護心腦血管系統(tǒng)、抗炎、抗氧化、清除自由基等藥理作用［5］；當歸中主要含有揮發(fā)油、有機酸類成分，能保護心腦血管、增強造血功能、提高免疫功能等藥理作用［6］。王燦等［7］研究發(fā)現(xiàn)，補虛藥（當歸）及活血化瘀藥（丹參）出現(xiàn)頻次較高；王佳楠［8］的研究發(fā)現(xiàn)，丹參、當歸為對腦卒中治療效果影響較大的核心藥物。但由于中藥成分和治療靶點的多樣性與復雜性，丹參-當歸治療CIS 的藥效物質(zhì)、生物過程及分子機制尚未明晰。網(wǎng)絡(luò)藥理學可通過構(gòu)建“藥物- 疾病- 靶點- 通路”網(wǎng)絡(luò)預測藥物治療疾病的作用機制［9］，符合中醫(yī)治病的整體觀念與辨證論治特點，與中藥多成分、多途徑、多靶點的作用機制相吻合。分子對接技術(shù)可為探究中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制提供可行的思路與方法［10］。因此，本研究中采用中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學，篩選丹參-當歸中的活性成分，預測治療CIS的作用靶點及信號通路，并以分子對接技術(shù)進行驗證，為治療CIS 的藥物研發(fā)和指導臨床用藥提供參考。

1 資料與方法

1.1 活性成分篩選和作用靶點預測

檢索中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php），設(shè)置口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18，獲取丹參和當歸的主要活性成分及作用靶點，并通過PubMed、中國知網(wǎng)等數(shù)據(jù)庫查詢文獻補充活性成分及其作用靶點，使用Swiss TargetPrediction 數(shù)據(jù)庫補充各活性成分的作用靶點。以Uniprot 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http：//ebi14.uniprot.org）對所有靶點信息進行標準化和去重。

1.2 CIS 疾病靶點的獲取

利用人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards，http：// www.genecards.org）、人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM，http：//www.omim.org）、DisGeNET（http：//www.Disgenet.org/）數(shù)據(jù)庫，以“Cerebral ischemic stroke/ CIS”或“cerebral infarction/ CI”為關(guān)鍵詞，檢索CIS 的潛在靶點。匯總各數(shù)據(jù)庫獲得的疾病靶點，去重后得到CIS疾病靶點。

1.3 共有靶點的獲取與蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將1.1項下篩選得到的活性成分作用靶點與1.2項下篩選的CIS 疾病靶點取交集，即得丹參- 當歸治療CIS 的共有靶點，并利用Venny 2.1.0 工具制作維恩圖。將共有靶點上傳至String 11.0 平臺，生物種類選定“homo sapiens”，選擇高度可信（high confidence）的互相作用閾值（設(shè)為0.9），默認其他設(shè)置，所得靶點通過Cytoscape 3.2.8進行可視化處理，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.4 疾病-藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

運用Cytoscape 3.8.2 軟件將獲得的數(shù)據(jù)進行可視化處理，構(gòu)建丹參-當歸治療CIS的疾病-藥物-活性成分-靶點的可視化網(wǎng)絡(luò)。在可視化網(wǎng)絡(luò)中，每個數(shù)據(jù)即為1 個節(jié)點，其度（Degree）值越高參與度越高，可信性越強。

1.5 富集分析

將共有靶點導入DAVID 數(shù)據(jù)庫，分別進行基因本體論（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。功能富集通過細胞成分（CC）、生物學過程（BP）、分子功能（MF）3 個維度來解釋和注釋基因，篩選條件為P＜0.01；根據(jù)通路富集結(jié)果獲得相應的P值，選擇P≤0.01 作為聚類標準，篩選排名前25 的通路。最后將丹參-當歸治療CIS 的核心靶點、核心靶點密切相關(guān)的活性成分及KEGG 富集得到的通路導入Cytoscape 3.8.2 軟件中，構(gòu)建活性成分- 核心靶點-通路網(wǎng)絡(luò)。

1.6 分子對接

采用AutoDock Tools 軟件對疾病- 藥物- 活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)中度值排名前6 的靶點蛋白和活性成分進行分子對接驗證。首先通過PubChem 數(shù)據(jù)庫和Chem-BioOffice 軟件獲得活性成分的3D 結(jié)構(gòu)，并將其保存為.mol2 格式；其次運用PDB（http：//www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫檢索核心靶點的3D 結(jié)構(gòu)，利用PyMOL 軟件去除水分子，分離得到的蛋白及配體經(jīng)Autodock 軟件處理保存為. pdbqt 格式；最后使用Autodock Vina 軟件進行分子對接。

2 結(jié)果

2.1 丹參-當歸藥對活性成分及作用靶點篩選

共檢索到活性成分82 個，其中丹參65 個、當歸17 個，詳見表1。丹參對應716 個靶點，當歸對應401 個靶點，去除重復靶點，得到潛在作用靶點787個。

表1 丹參-當歸的活性成分Tab.1 Active ingredients of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma - Angelicae Sinensis Radix

2.2 共有靶點篩選

檢索GeneCards 數(shù)據(jù)庫得CIS 疾病靶點752 個，OMIM 數(shù)據(jù)庫131 個，DisGeNET 數(shù)據(jù)庫10 個，去重后得671個，丹參-當歸治療CIS的共有靶點76個，詳見圖1。

圖1 丹參-當歸活性成分作用靶點與CIS潛在靶點維恩圖Fig.1 Venn diagram of targets of active ingredients in Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma - Angelicae Sinensis Radix and potential targets of CIS

2.3 疾病-藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

疾病-藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)見圖2（圖中，圓形代表藥物與疾病的共有靶點，其中紫色代表丹參與當歸共同作用的靶點；菱形代表活性成分）。該網(wǎng)絡(luò)由232個節(jié)點和1 016條邊組成，其中節(jié)點分別包括148個靶點、2 種藥物和82 種活性成分。以度值作為判別重要成分的指標，使用Cytoscape 中的Network Analyzer 工具分析網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)，關(guān)聯(lián)靶點數(shù)排名前6的活性成分為丹參醇B（丹參）、丹參新醌D（丹參）、木犀草素（丹參）、阿魏酸（當歸）、藁本內(nèi)酯（當歸）、丹參酮ⅡA（丹參）。

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點分析

共有111 個節(jié)點和544 條邊代表靶點間的相互作用關(guān)系，平均度值為4.99，PPI 網(wǎng)絡(luò)見圖3。根據(jù)度值將核心靶點進行排序，初步得到丹參-當歸治療CIS中發(fā)揮重要作用的前10 個靶點為MAPK14，MAPK1，AKT1，PTGS2，EGFR，JAK2，VEGFA，ITGB3，MAPK3，ESR1。

A. 三維圖 B. 二維圖圖3 丹參-當歸治療CIS的共有靶點PPI網(wǎng)絡(luò)A.Three - dimensional diagram B.Two - dimensional diagramFig.3 PPI network of common targets of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma - Angelicae Sinensis Radix in the treatment of CIS

2.5 富集分析

GO功能富集：共獲得2 545個條目。其中BP 2 244個，CC 128 個，MF 173 個；各選取排名前10 的條目進行可視化分析，結(jié)果見圖4。其中BP 主要涉及對脂多糖的反應，對細菌來源分子的反應，細胞對化學應激的反應，對氧氣水平的反應，化學突觸傳遞的調(diào)節(jié)等；靶點蛋白主要存在于膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、囊泡腔等CC 中；與內(nèi)肽酶、絲氨酸水解酶、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶、金屬離子跨膜轉(zhuǎn)運器、通路的活性及蛋白酶、磷酸酶、生長因子、酰胺的結(jié)合等MF關(guān)系密切。

圖4 丹參-當歸治療CIS的GO功能富集分析柱狀圖Fig.4 Histogram of GO functional enrichment analysis of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma - Angelicae Sinensis Radix in the treatment of CIS

KEGG 通路富集：共得到152條信號通路，根據(jù)P值按篩選前25 個通路制作氣泡圖，結(jié)果見圖5?？梢?，丹參-當歸藥對可能通過PI3K-Akt信號通路、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、鈣信號通路、Rap1 信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等發(fā)揮治療CIS 的作用。活性成分-核心靶點-通路網(wǎng)絡(luò)見圖6（圖中，菱形代表活性成分，平行四邊形代表作用靶點，其他節(jié)點代表信號通路）。丹參- 當歸藥對治療CIS 是多種活性成分作用于多個靶點并參與不同信號通路的結(jié)果。

圖5 丹參-當歸治療CIS的KEGG通路富集分析氣泡圖Fig.5 Bubble chart of KEGG pathway enrichment analysis of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma - Angelicae Sinensis Radix in the treatment of CIS

圖6 丹參-當歸治療CIS的活性成分-核心靶點-通路網(wǎng)絡(luò)Fig.6 Network of active ingredient - core target - pathway of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma - Angelicae Sinensis Radix in the treatment of CIS

2.6 分子對接

一般認為，受體和配體的結(jié)合能數(shù)值越小，兩者結(jié)合越牢固，化學性質(zhì)越穩(wěn)定。當結(jié)合能小于-5.0 kcal（-20.92 kJ/mol）時，兩者之間有較好的結(jié)合活性；當結(jié)合能小于-7.0 kcal（-29.29 kJ/mol）時，兩者之間有強烈的結(jié)合活性［11］。將度值排名前6 的核心靶點與關(guān)聯(lián)靶點數(shù)排名前6的活性成分進行分子對接，發(fā)現(xiàn)丹參-當歸藥對中的活性成分與對應的核心靶點均有較好的結(jié)合活性，詳見表2、圖7。

A.MAPK14 - 丹參酮ⅡA B.MAPK1 - 丹參醇B C.AKT1 - 藁本內(nèi)酯 D.PTGS2 - 木犀草素 E.EGFR - 丹參醇B F.JAK2 - 丹參酮ⅡA圖7 丹參-當歸治療CIS活性成分與核心靶點的分子對接模式圖A.MAPK14 - tanshinone ⅡA B.MAPK1 - tanshinol B C.AKT1 - ligustilide D.PTGS2 - luteolin E.EGFR - tanshinol B F.JAK2 - tanshinone ⅡAFig.7 Molecular docking between active ingredients and core targets of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma - Angelicae Sinensis Radix in the treatment of CIS

表2 丹參-當歸活性成分與核心靶點的分子對接信息Tab.2 Molecular docking between active ingredients and core targets of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma - Angelicae Sinensis Radix

3 討論

CIS 的病因病機較復雜，涉及神經(jīng)炎癥、能量衰竭、細胞凋亡及自噬等，且各環(huán)節(jié)相互影響，重疊發(fā)生，導致了疾病過程的復雜性。丹參、當歸為常見的活血化瘀藥材，是張錫純《醫(yī)學衷中參西錄》中活絡(luò)效靈丹的重要組成部分，具有活血化瘀、通絡(luò)止痛功效，可用于腦血栓形成、心絞痛等疾病的治療［12］。

本研究表明，按共有靶點統(tǒng)計，丹參醇B、丹參新醌D、木犀草素、阿魏酸、藁本內(nèi)酯、丹參酮ⅡA對應的靶點較多，考慮為丹參-當歸治療CIS的關(guān)鍵活性成分。其中，木犀草素具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等藥理作用，能抑制神經(jīng)細胞變性，減輕運動和感覺功能障礙。體外試驗表明，木犀草素能緩解小膠質(zhì)細胞激活引起的神經(jīng)細胞活力減弱，防止氧化應激引起的內(nèi)皮細胞損傷［13］。劉亞鷺等［14］在大腦中動脈栓塞模型大鼠中發(fā)現(xiàn)，阿魏酸在缺血前后、缺血再灌注等不同時間點均能減小梗死區(qū)面積，明顯下調(diào)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）、線粒體Bcl2關(guān)聯(lián)X蛋白（Bax）和半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）的表達，調(diào)控P38 MAPK/p90RSK/CREB/Bcl-2 信號通路，對抗腦神經(jīng)細胞凋亡。高娟等［15］發(fā)現(xiàn)，藁本內(nèi)酯可顯著改善卒中患者的神經(jīng)功能缺損，并促進卒中后神經(jīng)再生。吳倩等［16］通過建立氧糖剝奪/復糖復氧OGD/R損傷后HT22細胞模型發(fā)現(xiàn)，藁本內(nèi)酯逆轉(zhuǎn)了細胞模型內(nèi)活性氧（ROS）的釋放、鈣離子超載及線粒體膜電位的下降等。徐璇等［17］研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA可增強腦缺血模型大鼠磷酸酯酶與張力蛋白同源物（PTEN）的表達，抑制自噬通路PI3K/Akt/mTOR 的表達，起到保護腦組織的作用。丹參醇B和丹參新醌D同屬丹參中的二萜類化合物，但其藥理作用研究遠少于同類成分丹參酮ⅡA，缺少相應的文獻考證。

PPI網(wǎng)絡(luò)拓撲分析篩選出的核心靶點包括MAPK14，MAPK1，AKT1，PTGS2，EGFR，JAK2，VEGFA 等。其中，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號途徑普遍存在于生物體內(nèi)的大多數(shù)細胞中，與細胞的增殖、分化、存活、凋亡等生理過程密切相關(guān)，MAPK 的異常已被證實能導致多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。MAPK14 能控制炎癥進展，可阻止促炎細胞因子分泌，并控制抗氧化基因的表達［14，18］。MAPK1 又稱ERK2，ERK2 的磷酸化在神經(jīng)軸突和樹突狀細胞的生長和穩(wěn)定中起重要作用，腦缺血會導致ERK 的時間依賴性激活，而上游MEK 的抑制則會導致?lián)p傷區(qū)炎性細胞因子和細胞凋亡的顯著降低［19］。蛋白激酶B（AKT1）在調(diào)節(jié)代謝、促進血管生成，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞功能等方面發(fā)揮重要作用，能被多種上游細胞因子激活，從而對缺血性損傷后的神經(jīng)細胞發(fā)揮保護作用［20］。PTGS2 是能催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的類過氧化物酶，是重要的炎性介質(zhì)，參與炎癥初期到炎癥形成的全過程，PTGS2的過量表達可破壞內(nèi)環(huán)境平衡，參與腦損傷后的炎性反應，并促進腦梗死面積的擴大［21］。表皮生長因子受體（EGFR）屬酪氨酸家族激酶受體，EGFR 通過其細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域介導細胞對生長因子的反應。在大腦中動脈同側(cè)皮質(zhì)梗死區(qū)神經(jīng)細胞和巨噬細胞/小膠質(zhì)細胞亞群中，EGFR明顯上調(diào)，可能參與了缺血性和創(chuàng)傷性腦損傷后神經(jīng)細胞的可塑和修復機制［22］。血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）是血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）家族中神經(jīng)保護的重要生長因子，能促進腦缺血后的血管生成。CHEN等［23］發(fā)現(xiàn)，當VEGFA表達水平升高時，神經(jīng)干細胞、神經(jīng)細胞和星形膠質(zhì)細胞的數(shù)量也隨之增加。

GO 富集分析結(jié)果表明，關(guān)鍵靶點主要分布于膜筏、膜區(qū)、囊泡腔、質(zhì)膜外側(cè)，靶點中主要描述了內(nèi)肽酶、絲氨酸水解酶、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶等在分子水平上的活性。同時，主要靶點涉及了對脂多糖的反應、對細菌來源分子的反應、細胞對化學應激的反應、對氧氣水平的反應等多個生物學過程。在KEGG富集分析中，PI3K -Akt 信號通路與丹參- 當歸藥對治療CIS高度相關(guān)，其在抗神經(jīng)細胞凋亡、氧化應激、炎性反應及自噬中發(fā)揮重要作用［24］。如PI3K/Akt信號通路的激活可抑制NF - κB 引起的促炎因子的表達，抑制細胞介導的神經(jīng)炎癥，促進M1 型（促炎表型）小膠質(zhì)細胞向M2 型（抗炎表型）轉(zhuǎn)化，減輕炎性反應［25］；能發(fā)生一系列磷酸化級聯(lián)反應，延緩細胞凋亡；活化的Akt 可進一步激活氧化應激中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，阻止Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1與其耦聯(lián)，增加抗氧化蛋白的表達；通過激活PI3K/Akt信號通路的下游靶點mTOR，減少細胞的過度自噬與腦損傷的程度，保護缺血腦組織［26］。故丹參-當歸可能通過多種途徑調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路改善CIS的臨床癥狀，但仍需進一步驗證。

分子對接技術(shù)發(fā)現(xiàn)，篩選的6個活性成分與核心靶點MAPK14，MAPK1，AKT1，PTGS2，EGFR，JAK2 的結(jié)合能均小于- 5.0 kcal，表明其具有較好的結(jié)合活性。其中，丹參醇B 與EGFR、丹參新醌D 分別與MAPK14，PTGS2，JAK2，木犀草素分別與PTGS2，EGFR，藁本內(nèi)酯分別與MAPK14，AKT1，JAK2，丹參酮ⅡA分別與MAPK14，AKT1，PTGS2，EGFR，JAK2 的結(jié)合能均小于等于- 7.0 kcal，強于原始配體的結(jié)合活性，表明這些活性成分與其對應的靶點的結(jié)合活性強。

綜上所述，丹參- 當歸可能通過丹參醇B、丹參新醌D、木犀草素、阿魏酸、藁本內(nèi)酯、丹參酮ⅡA等活性成分，作用于MAPK14，MAPK1，AKT1，PTGS2，EGFR，JAK2 等關(guān)鍵靶點，繼而調(diào)節(jié)炎性反應、氧化應激、抗神經(jīng)細胞凋亡和自噬等生物學過程，調(diào)控PI3K/Akt 等主要的信號通路而發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用。