袁風(fēng)雷,張麗霞,李 民,李貴賓

1.華北醫(yī)療健康集團(tuán)峰峰總醫(yī)院麻醉科,河北邯鄲 056000;2.華北醫(yī)療健康集團(tuán)邯礦總醫(yī)院內(nèi)科,河北邯鄲 056000;3.邯鄲市第一醫(yī)院麻醉科,河北邯鄲 056000;4.華北醫(yī)療健康集團(tuán)峰峰總醫(yī)院普外科,河北邯鄲 056000

胃癌具有較高病死率,其發(fā)病率存在明顯的地區(qū)差異,治療方法有靶向藥物治療、手術(shù)切除、放療及化療[1]。癌細(xì)胞的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是胃癌患者術(shù)后死亡的重要原因[2]。即便胃癌患者進(jìn)行了腫瘤的完全切除,腫瘤組織中脫落的癌細(xì)胞也會(huì)進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng),從而誘發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[3-4]。胃癌患者術(shù)后通常需要進(jìn)行抗癌藥物治療,但抗癌藥物通常價(jià)格昂貴且有諸多不良反應(yīng),因此迫切需要開發(fā)新的經(jīng)濟(jì)且高效的治療藥物。羅哌卡因可用于神經(jīng)阻滯,能通過蛛網(wǎng)膜下腔注射、局部浸潤(rùn)、靜脈給藥等多種方式發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[5]。此外,有研究表明羅哌卡因還可能對(duì)某些腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生直接影響[6]。羅哌卡因可抑制人肝癌細(xì)胞的腫瘤生物學(xué)特性,使得癌細(xì)胞凋亡率增加[7]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)信號(hào)通路在細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中起重要作用,與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[8]。然而,目前關(guān)于羅哌卡因是否對(duì)胃癌細(xì)胞有影響及其作用機(jī)制尚不明確。本研究擬基于AMPK/Nrf2信號(hào)通路探討羅哌卡因?qū)ξ赴┘?xì)胞生物學(xué)行為的影響,為胃癌的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1材料來源 胃癌BGC-823細(xì)胞(批號(hào):W15985)購自宜昌易成生物科技有限公司。

1.2儀器與試劑

1.2.1主要儀器 荷蘭Biostream BCI-40型CO2培養(yǎng)箱、美國(guó)PerkinElmer Victor X型酶標(biāo)儀、美國(guó)BD Accuri C6型流式細(xì)胞儀、美國(guó)millipore PIRP12R48型Transwell小室均購自武漢貝蘭生物科技有限公司;澳大利亞Kewlab BM1650A型顯微鏡、美國(guó)ABI 7900型實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)儀、美國(guó)UVP GDS-8000型凝膠成像系統(tǒng)均購自南京北魚生物科技有限公司。

1.2.2主要試劑 羅哌卡因(原料藥,純度>99.9%,批號(hào)Y29185)、順鉑(原料藥,純度≥99.75%,批號(hào)Y70164)均購自廣州楊葉生物科技有限公司;胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、基質(zhì)膠、結(jié)晶紫染色液、膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測(cè)試劑盒、PCR試劑盒均購自岳陽嘉誠(chéng)生物科技有限公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑-8(CCK-8)、Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、蛋白裂解液、BCA試劑盒、ECL試劑均購自湘潭嘉葉源生物科技有限公司;兔源AMPK、Nrf2、GAPDH一抗、羊抗兔二抗均購自深圳振強(qiáng)生物技術(shù)有限公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)、分組及干預(yù) 將胃癌BGC-823細(xì)胞置于含有10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)的RPMI1640培養(yǎng)基,在5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),每天更換培養(yǎng)液,在細(xì)胞覆蓋率達(dá)到70%左右時(shí)使用胰蛋白酶消化、傳代。選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BGC-823細(xì)胞接種于96孔板上(5×104個(gè)/孔)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)分組包括對(duì)照組、順鉑組及羅哌卡因低、中、高水平組。對(duì)照組:常規(guī)培養(yǎng)BGC-823細(xì)胞;順鉑組:BGC-823細(xì)胞培養(yǎng)基中含有5 mg/L的順鉑[9];羅哌卡因低、中、高水平組:BGC-823細(xì)胞培養(yǎng)基分別含有25、50、100 mg/L的羅哌卡因[10]。上述每組設(shè)6個(gè)平行樣本。

1.3.2CCK-8檢測(cè)BGC-823細(xì)胞存活率 將BGC-823細(xì)胞以5×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板中,按1.2.1中的方法分組處理BGC-823細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)48 h,每孔加入10 μL CCK-8溶液,3 h后,讀取450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值,重復(fù)3次,通過A值計(jì)算BGC-823細(xì)胞的存活率。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(對(duì)照組A值-空白組A值)×100%。

1.3.3Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BGC-823細(xì)胞侵襲能力 按1.2.1中的方法分組處理BGC-823細(xì)胞,將基質(zhì)膠溶解后添加到每個(gè)Transwell小室的上室中,37 ℃下固化3 h后,隨即添加1×105個(gè)BGC-823細(xì)胞到上室,并在下室中添加RPMI1640培養(yǎng)基(500 μL),孵育48 h,4%多聚甲醛固定,0.1%結(jié)晶紫染色,隨機(jī)選取5個(gè)視野使用顯微鏡捕獲細(xì)胞圖像,計(jì)算BGC-823細(xì)胞侵襲數(shù)量,數(shù)量越多代表細(xì)胞侵襲能力越強(qiáng)。

1.3.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)BGC-823細(xì)胞凋亡率 按1.2.1中的方法分組處理BGC-823細(xì)胞,培養(yǎng)48 h,將BGC-823細(xì)胞重懸,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL,加入Annexin Ⅴ-FITC和PI各15 μL,避光孵育20 min,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3.5BGC-823細(xì)胞中AMPK、Nrf2信使RNA(mRNA)水平的測(cè)定 按1.2.1中的方法分組處理BGC-823細(xì)胞,培養(yǎng)48 h,使用Trizol試劑從BGC-8230細(xì)胞中提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以此為模板,qPCR法檢測(cè)BGC-823細(xì)胞中AMPK、Nrf2 mRNA水平,以U6為內(nèi)參,引物由南通市銀琪生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。反應(yīng)條件:93 ℃ 4 min,93 ℃ 26 s、44 ℃ 28 s、69 ℃ 31 s,共29個(gè)循環(huán),74 ℃,4 min。根據(jù)PCR檢測(cè)試劑盒說明書配制反應(yīng)體系。AMPK、Nrf2 mRNA水平的計(jì)算采用2-ΔΔCt法。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.6Western blot檢測(cè)BGC-823細(xì)胞中AMPK、Nrf2蛋白水平 按1.2.1中的方法分組處理BGC-823細(xì)胞,培養(yǎng)48 h,使用蛋白裂解液裂解細(xì)胞,用BCA試劑盒對(duì)各組細(xì)胞的總蛋白水平進(jìn)行定量檢測(cè),用凝膠電泳分離各組等量蛋白質(zhì)后轉(zhuǎn)膜,用脫脂牛奶配制的封閉液(質(zhì)量體積百分比為5%)在室溫下封閉1 h,加入稀釋好的兔源AMPK(1∶660)、Nrf2(1∶750)、GAPDH(1∶900)一抗,4 ℃下孵育過夜。加入羊抗兔二抗(1∶1 500),室溫下孵育1 h,ECL試劑顯色,Image J軟件分析蛋白條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參,計(jì)算AMPK、Nrf2蛋白水平。

2 結(jié) 果

2.1各組BGC-823細(xì)胞存活率、侵襲數(shù)量的比較 與對(duì)照組比較,順鉑組、羅哌卡因低、中、高水平組BGC-823細(xì)胞存活率、侵襲數(shù)量均下降(P<0.05);與順鉑組比較,羅哌卡因低、中、高水平組BGC-823細(xì)胞存活率、侵襲數(shù)量均增加(P<0.05);與羅哌卡因低水平組比較,羅哌卡因中、高水平組BGC-823細(xì)胞存活率、侵襲數(shù)目依次降低(P<0.05)。見表2、圖1。

圖1 各組BGC-823細(xì)胞侵襲圖(結(jié)晶紫染色,×200)

表2 各組BGC-823細(xì)胞存活率、侵襲數(shù)量的比較

2.2各組BGC-823細(xì)胞凋亡率比較 與對(duì)照組比較,順鉑組及羅哌卡因低、中、高水平組BGC-823細(xì)胞凋亡率均升高(P<0.05);與順鉑組比較,羅哌卡因低、中、高水平組BGC-823細(xì)胞凋亡率均下降(P<0.05);與羅哌卡因低水平組相比,羅哌卡因中、高水平組BGC-823細(xì)胞凋亡率依次升高(P<0.05)。見表3、圖2。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組BGC-823細(xì)胞凋亡

表3 各組BGC-823細(xì)胞凋亡率比較

2.3各組BGC-823細(xì)胞中AMPK、Nrf2 mRNA水平比較 與對(duì)照組比較,順鉑組、羅哌卡因低、中、高水平組BGC-823細(xì)胞中AMPK、Nrf2 mRNA水平均下降(P<0.05);與順鉑組比較,羅哌卡因低、中、高水平組BGC-823細(xì)胞中AMPK、Nrf2 mRNA水平均升高(P<0.05);與羅哌卡因低水平組比較,羅哌卡因中、高水平組BGC-823細(xì)胞中AMPK、Nrf2 mRNA水平依次降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組BGC-823細(xì)胞中AMPK、Nrf2 mRNA水平比較

2.4各組BGC-823細(xì)胞中AMPK、Nrf2蛋白水平比較 與對(duì)照組比較,順鉑組、羅哌卡因低、中、高水平組BGC-823細(xì)胞中AMPK、Nrf2蛋白水平均降低(P<0.05);與順鉑組比較,羅哌卡因低、中、高水平組BGC-823細(xì)胞中AMPK、Nrf2蛋白水平均升高(P<0.05);與羅哌卡因低水平組比較,羅哌卡因中、高水平組BGC-823細(xì)胞中AMPK、Nrf2蛋白水平依次降低(P<0.05)。見圖3、表5。

注:A為對(duì)照組;B為順鉑組;C為羅哌卡因低水平組;D為羅哌卡因中水平組;E為羅哌卡因高水平組。

表5 各組BGC-823細(xì)胞中AMPK、Nrf2蛋白水平比較

3 討 論

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一,隨著當(dāng)前人們飲食質(zhì)量及飲食習(xí)慣的改善,胃癌的整體發(fā)病率有所下降,胃癌的主要問題在于其預(yù)后差,患者生存率低,是全世界主要的公共衛(wèi)生問題之一[11-12]。胃癌的轉(zhuǎn)移是患者預(yù)后較差的主要原因,探究胃癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)制對(duì)于開發(fā)出治療胃癌的新藥物意義重大。

羅哌卡因作為一種麻醉劑,廣泛應(yīng)用于外科手術(shù)區(qū)域阻滯、硬膜外麻醉及分娩鎮(zhèn)痛[13-14]。目前關(guān)于羅哌卡因的抗癌作用已有報(bào)道,WANG等[15]的研究表明,羅哌卡因能通過調(diào)控整合素β1抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移。CHEN等[16]報(bào)道,羅哌卡因可通過阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)凋亡來抑制宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)。ZHAO等[17]發(fā)現(xiàn),羅哌卡因能夠減弱乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移能力,使得癌細(xì)胞存活率降低,并誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡,從而抑制乳腺癌進(jìn)展。但是,目前關(guān)于羅哌卡因?qū)ξ赴〣GC-823細(xì)胞生物學(xué)行為的影響尚不清楚。本研究使用羅哌卡因處理胃癌BGC-823細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),羅哌卡因低、中、高水平組BGC-823細(xì)胞存活率、侵襲數(shù)量均明顯下降,凋亡率明顯升高,且羅哌卡因的水平越高效果越明顯,與WANG等[15]、CHEN等[16]、ZHAO等[17]研究結(jié)果一致。表明羅哌卡因能促進(jìn)BGC-823細(xì)胞凋亡,抑制BGC-823細(xì)胞存活和侵襲,從而使得BGC-823細(xì)胞惡性生物學(xué)表現(xiàn)減少。

AMPK/Nrf2是與細(xì)胞生物學(xué)行為及氧化應(yīng)激密切相關(guān)的信號(hào)通路,同時(shí)也可影響許多疾病的病理、生理進(jìn)程[18-19]。AMPK可調(diào)節(jié)細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài),抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激,Nrf2是AMPK的下游通路,AMPK的激活可促進(jìn)下游分子Nrf2的細(xì)胞核轉(zhuǎn)位,上調(diào)Nrf2的表達(dá)[20-21]。研究發(fā)現(xiàn),AMPK/Nrf2信號(hào)通路在多種癌癥中呈現(xiàn)異常激活。XIE等[22]報(bào)道,AMPK和Nrf2在骨肉瘤細(xì)胞中呈高表達(dá),敲低AMPK和Nrf2可降低骨肉瘤細(xì)胞的存活率、遷移能力和增殖能力。WANG等[23]研究表明,抑制AMPK/Nrf2信號(hào)通路能夠增強(qiáng)黑色素瘤細(xì)胞的鐵死亡敏感性,抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖。本研究發(fā)現(xiàn),羅哌卡因處理后的BGC-823細(xì)胞AMPK、Nrf2 mRNA和蛋白水平明顯降低且呈現(xiàn)水平依賴性。結(jié)合XIE等[22]和WANG等[23]的研究,本課題組推測(cè)羅哌卡因?qū)GC-823細(xì)胞存活和侵襲的抑制作用及對(duì)BGC-823細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用可能與抑制AMPK/Nrf2信號(hào)通路有關(guān),羅哌卡因可降低AMPK/Nrf2信號(hào)通路活性,使得BGC-823細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)破壞,從而改變BGC-823細(xì)胞生物學(xué)行為。

綜上所述,羅哌卡因能夠抑制BGC-823細(xì)胞存活和侵襲,促進(jìn)BGC-823細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能與抑制AMPK/Nrf2信號(hào)通路有關(guān)。但本研究?jī)H探討了羅哌卡因通過AMPK/Nrf2信號(hào)通路對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞存活、侵襲和凋亡的調(diào)控作用,羅哌卡因能否通過其他信號(hào)通路調(diào)控BGC-823細(xì)胞的生物學(xué)行為,有待進(jìn)一步的探究。在下一步的研究中,本課題組將補(bǔ)充AMPK/Nrf2信號(hào)通路激活劑實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證本文的結(jié)論。