吳多培,楊佳玲,陳文玉,賈 莉△

陵水黎族自治縣人民醫(yī)院:1.血液透析科;2.腎內科,海南陵水 572400

糖尿病腎病(DN)是由糖尿病引起的慢性腎臟疾病(CKD),相較于未合并CKD的糖尿病患者,DN患者病死率明顯增加[1-2]。DN的發(fā)病和進展機制復雜,揭示DN發(fā)病的分子和進展機制對DN的早期診斷和治療意義重大。非編碼RNA是一類不能翻譯為蛋白質的RNA,包括長鏈非編碼RNA(lncRNA)、微小RNA(miRNA)等,能通過調節(jié)炎癥、纖維化、細胞增殖、凋亡、焦亡、自噬等過程參與DN發(fā)生、發(fā)展[3]。核豐富轉錄本1(NEAT1)是新發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA,有研究報道下調lncRNA NEAT1能抑制DN細胞增殖、纖維化、炎癥反應[4]。另有研究報道,上調miR-23c能抑制DN炎癥反應和細胞焦亡[5]。本研究旨在分析血清lncRNA NEAT1、miR-23c水平與DN和病情進展的關系,以期探討DN疾病進展的內在分子機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 將本院2019年5月至2020年5月收治的136例DN患者納入研究作為DN組,其中男73例、女63例,年齡(54.50±7.77)歲,病程(5.83±1.18)年。納入標準:(1)DN的診斷符合《中國糖尿病腎臟疾病防治臨床指南》中DN的診斷標準[6];(2)年齡≥18歲;(3)臨床資料完整。排除標準:(1)近6個月接受過免疫抑制劑、激素治療;(2)近3個月患急性感染或急性心、腦血管疾病;(3)合并甲狀腺、甲狀旁腺或腎上腺等其他內分泌器官的疾病;(4)合并免疫、血液系統(tǒng)疾病;(5)惡性腫瘤;(6)合并高血壓腎損害、膜性腎病、腎病綜合征或系膜增生性腎小球腎炎等其他腎臟疾病。另選取同期于本院體檢的58例健康者作為對照組,其中男26例、女32例,年齡(53.45±7.26)歲。兩組性別構成、年齡比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性。納入研究者及其直系親屬均對本研究知情同意并簽署知情同意書。本研究經本院倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1臨床實驗室指標的檢測 DN組和對照組分別于入院次日和體檢當日清晨(禁食8 h后)接受空腹靜脈血標本采集。采用美國貝克曼庫爾特DXC800型全自動生化分析儀測定空腹血糖(FBG)、血脂四項[總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)]、血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN);根據(jù)簡化MRDR公式計算估算的腎小球濾過率(eGFR),eGFR=[186×Scr(mg/dL)]-(1.154×年齡)-0.203,若為女性,則需將計算結果再乘以0.742。收集受檢者24 h尿液,采用放射免疫分析法檢測尿清蛋白和肌酐水平,計算尿清蛋白/肌酐比值(UACR)。

1.2.2實時熒光定量PCR(qPCR)檢測 采集受試者6 mL空腹靜脈血,以3 000 r/min離心10 min(離心半徑為8 cm),取上清液,立即保存于-80 ℃冰箱備用。采用TRIzol試劑盒提取血清總RNA,驗證RNA濃度和純度[260 nm和280 nm處吸光度(A)比值(A260/A280)為1.8～2.0]后,使用Takara反轉錄試劑盒轉錄合成cDNA,SYBR Green Master Mix qPCR試劑盒檢測血清lncRNA NEAT1、miR-23c、腎損傷分子-1(KIM-1)mRNA、中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(NGAL)mRNA、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)mRNA、白細胞介素-6(IL-6)mRNA水平。lncRNA NEAT1、miR-23c的檢測以U6作為內參;KIM-1、NGAL、TNF-α、IL-6的檢測以GAPDH作為內參。引物序列見表1。反應體系共20 μL:1 μL cDNA,2 μL正/反向引物,10 μL SYBR Green Master Mix、5 μL ddH2O。反應條件:95 ℃ 5 min,95 ℃ 15 s、62 ℃ 40 s共40個循環(huán)。2-ΔΔCt法計算血清lncRNA NEAT1、miR-23c、KIM-1 mRNA、NGAL mRNA、TNF-α mRNA、IL-6 mRNA相對表達量。

表1 qPCR引物序列(5′-3′)

1.2.3CKD分期 DN患者入院后參考《中國糖尿病腎臟疾病防治臨床指南》[6],根據(jù)有無腎臟損害(包括病理異常、影像學異常、血尿、其他尿沉渣異常、UACR≥30 mg/g等)和eGFR進行CKD分期。G1期:有腎臟損害,eGFR≥90 mL·min-1·1.73 m-2;G2期:有腎臟損害,eGFR為60～<90 mL·min-1·1.73 m-2;G3期:有或無腎臟損害,eGFR為30～<60 mL·min-1·1.73 m-2;G4期:有或無腎臟損害,eGFR為15～<30 mL·min-1·1.73 m-2;G5期:有或無腎臟損害,eGFR<15 mL·min-1·1.73 m-2或透析。根據(jù)CKD分期將DN患者分為G1期(34例)、G2期(26例)、G3期(36例)、G4期(22例)、G5期(18例)。

2 結 果

2.1兩組臨床實驗室檢測指標比較 DN組FBG、TC、TG、LDL-C、Scr、BUN、UACR水平均高于對照組,HDL-C水平低于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2。

表2 兩組臨床實驗室檢測指標比較或M(P25,P75)]

2.2兩組血清lncRNA NEAT1、miR-23c水平比較 DN組血清lncRNA NEAT1水平高于對照組,miR-23c水平低于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表3。

表3 兩組血清lncRNA NEAT1、miR-23c水平比較

2.3兩組血清KIM-1、NGAL、TNF-α、IL-6 mRNA水平和eGFR比較 DN組KIM-1、NGAL、TNF-α、IL-6 mRNA水平均高于對照組,eGFR低于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表4。

表4 兩組血清KIM-1、NGAL、TNF-α、IL-6 mRNA水平及eGFR比較或M(P25,P75)]

2.4不同CKD分期DN患者血清lncRNA NEAT1、miR-23c和KIM-1、NGAL、TNF-α、IL-6 mRNA水平比較 G1～G5期DN患者血清lncRNA NEAT1和KIM-1、NGAL、TNF-α、IL-6 mRNA水平依次升高,miR-23c水平依次降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表5。

表5 不同CKD分期DN患者血清lncRNA NEAT1、miR-23c和KIM-1、NGAL、TNF-α、IL-6 mRNA水平比較

表6 DN患者血清lncRNA NEAT1、miR-23c水平與KIM-1、NGAL、TNF-α、IL-6 mRNA水平及eGFR的相關性

2.5DN患者血清lncRNA NEAT1、miR-23c水平與KIM-1、NGAL、TNF-α、IL-6 mRNA水平及eGFR的相關性 Pearson/Spearman相關分析顯示,DN患者血清lncRNA NEAT1水平與KIM-1、NGAL、TNF-α、IL-6 mRNA水平均呈正相關(P<0.05),與miR-23c、eGFR呈負相關(P<0.05)。DN患者血清miR-23c水平與KIM-1、NGAL、TNF-α、IL-6 mRNA水平均呈負相關(P<0.05),與eGFR呈正相關(P<0.05)。見表6。

2.6血清lncRNA NEAT1、miR-23c水平與DN病情進展的關系 以血清lncRNA NEAT1、miR-23c水平為自變量,CKD分期為因變量(G1～G5期分別賦值為1、2、3、4、5),建立未校正、校正血糖后(用FBG進行校正)、校正血糖和血脂后(用FBG、TC、TG、HDL-C、LDL-C進行校正)、校正血糖、血脂、腎功能后(用FBG、TC、TG、HDL-C、LDL-C、Scr、BUN、UACR進行校正)4種多元有序Logistic回歸模型,平行線檢驗均P>0.05,滿足平行線假設。結果顯示,校正血糖、血脂、腎功能后,lncRNA NEAT1仍然是DN病情進展的獨立危險因素,miR-23c是獨立保護因素(P<0.05)。見表7。

表7 血清lncRNA NEAT1、miR-23c水平作為DN病情影響因素的多元有序Logistic回歸分析

3 討 論

糖尿病是危害人類健康的重大疾病之一,2019年全球20～79歲人群患病人數(shù)達4.63億[7]。DN是糖尿病常見微血管并發(fā)癥之一,臨床特征為持續(xù)清蛋白尿排泄增加和(或)GFR進行性下降,最終可發(fā)展為終末期腎臟疾病,嚴重威脅人類生命健康[8-9]。DN的主要病理生理改變包括腎小球/腎小管基底膜增厚、腎小球硬化、腎小管萎縮和細胞凋亡、腎間質炎癥浸潤、腎間質纖維化等[10]。目前DN進展的機制尚不十分清楚,探討DN進展的機制對DN的早期診斷和治療意義重大。

lncRNA是一類由200個核苷酸構成的無蛋白質編碼功能的RNA,廣泛參與轉錄調節(jié)、轉錄后調節(jié)、表觀遺傳調節(jié)等基因表達的調控過程,其異常表達與DN等多種疾病有關。DUAN等[11]的研究報道,lncRNA干擾素刺激基因20能通過miR-486-5p/活化T細胞核因子5誘導蛋白激酶B磷酸化促進DN中的腎纖維化過程。lncRNA NEAT1定位于染色體11q13.1,最初的研究發(fā)現(xiàn)其主要通過穩(wěn)定細胞核內miRNA調節(jié)基因表達,后來發(fā)現(xiàn)其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中也發(fā)揮重要作用。有研究顯示,lncRNA NEAT1能促進腎癌細胞增殖、上皮-間質轉化、侵襲、遷移[12-13]。腎間質炎癥浸潤、腎細胞凋亡、腎間質纖維化是DN的主要病理生理特征[10]。WANG等[14]的研究報道,lncRNA NEAT1能通過miR-27a-3p/活化激酶1結合蛋白3軸調控急性腎損傷炎癥和細胞凋亡。LI等[15]研究報道,lncRNA NEAT1能靶向miR-129促進腎纖維化。本研究結果顯示,DN組血清lncRNA NEAT1水平高于對照組,且G1～G5期DN患者血清lncRNA NEAT1水平依次升高,說明lncRNA NEAT1參與DN發(fā)生、發(fā)展,推測其作用機制可能為通過靶向miRNA促進腎臟炎癥及腎間質纖維化。隨著lncRNA NEAT1水平的升高,腎損傷程度更加嚴重[14-15]。KIM-1是一種跨膜糖蛋白,正常生理狀態(tài)下表達極少,當腎臟出現(xiàn)缺血、炎癥等損傷時其水平可快速升高;NGAL是一種脂質運載蛋白,正常生理狀態(tài)下表達極少,當腎臟出現(xiàn)缺血、炎癥等損傷時其水平可快速升高,并通過增強抗炎癥反應發(fā)揮保護作用。目前KIM-1、NGAL已被認為是DN腎損傷的標志物[16]。有研究表明,DN是一種慢性低水平炎癥疾病,TNF-α、IL-6等促炎癥細胞因子通過刺激并損傷胰島β細胞而誘發(fā)胰島素抵抗,并且進一步介導DN的發(fā)生、發(fā)展過程[17-18]。腎功能改變?yōu)镈N的重要表現(xiàn),eGFR是反映腎功能的主要指標,目前CKD分期也是基于eGFR[6]。本研究結果顯示,DN組血清KIM-1、NGAL、TNF-α、IL-6 mRNA水平升高且隨著CKD分期增加而升高,符合既往研究報道;進一步研究顯示,DN患者血清lncRNA NEAT1與KIM-1、NGAL、TNF-α、IL-6 mRNA水平呈正相關,而與eGFR呈負相關,說明lncRNA NEAT1參與DN發(fā)生、發(fā)展,推測其機制可能與lncRNA NEAT1能抑制蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白信號通路促進DN腎細胞增殖和組織纖維化有關[19]。

miRNA是一種包含約22個核苷酸的無蛋白質編碼功能的RNA,能通過結合靶基因3′非編碼區(qū),降解或抑制mRNA翻譯,在轉錄水平上調節(jié)基因表達[3]。有研究表明,miRNA也廣泛參與DN發(fā)生、發(fā)展,如miR-27a-3p能通過影響腎纖維化、線粒體功能障礙、內質網(wǎng)應激參與DN發(fā)生、發(fā)展[20]。miR-23c定位于染色體Xp22.12,既往研究報道了其在腫瘤中的作用,如miR-23c能通過調控染色質解旋酶DNA結合蛋白7影響子宮內膜癌細胞的惡性特征和預后[21]。目前有關miR-23c與腎臟疾病的研究報道較少,LU等[21]通過下一代測序分析發(fā)現(xiàn),miR-23c為DN患者尿液差異表達miRNA之一,但未進一步分析miR-23c與DN的關系。本研究結果顯示,DN組血清miR-23c水平低于對照組,而且G1～G5期DN患者血清miR-23c水平依次降低,說明miR-23c參與DN發(fā)生、發(fā)展。但LEE等[22]報道,DN患者尿液中miR-23c水平明顯上調,而本研究中DN組血清miR-23c水平明顯下調,考慮與DN患者腎功能惡化引起miR-23c滲漏至尿液有關,本研究后續(xù)也將進一步驗證相關推論。本研究結果還顯示,DN患者血清miR-23c與KIM-1、NGAL、TNF-α、IL-6 mRNA水平呈負相關,而與eGFR呈正相關,進一步說明miR-23c參與DN發(fā)生、發(fā)展,推測其作用機制與低水平miR-23c會促進高糖誘導的DN細胞的焦亡,增加促炎因子IL-1β表達,加重腎損傷有關[5,23]。lncRNA能通過競爭胞內miRNA,抑制靶基因表達[24]。LI等[25]通過starBase生物信息學軟件和雙熒光素酶報告基因實驗證實,lncRNA NEAT1可海綿化miR-23c,促進DN患者腎間質細胞增殖和纖維化。本研究結果也顯示,DN患者血清lncRNA NEAT1與miR-23c水平呈負相關,說明二者共同參與DN病情進展,但二者在DN中發(fā)揮的具體作用,本課題組未進行深入探討。本研究僅通過檢測患者血清指標探討了二者與DN病情進展的關系,并未通過腎穿刺獲取組織標本來進行驗證,可能對腎損傷的評估存在一定的偏差,后續(xù)本研究將進一步擴大樣本量,通過收集腎穿刺組織標本進一步驗證lncRNA NEAT1和miR-23c水平與DN腎損傷進展的關系,為探討DN發(fā)展的內在機制提供參考,也為DN腎損傷早期評估提供依據(jù)。

DN發(fā)生與高血糖所致的糖代謝、脂代謝異常密切相關,合理控制血糖和血脂水平對延緩DN進展意義重大[10]。本研究中,DN患者血糖、血脂水平明顯異常,同時腎功能指標Scr、BUN、UACR水平也明顯升高。最后,本研究通過多元有序Logistic回歸證實,無論是否校正血糖、血脂、腎功能指標,血清lncRNA NEAT1、miR-23c均是DN病情進展的獨立影響因素,進一步說明二者與DN病情進展密切相關。

綜上所述,DN患者血清lncRNA NEAT1水平提升,miR-23c水平降低,與DN病情進展密切相關。但本研究為初步研究,后續(xù)還需大樣本量的研究證實得到的結論并進一步分析二者與DN病情進展的關系。