王秦西,車康明,郭千弘

甘肅省天水市第一人民醫(yī)院腫瘤外科,甘肅天水 741000

乳腺癌是女性常見(jiàn)惡性腫瘤,發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),嚴(yán)重威脅女性生命健康[1]。乳腺癌的進(jìn)展為多基因、多因素協(xié)同作用的結(jié)果,研究表明,該病預(yù)后與有無(wú)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]。臨床常依據(jù)術(shù)中觀察是否有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移評(píng)估乳腺癌是否發(fā)生轉(zhuǎn)移,但仍會(huì)出現(xiàn)漏診、誤診,影響治療結(jié)果。所以尋找一種可準(zhǔn)確評(píng)估乳腺癌轉(zhuǎn)移的靈敏指標(biāo)至關(guān)重要。四跨膜蛋白8(Tspan8)屬于四跨膜蛋白超家族(TM4SF)成員,研究證實(shí)胃癌、肝癌中Tspan8呈過(guò)表達(dá)且參與腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)過(guò)程[3]。整合素α5(ITGA5)屬于整合素家族成員,位于染色體12q11-q13區(qū)域,胃癌、卵巢癌中ITGA5呈高表達(dá)且與不良預(yù)后有關(guān)[4-5]。但目前涉及Tspan8、ITGA5與乳腺癌關(guān)系的研究較少。因此,本研究主要探討Tspan8、ITGA5在乳腺癌中的表達(dá)情況及其與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系,為乳腺癌早期診斷和治療提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2018年4月至2020年4月本院收治的136例乳腺癌患者納入研究,年齡25～71歲、平均(51.37±5.28)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)經(jīng)病理檢查確診且符合《2020 CSCO版乳腺癌診療指南》中乳腺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6];(2)入院后接受乳腺癌根治術(shù)、腋窩淋巴結(jié)清掃術(shù)治療。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)術(shù)前有放化療、新輔助治療、內(nèi)分泌治療史;(2)心、肝、肺、腎等組織器官功能異常;(3)合并其他惡性腫瘤、免疫缺陷疾病、血液系統(tǒng)疾病;(4)認(rèn)知異?；蚓癞惓?(5)妊娠及哺乳期女性;(6)依從性差。納入研究的患者或直系親屬對(duì)本研究知情同意。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1免疫組化法檢測(cè)組織標(biāo)本中Tspan8、ITGA5的表達(dá)情況 收集患者癌組織標(biāo)本及對(duì)應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本,采用乳腺癌組織及癌旁組織中Tspan8、ITGA5的表達(dá)情況。采用4%多聚甲醛常規(guī)固定乳腺癌組織和癌旁組織標(biāo)本,組織標(biāo)本經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片處理后,制得厚度為4 μm的組織切片。將組織切片進(jìn)行二甲苯脫蠟、不同梯度乙醇脫水處理后,使用檸檬酸鈉溶液在高壓高溫條件下進(jìn)行抗原修復(fù),冷卻后加入磷酸鹽緩沖液(PBS),沖洗3次,每次5 min。隨后加入5%山羊血清抗體封閉液進(jìn)行封閉,滴加兔抗人Tspan8多克隆抗體(1∶50,美國(guó)Biorbyt公司)、兔抗人ITGA5多克隆抗體(1∶100,美國(guó)Biorbyt公司),4 ℃冰箱內(nèi)孵育過(guò)夜,加入PBS沖洗3次,加入羊抗兔二抗IgG(1∶1 000,北京中杉金橋公司),37 ℃下孵育30 min,PBS沖洗3次。采用DAB染色試劑盒顯色,蘇木精復(fù)染,乙醇脫水,樹(shù)脂膠封片,高倍顯微鏡下觀察。陽(yáng)性細(xì)胞的判定:顯微鏡下觀察,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分:陽(yáng)性細(xì)胞<5%、5%～<25%、25%～<50%、50%～<75%、≥75%分別計(jì)為0、1、2、3、4分。染色強(qiáng)度評(píng)分:無(wú)著色、淺黃或黃色、棕黃色、棕褐色分別為0、1、2、3分。染色指數(shù)(SI)=陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分×染色強(qiáng)度評(píng)分,蛋白陽(yáng)性或陰性表達(dá)的判定:SI>3分為陽(yáng)性,SI≤3分為陰性[7]。

1.2.2隨訪 通過(guò)電話、門(mén)診復(fù)查等方式對(duì)出院的乳腺癌患者行連續(xù)36個(gè)月的隨訪,記錄患者生存狀況,隨訪截止時(shí)間為2023年4月。第1年每2個(gè)月隨訪1次,第2、3年每4個(gè)月隨訪1次,死亡或到隨訪截止時(shí)間即可終止隨訪。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)或百分率表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用多因素Cox回歸分析乳腺癌患者腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1乳腺癌組織和癌旁組織Tspan8、ITGA5陽(yáng)性表達(dá)率的比較 乳腺癌組織Tspan8、ITGA5陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織(P<0.05),見(jiàn)表1,圖1、2。

表1 乳腺癌組織和癌旁組織中Tspan8和ITGA5表達(dá)情況比較[n(%)]

注:A為乳腺癌組織(×40);B為癌旁組織(×40);A1、B1為A、B的局部放大。

注:A為乳腺癌組織;B為癌旁組織。

2.2Tspan8、ITGA5表達(dá)情況與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系 不同年齡、月經(jīng)狀況的乳腺癌患者Tspan8、ITGA5表達(dá)情況比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。低分化、腫瘤最大徑≥3 cm、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、其他分子分型的乳腺癌患者Tspan8、ITGA5陽(yáng)性表達(dá)率高于中/高分化、腫瘤最大徑<3 cm、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、三陰性分型的乳腺癌患者(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 Tspan8、ITGA5表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3不同臨床病理特征的乳腺癌患者3年生存率的比較 連續(xù)隨訪36個(gè)月后,136例乳腺癌患者中94例存活,3年生存率為69.12%(94/136)。低分化、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、其他分子分型及Tspan8、ITGA5陽(yáng)性表達(dá)患者的3年生存率低于中/高分化、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、三陰性分型及Tspan8、ITGA5陰性表達(dá)患者(P<0.05),見(jiàn)表3。

表3 不同臨床病理特征的乳腺癌患者3年生存率的比較[n=94,n(%)]

2.4乳腺癌患者腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的多因素Cox回歸分析 將乳腺癌患者腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移作為因變量,將單因素分析有意義的指標(biāo)作為自變量進(jìn)行多因素Cox回歸分析,結(jié)果顯示,TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、其他分子分型及Tspan8、ITGA5陽(yáng)性表達(dá)是乳腺癌患者腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素(P<0.05),見(jiàn)表4。

表4 乳腺癌患者腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的多因素Cox回歸分析

3 討 論

乳腺癌屬于激素受體依賴型惡性腫瘤,我國(guó)乳腺癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),為女性癌癥相關(guān)死亡的重要原因之一[8]。晚期乳腺癌會(huì)向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,累及多臟器,腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)的主要因素,會(huì)增加患者死亡風(fēng)險(xiǎn)。研究證實(shí),病灶范圍、腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為評(píng)估乳腺癌患者預(yù)后的重要依據(jù)[9]。臨床對(duì)乳腺癌患者實(shí)施腋窩淋巴結(jié)清掃術(shù)治療,但手術(shù)創(chuàng)傷大、并發(fā)癥較多,而且對(duì)腋窩淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移的患者而言屬于過(guò)度治療,不會(huì)改善局部控制率和生存率。所以,為乳腺癌預(yù)后提供新的預(yù)測(cè)標(biāo)志物,能為疾病診斷和治療提供新思路。

四跨膜蛋白超家族成員參與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)過(guò)程,Tspan8可作為腫瘤診斷、預(yù)后評(píng)估指標(biāo)[10]。有研究通過(guò)在結(jié)腸癌細(xì)胞中的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),Tspan8為細(xì)胞膜蛋白,不影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂,其參與癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng),Tspan8水平升高,癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性、浸潤(rùn)能力增強(qiáng)[11]。另一研究認(rèn)為,Tspan8通過(guò)c-Met、Notch、Rhokinase等信號(hào)通路,促進(jìn)腫瘤新生血管的形成[12]。本研究結(jié)果顯示,乳腺癌組織Tspan8陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織(P<0.05);不同分化程度、TNM分期、分子分型、有無(wú)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者Tspan8表達(dá)情況比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),Tspan8與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),提示Tspan8在乳腺癌中呈高表達(dá)且與病情進(jìn)展有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn),腸癌細(xì)胞株中Tspan8呈過(guò)表達(dá),與消化系統(tǒng)腫瘤轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)有關(guān),與本研究結(jié)果相似[13]。另一研究報(bào)道,胰腺癌轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞系Tspan8 mRNA表達(dá)水平高于原發(fā)灶細(xì)胞系[14]。分析原因:經(jīng)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)、成纖維生長(zhǎng)因子受體(FGFR)、c-Kit等靶點(diǎn)阻斷磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/絲氨酸蘇氨酸激酶(AKT)、VEGFR/ Janus激酶2(JAK2)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)等信號(hào)通路,可抑制癌細(xì)胞增殖、遷移,促使癌細(xì)胞死亡。Tspan8表達(dá)上調(diào),會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移,該作用與PI3K/AKT、MAPK/AKT等信號(hào)通路有關(guān)[15]。本研究結(jié)果顯示,Tspan8陽(yáng)性表達(dá)患者的3年生存率低于Tspan8陰性表達(dá)患者(P<0.05),提示Tspan8過(guò)表達(dá)與乳腺癌預(yù)后不良有關(guān),有望成為評(píng)估乳腺癌預(yù)后的標(biāo)志物。

整合素為細(xì)胞表面的黏附分子,包含α亞基、β亞基。整合素家族為跨膜二聚體蛋白,具有細(xì)胞黏附、信號(hào)通路受體功能,ITGA5亞基或二聚體可結(jié)合細(xì)胞外結(jié)構(gòu)、基質(zhì)蛋白,從而調(diào)控細(xì)胞周期,調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲、遷移等,其有組織、功能特異性[16-17]。ITGA5經(jīng)依賴黏附、非黏附途徑促進(jìn)乳腺癌發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果顯示,乳腺癌組織ITGA5陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織(P<0.05);ITGA5陽(yáng)性表達(dá)與分化程度、TNM分期、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分子分型有關(guān)(P<0.05)。這提示ITGA5高表達(dá)與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示,ITGA5在肝癌組織中的表達(dá)高于普通肝組織,與本研究結(jié)果一致[18]。研究表明,乳腺癌骨轉(zhuǎn)移瘤中ITGA5呈高表達(dá),其可促進(jìn)癌細(xì)胞向骨組織黏附,但肺、肝、腦轉(zhuǎn)移癌中ITGA5呈低表達(dá)[19]。有研究示,抑制ITGA5可延緩肺癌細(xì)胞遷移。本研究結(jié)果顯示,ITGA5陽(yáng)性表達(dá)患者的3年生存率低于ITGA5陰性表達(dá)患者(P<0.05),提示ITGA5高表達(dá)與乳腺癌預(yù)后不良有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn),膠質(zhì)瘤中ITGA5表達(dá)升高且隨膠質(zhì)瘤WHO分級(jí)增加而升高,ITGA5表達(dá)與腫瘤增殖、惡性程度相關(guān)[20]。多因素Cox回歸分析顯示,TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、其他分子分型及Tspan8、ITGA5陽(yáng)性表達(dá)是乳腺癌患者腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素(P<0.05),提示Tspan8、ITGA5表達(dá)升高導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng),細(xì)胞黏附性下降,易發(fā)生腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵襲,監(jiān)測(cè)Tspan8、ITGA5水平變化可反映乳腺癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。綜上所述,Tspan8、ITGA5在乳腺癌患者中呈高表達(dá),均與患者臨床病理特征及預(yù)后有關(guān)。