馮 英,鄭 瑤,仇成鳳,4,譚力銘△

1.徐州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,江蘇徐州 221000;2.懷化市第二人民醫(yī)院腫瘤防治懷化市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南懷化 418000;3.吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,湖南吉首 416000;4.湖南醫(yī)藥學(xué)院總醫(yī)院循證醫(yī)學(xué)與臨床研究中心,湖南懷化 418000

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤,從癌細(xì)胞形態(tài)及病理角度將肺癌分為小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC),其中NSCLC占80%～85%[1]。表皮生長因子受體(EGFR)是NSCLC中最常見的驅(qū)動(dòng)基因之一。酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)是治療攜帶EGFR突變的局部晚期或轉(zhuǎn)移性NSCLC患者的標(biāo)準(zhǔn)一線療法[2]。本研究使用的GSE117846數(shù)據(jù)集主要聚焦第一代EGFR-TKIs。第一代EGFR-TKIs包括厄洛替尼和吉非替尼等,大多數(shù)EGFR突變的NSCLC患者在接受第一代EGFR-TKIs治療9～13月后出現(xiàn)獲得性耐藥與疾病進(jìn)展[3]。有研究表明,EGFR-TKIs耐藥機(jī)制主要包括原發(fā)性耐藥和獲得性耐藥,獲得性耐藥機(jī)制主要包括EGFR T790M突變、間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子(MET)擴(kuò)增、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)突變等,其中EGFR T790M突變約占第一代EGFR-TKIs獲得性耐藥機(jī)制的50%～60%[4]。EGFR-TKIs獲得性耐藥是一個(gè)復(fù)雜的過程,目前其確切分子機(jī)制尚不清楚。鐵死亡是一種鐵依賴非凋亡性細(xì)胞死亡,本質(zhì)上是膜脂質(zhì)修復(fù)酶活性衰竭、細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物代謝紊亂、鐵依賴的脂質(zhì)活性氧自由基積累導(dǎo)致的細(xì)胞死亡,與細(xì)胞凋亡、壞死、自噬在形態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)和生化特性上有明顯區(qū)別,同時(shí)與癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5]。KUKULJ等[6]研究發(fā)現(xiàn)鐵蛋白在NSCLC患者組織中普遍高表達(dá),與腫瘤患者不良預(yù)后有關(guān)。相關(guān)研究表明,鐵死亡還參與某些癌癥耐藥性的發(fā)生和逆轉(zhuǎn)[7-8],調(diào)節(jié)鐵死亡可以影響抗癌藥物的療效[9]。本研究通過生物信息學(xué)分析篩選出與EGFR-TKIs耐藥相關(guān)的鐵死亡基因,旨在尋找NSCLC潛在的干預(yù)靶點(diǎn)及生物標(biāo)志物,為NSCLC EGFR-TKIs耐藥基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫患者的治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)來源 在基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(GEO)(https://www.ncbi.nlm.Nih.Gov/geo/)中下載基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集GSE117846。該數(shù)據(jù)集是在對(duì)耐藥細(xì)胞進(jìn)行不同處理后,獲取的耐藥細(xì)胞RNA-seq基因表達(dá)譜,技術(shù)平臺(tái)為GPL21290:Illumina HiSeq 3000(Homo sapiens)。通過FerrDb數(shù)據(jù)庫(http://www.zhounan.org/ferrdb)獲取鐵死亡相關(guān)基因,包括驅(qū)動(dòng)基因(370個(gè))、抑制基因(349個(gè))及標(biāo)記基因(12個(gè)),去除非人類基因和重復(fù)基因,最后得到382個(gè)基因。NSCLC患者的腫瘤組織與正常組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù)均來自TCGA公共數(shù)據(jù)集(https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/str-uctural-genomics/tcga),包括肺鱗癌(LUSC)患者腫瘤組織數(shù)據(jù)503例及正常組織數(shù)據(jù)52例、肺腺癌(LUAD)患者腫瘤組織數(shù)據(jù)515例及正常組織數(shù)據(jù)59例。

1.2方法

1.2.1DEGs篩選 通過GEO自帶的基因差異分析工具(GEO2R)分析GSE117846數(shù)據(jù)集中的DEGs,以P<0.05且|log2FC|≥1為篩選條件,FC表示變化倍數(shù)。利用在線工具jvenn(https://www.bioinformatics.com.cn)將從GSE117846數(shù)據(jù)集篩選出的DEGs及從FerrDb數(shù)據(jù)庫獲取的鐵死亡相關(guān)基因構(gòu)建Venn圖,得到與鐵死亡相關(guān)的NSCLC EGFR-TKIs耐藥DEGs。

1.2.2DEGs的功能和通路分析 使用在線工具DAVID 2021(https:// david.ncifcrf.Gov/)進(jìn)行DEGs的功能和通路分析,導(dǎo)入并查看DEGs的基因本體論(GO)功能和京都基因與基因組百科全書(KEGG)信號(hào)通路富集分析結(jié)果。

1.2.3蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將交集基因?qū)隨TRING 11.5 (https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫分析PPI,并利用CytoScape3.9.1中cytoHubba插件的最大鄰域分量(MNC)、最大團(tuán)中心性(MCC)、邊緣滲透分量(EPC)和最大鄰域分量的密度(DMNC)4種算法篩選出交集基因中的關(guān)鍵基因(Hub基因)。

1.2.4表達(dá)差異和生存分析 利用ULCAN數(shù)據(jù)庫對(duì)Hub基因在NSCLC腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)水平進(jìn)行差異分析。同時(shí),利用GEPIA2數(shù)據(jù)庫比較Hub基因表達(dá)水平在NSCLC不同分期間的差異,并繪制不同Hub基因表達(dá)水平NSCLC患者的生存曲線(以Hub基因的中位表達(dá)水平作為判斷表達(dá)水平高低的臨界值,以累積生存率作為統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。

1.2.5NSCLC組織來源和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè) 5對(duì)NSCLC組織及癌旁組織取自2021年懷化市第二人民醫(yī)院經(jīng)病理學(xué)檢查確診的NSCLC患者手術(shù)切除組織。所有標(biāo)本置于-80 ℃冷藏保存。本研究得到了懷化市第二人民醫(yī)院倫理審查委員會(huì)的批準(zhǔn)。使用TRI試劑(Sigma公司)分別從組織樣品中提取總RNA,用Maxima H Minus第一鏈cDNA合成試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司)合成cDNA,最終反應(yīng)體積為20 μL。根據(jù)試劑盒說明,進(jìn)行qPCR檢測(cè)。腫瘤蛋白P63(TP63)和內(nèi)參基因GAPDH的引物序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。qPCR擴(kuò)增條件為50 ℃ 2 min,95 ℃ 2 min,95 ℃ 15 s、55 ℃ 15 s、72 ℃ 1 min共40次循環(huán),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。TP63的相對(duì)表達(dá)水平用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。引物序列見表1。

表1 qPCR檢測(cè)的引物序列

1.2.6體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 將人肺癌細(xì)胞PC-9和對(duì)吉非替尼耐藥的PC-9/GR細(xì)胞用于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)分組處理情況如下。PC-9組:作為對(duì)照,PC-9細(xì)胞培養(yǎng)基中加入DMSO;PC-9+吉非替尼組:PC-9細(xì)胞培養(yǎng)基中加入終濃度為1 μmol/L的吉非替尼處理24 h;PC-9/GR組:PC-9/GR細(xì)胞培養(yǎng)基中加入終濃度為1 μmol/L的吉非替尼處理48 h。細(xì)胞分組處理完成后,去除細(xì)胞培養(yǎng)基,用PBS洗2遍。參考1.2.5中的方法檢測(cè)細(xì)胞中TP63的相對(duì)表達(dá)水平,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1NSCLC EGFR-TKIs耐藥的DEGs篩選 對(duì)GSE117846數(shù)據(jù)集中的6例樣本表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析,篩選符合P<0.05且|log2FC|≥1 的DEGs,最終得到3 716個(gè)差異基因,其中有1 744個(gè)上調(diào)基因和1 972個(gè)下調(diào)基因,見圖1。

注:A為EGFR-TKIs耐藥DEGs火山圖,藍(lán)色圓點(diǎn)代表表達(dá)下調(diào)的DEGs,粉色圓點(diǎn)代表表達(dá)上調(diào)的DEGs,灰色圓點(diǎn)代表表達(dá)無明顯差異的基因;B為EGFR-TKIs耐藥DEGs熱圖,對(duì)照組加入DMSO,實(shí)驗(yàn)組加入吉非替尼,紅色表示上調(diào),藍(lán)色表示下調(diào),ctrl.1～3表示對(duì)照組1～3號(hào)樣本,gefi.1～3表示實(shí)驗(yàn)組1～3號(hào)樣本。

2.2篩選與NSCLC EGFR-TKIs耐藥及鐵死亡相關(guān)的DEGs 通過FerrDb數(shù)據(jù)庫獲得鐵死亡相關(guān)的基因共382個(gè),與GSE117846數(shù)據(jù)集篩選所得的耐藥相關(guān)的DEGs取交集,得到60個(gè)與鐵死亡相關(guān)的NSCLC EGFR-TKIs耐藥DEGs,包括30個(gè)下調(diào)基因和30個(gè)上調(diào)基因。見圖2。

圖2 NSCLC EGFR-TKIs耐藥相關(guān)基因與鐵死亡相關(guān)基因交集圖

2.3GO功能和KEGG通路富集分析 對(duì)60個(gè)交集基因進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,結(jié)果顯示與鐵死亡相關(guān)的NSCLC EGFR-TKIs耐藥DEGs主要富集的生物過程(BP)包括蛋白質(zhì)ADP-核糖基化、p53類介質(zhì)對(duì)DNA損傷的內(nèi)在凋亡信號(hào)通路、細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)等,主要富集的細(xì)胞成分(CC)為細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、細(xì)胞核、核小體、線粒體、細(xì)胞質(zhì)等,主要富集的分子功能(MF)為蛋白ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性、NAD+ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性和核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性等。GO功能富集分析主要顯示了BP、CC和MF中10種富集最明顯的途徑(根據(jù)調(diào)整后的P值排名),見圖3A。KEGG通路富集分析顯示,與鐵死亡相關(guān)的NSCLC EGFR-TKIs耐藥DEGs主要參與鐵死亡、P53信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路等,同時(shí)也在肝細(xì)胞癌及癌癥中微小核糖核酸(miRNA)的相關(guān)調(diào)控中發(fā)揮作用,見圖3B。

注:A為GO功能分析;B為KEGG通路富集分析。

2.4PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建與鐵死亡相關(guān)的NSCLC EGFR-TKIs耐藥DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò),選擇綜合得分≥0.4的基因進(jìn)行PPI構(gòu)建。隱藏沒有相互作用的節(jié)點(diǎn),最終得到共有57個(gè)節(jié)點(diǎn)和99條邊的PPI網(wǎng)絡(luò),平均局部聚類系數(shù)0.377,PPI富集P<0.01,見圖4A。將STRING結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件,通過cytoHubba插件中的“MNC”“MCC”“EPC”和“DMNC”4種算法計(jì)算評(píng)分位于前10的基因,再利用jvenn篩選交集得到TP63基因,見圖4B。

注:A為交集基因的PPI網(wǎng)絡(luò)分析;B為Hub基因的篩選。

2.5Hub基因TP63的表達(dá)分析 ULCAN數(shù)據(jù)庫分析顯示,在LUAD組織中TP63表達(dá)水平明顯低于正常組織(P<0.01),見圖5A;在LUSC組織中TP63表達(dá)水平明顯高于正常組織(P<0.01),見圖5B。組織qPCR檢測(cè)顯示,與癌旁組織相比,TP63 mRNA在LUAD中低表達(dá),在LUSC中高表達(dá),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與ULCAN數(shù)據(jù)庫分析得到的結(jié)果一致,見圖5C。GEPIA2數(shù)據(jù)庫分析顯示,TP63表達(dá)水平在不同分期NSCLC間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.04,P<0.01),見圖5D。

注:TPM表示每百萬個(gè)轉(zhuǎn)錄片段;A、B分別為TP63基因在NSCLC、LUAD、LUSC組織和癌旁組織中的表達(dá)水平,紅色為LUAD或LUSC組織,藍(lán)色為癌旁組織;C為TP63在不同NSCLC組織中的相對(duì)表達(dá)水平,與癌旁組織比較,**P<0.01,*P<0.5;D為TP63在NSCLC不同分期中的表達(dá)情況。

2.6不同TP63表達(dá)水平NSCLC患者的生存分析 GEPIA2數(shù)據(jù)庫分析顯示,TP63高表達(dá)組(235例)、低表達(dá)組(239例)LUAD患者生存預(yù)后比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖6A;TP63低表達(dá)組(241例)的LUSC患者生存預(yù)后較高表達(dá)組(241例)差,Log-rankχ2檢驗(yàn)P<0.05,見圖6B。

注:A為TP63高/低表達(dá)的LUAD患者的生存曲線;B為TP63高/低表達(dá)的LUSC患者的生存曲線。

2.7體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn) PC-9組TP63 mRNA相對(duì)表達(dá)水平(1.01±0.01)高于PC-9/GR組(0.05±0.01)和PC-9+吉非替尼組(0.16±0.05),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),與GSE117846數(shù)據(jù)庫分析的結(jié)果具有一致性。見圖7。

注:與PC-9組比較,***P<0.001;ns.表示兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討 論

目前,EGFR-TKIs是治療攜帶EGFR突變的局部晚期或轉(zhuǎn)移性NSCLC患者的標(biāo)準(zhǔn)一線療法[2]。然而,大多數(shù)EGFR突變的NSCLC患者在接受第一代EGFR-TKIs治療9～13個(gè)月后,會(huì)出現(xiàn)獲得性耐藥,促進(jìn)疾病進(jìn)展[3]。有研究表明,鐵死亡參與NSCLC EGFR-TKIs耐藥[10-11],但鐵死亡在EGFR-TKIs耐藥中的具體機(jī)制尚不清楚,靶向鐵死亡或許能為NSCLC EGFR-TKIs耐藥干預(yù)提供新的思路。因此,本研究主要通過生物信息學(xué)分析挖掘NSCLC EGFR-TKIs耐藥有關(guān)DEGs中與鐵死亡相關(guān)的潛在靶基因,為EGFR-TKIs獲得性耐藥的干預(yù)提供新的思路。

本研究從NSCLC EGFR-TKI耐藥數(shù)據(jù)集GSE117846和FerrDb數(shù)據(jù)庫中篩選得到TP63,而且在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)TP63 mRNA 表達(dá)在PC9/GR細(xì)胞中下調(diào),與生物信息學(xué)分析結(jié)果一致。初步推斷TP63為NSCLC EGFR-TKIs耐藥相關(guān)DEGs中與鐵死亡相關(guān)的基因,但TP63在NSCLC EGFR-TKIs耐藥與鐵死亡中的作用需要進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)確定。TP63是P53轉(zhuǎn)錄因子家族的成員,其結(jié)構(gòu)與序列與P53高度同源[12]。TP63因?yàn)閱?dòng)子的不同和3’端剪切方式的不同,可選擇性剪接產(chǎn)生具有不同活性的亞型,根據(jù)TP63 N端轉(zhuǎn)錄來源的不同,可分為兩種類型:較長TA異構(gòu)體和較短DN異構(gòu)體(DNp63和TAp63)。有研究表明,TP63在腫瘤中的作用比較復(fù)雜,主要是由于TP63的兩種異構(gòu)體TAp63和ΔNp63亞型在癌癥中起相反的作用[13]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),TP63在食管鱗癌、膀胱癌、宮頸癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌等癌癥中發(fā)揮抑癌或促癌作用[14-15]。TIOFACK等[16]研究表明,TP63基因多態(tài)性可增加乳腺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。TP63與上皮惡性腫瘤高度相關(guān),尤其是鱗狀細(xì)胞癌[12,17]。同時(shí),有研究表明,ΔNp63的異常表達(dá)與藥物的耐藥性有關(guān),ΔNp63的異常表達(dá)會(huì)影響食道鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌等的化療效果[18-20]。此外,GALOZZOVA等[12]發(fā)現(xiàn)EGFR信號(hào)通路可能具有調(diào)控ΔNp63激活和表達(dá)的作用。目前,TP63在NSCLC EGFR-TKIs耐藥領(lǐng)域的研究較少,大部分是吉非替尼與TP63相關(guān)性的研究[21-22],而且吉非替尼耐藥與TP63表達(dá)之間相關(guān)性的研究結(jié)果不完全相同。楊穎等[23]的研究報(bào)道,TP63可能與PC9細(xì)胞耐藥有關(guān),而且在PC9/GR細(xì)胞中高表達(dá)并發(fā)揮ΔNp63的促癌特性。本研究結(jié)果顯示,TP63的表達(dá)與PC9細(xì)胞耐藥有關(guān),但TP63在PC9/GR細(xì)胞中mRNA表達(dá)下調(diào)。造成研究結(jié)果沖突的原因可能與TP63的多種亞型結(jié)構(gòu)相關(guān),具體機(jī)制需要進(jìn)一步探究。

鐵在決定細(xì)胞命運(yùn)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)和疾病中起著重要作用,當(dāng)鐵代謝失調(diào)時(shí),會(huì)增加患者患癌的風(fēng)險(xiǎn)[24]。相關(guān)研究表明,EGFR可以通過鐵蛋白的再分配破壞鐵的穩(wěn)態(tài),促進(jìn)肺癌的發(fā)展[25]。本研究中與鐵死亡相關(guān)的NSCLC EGFR-TKIs耐藥的GO功能和KEGG通路富集多在氧化應(yīng)激反應(yīng)、P53類介質(zhì)對(duì)DNA損傷的內(nèi)在凋亡信號(hào)通路、鐵死亡和肝細(xì)胞癌等方面。已有研究表明,ΔNp63α可通過調(diào)節(jié)谷胱甘肽的合成、利用和再生,增加細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激和鐵死亡的抵抗力[26]。同時(shí),WANG[26]等證明了ΔNp63α過表達(dá)可保護(hù)細(xì)胞免受氧化劑、DNA損傷、失巢凋亡或鐵死亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。WANG等[18]研究發(fā)現(xiàn),在耐鉑卵巢癌細(xì)胞中卷曲類受體7(FZD7)的過表達(dá)可以激活致癌因子TP63,驅(qū)動(dòng)谷胱甘肽代謝途徑的上調(diào),保護(hù)細(xì)胞免受化療誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激,促進(jìn)卵巢癌發(fā)展。GUO等[27]研究發(fā)現(xiàn),在胃癌中下調(diào)FZD7可進(jìn)一步抑制由TP63表達(dá)下調(diào)介導(dǎo)的GPX4誘導(dǎo)的鐵死亡。以上研究顯示,TP63可能是連接氧化應(yīng)激-鐵死亡的主要基因,其可能影響NSCLC的發(fā)生、發(fā)展以及第一代EGFR-TKIs療效。但TP63的相關(guān)功能與分子機(jī)制仍需要大量基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究和驗(yàn)證。

綜上所述,本研究基于生物信息學(xué)分析篩選得到與鐵死亡相關(guān)的NSCLC EGFR-TKIs耐藥DEG基因?yàn)門P63,并且對(duì)這一結(jié)果進(jìn)行了初步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)TP63對(duì)NSCLC的預(yù)后評(píng)估具有一定的價(jià)值,可作為EGFR-TKIs耐藥相關(guān)鐵死亡的治療靶點(diǎn)和LUSC預(yù)后生物標(biāo)志物。然而,本研究仍存在一些局限性:一方面,GSE117846數(shù)據(jù)集中的EGFR-TKIs耐藥病例和人體組織樣本較少,本研究篩選的Hub基因還需在后續(xù)研究中通過擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。另一方面,本研究?jī)H篩選到TP63基因,并富集了一些可能的信號(hào)通路。但TP63具有多種亞型結(jié)構(gòu),本研究推測(cè)TP63參與了NSCLC中與EGFR-TKIs耐藥相關(guān)的鐵死亡,其具體的分子機(jī)制和信號(hào)通路尚不清楚,有待后續(xù)研究中進(jìn)一步探索。