李 丹,左學(xué)騫△,趙海波,孫洪芳,徐志欽,桑銀洲

河北省滄州市人民醫(yī)院:1.婦科;2.病理科,河北滄州 061000

子宮內(nèi)膜癌(EC)是一種發(fā)生于子宮內(nèi)膜上皮的惡性腫瘤,其發(fā)病與年齡增加、代謝綜合征和遺傳等有關(guān)。早期EC患者可通過手術(shù)、放化療等綜合治療獲得較長的生存時(shí)間,而晚期患者往往喪失手術(shù)時(shí)機(jī),預(yù)后較差[1-2]。檢測(cè)生物標(biāo)志物可識(shí)別、預(yù)測(cè)疾病復(fù)發(fā)進(jìn)展和死亡風(fēng)險(xiǎn),為臨床治療提供新的靶點(diǎn)。Rab35是一種小鳥苷三磷酸酶(GTPase),參與膜運(yùn)輸、細(xì)胞極性、脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)、免疫、吞噬和細(xì)胞分裂等多種細(xì)胞過程[3]。研究表明Rab35在腫瘤細(xì)胞的膜轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分裂增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和免疫逃避中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。有研究報(bào)道,Rab35蛋白在EC的發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移中起到促進(jìn)作用[5]。三結(jié)構(gòu)域蛋白8(TRIM8)是三結(jié)構(gòu)域(TRIM)蛋白家族的成員之一,在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期調(diào)控和腫瘤發(fā)生等方面發(fā)揮作用[6-7]。目前已有研究證實(shí)TRIM8在乳腺癌組織中的表達(dá)低于正常組織,TRIM8低表達(dá)與乳腺癌預(yù)后較差相關(guān)[8],且TRIM8在EC癌組織中表達(dá)失調(diào),并參與了EC的發(fā)生、發(fā)展[9]。本研究檢測(cè)EC癌組織中Rab35、TRIM8的表達(dá),分析其與EC患者臨床病理特征以及預(yù)后的關(guān)系,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年1月至2020年1月本院收治的180例EC患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)術(shù)后病理確診為EC;(2)術(shù)前未接受任何形式的抗腫瘤治療;(3)EC癌組織和癌旁正常子宮內(nèi)膜組織均經(jīng)病理學(xué)證實(shí),癌旁組織無腫瘤細(xì)胞侵犯;(4)年齡18歲以上。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并其他惡性腫瘤或其他器官轉(zhuǎn)移癌;(2)合并嚴(yán)重心、腦血管疾病;(3)合并自身免疫性疾病;(4)臨床資料不完整;(5)失訪。180例EC患者中年齡≥65歲124例,<65歲56例;病理類型:腺癌148例,其他32例;FIGO分期:Ⅰ～Ⅱ期106例,ⅢA期74例;分化程度:低分化113例,中高分化67例;肌層浸潤深度:<1/2有74例,≥1/2有106例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移63例。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(K2016-694),所有患者或其家屬均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1免疫組化法檢測(cè)Rab35、TRIM8表達(dá) 取手術(shù)切除的癌組織以及癌旁子宮內(nèi)膜組織(距離癌組織5 cm以上),10%中性福爾馬林溶液(pH 7.2～7.4)固定組織,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,制作4 μm切片。取石蠟切片,微波加熱,3%過氧化氫水溶液處理石蠟切片15 min,去除內(nèi)源性酶活性和氧化還原劑活性,高溫修復(fù)抗原。加入兔抗人Rab35 單克隆抗體(1∶100稀釋,臺(tái)灣亞諾法生技股份有限公司)、兔抗人TRIM8單克隆抗體(1∶100稀釋,上海西寶生物科技股份有限公司),4 ℃孵育過夜。次日滴加二抗,3,3-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(DAB)顯色,蘇木素細(xì)胞核復(fù)染,脫水,中性樹膠封片鏡下觀察。以PBS代替一抗為陰性對(duì)照組。讀片由本院病理科2名經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師完成,結(jié)合陽性細(xì)胞百分比(0分為≤5%,1分為>5%～25%,2分為>25%～50%,3分為>50%～75%,4分為>75%～100%)和染色強(qiáng)度(無染色0分,淡黃色1分,棕黃色2分,棕褐色3分)評(píng)價(jià)Rab35、TRIM8表達(dá),2個(gè)評(píng)分相乘積分0～7分為表達(dá)陰性,8～12分為表達(dá)陽性。

1.2.2隨訪 Ⅰ期EC患者接受腹腔鏡下筋膜外全子宮雙側(cè)附件切除術(shù),Ⅱ期、Ⅲ期EC患者接受子宮廣泛切除加盆腔淋巴結(jié)清掃以及雙側(cè)附件切除術(shù),Ⅱ期、Ⅲ期EC患者術(shù)后接受輔助放化療。術(shù)后定期門診復(fù)查和電話隨訪,共隨訪3年,隨訪截止至2023年1月。統(tǒng)計(jì)隨訪期間患者總生存情況,總生存時(shí)間定義為確診至死亡或隨訪截止時(shí)間。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)、百分率表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用多因素Logistic回歸分析影響EC患者預(yù)后的因素;采用Kaplan-Meier生存曲線分析EC患者生存情況,比較采用Log-Rankχ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1EC癌組織和癌旁組織中Rab35、TRIM8表達(dá)比較 EC癌組織Rab35表達(dá)陽性率高于癌旁組織(P<0.05),TRIM8表達(dá)陽性率低于癌旁組織(P<0.05),見表1。

表1 EC癌組織和癌旁組織中Rab35、TRIM8表達(dá)比較[n(%)]

2.2不同臨床病理特征EC組織中Rab35、TRIM8表達(dá)比較 FIGO分期ⅢA期、低分化、肌層浸潤深度≥1/2、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的EC患者癌組織Rab35表達(dá)陽性率高于FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、肌層浸潤深度<1/2、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的EC患者(P<0.05);FIGO分期ⅢA期、低分化、肌層浸潤深度≥1/2、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的EC患者癌組織TRIM8表達(dá)陽性率低于FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、肌層浸潤深度<1/2、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的EC患者(P<0.05);不同年齡、病理類型EC患者癌組織的Rab35、TRIM8表達(dá)陽性率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.3不同預(yù)后的EC患者臨床資料比較 所有患者均進(jìn)行了3年隨訪,隨訪期間死亡58例,存活122例,總生存率67.78%。結(jié)果顯示死亡組FIGO分期ⅢA期、低分化、肌層浸潤深度≥1/2、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Rab35表達(dá)陽性、TRIM8表達(dá)陰性的比例高于存活組(P<0.05),見表3。

表3 不同預(yù)后EC患者臨床資料比較[n(%)]

2.4多因素Logistic回歸分析影響EC患者預(yù)后的因素 以EC患者預(yù)后(存活=0,死亡=1)為因變量,以FIGO分期、分化程度、肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Rab35、TRIM8為自變量(賦值見表4),進(jìn)行多因素Logistic回歸分析,回歸采用逐步后退法(α進(jìn)=0.05,α出=0.10)。結(jié)果顯示:FIGO分期ⅢA期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Rab35表達(dá)陽性是EC患者死亡的危險(xiǎn)因素(P<0.05),TRIM8表達(dá)陽性是EC患者死亡的保護(hù)因素(P<0.05)。參見表4。

表4 影響HSCC患者預(yù)后的多因素Logistic回歸分析

2.5不同Rab35、TRIM8表達(dá)EC患者生存分析 Rab35表達(dá)陽性EC患者累積生存率低于Rab35表達(dá)陰性患者(Log-Rankχ2=11.523,P<0.001);TRIM8表達(dá)陽性EC患者累積生存率高于TRIM8表達(dá)陰性EC患者(Log-Rankχ2=9.683,P<0.001)。見圖1。

圖1 不同Rab35、TRIM8表達(dá)EC患者Kaplan-Meier生存曲線

3 討 論

EC是嚴(yán)重威脅女性健康的上皮組織惡性腫瘤之一,盡管手術(shù)、輔助放療和化療提高了早期EC患者的總生存率,但晚期轉(zhuǎn)移患者預(yù)后較差。近年來發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物與EC的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后相關(guān),在EC診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)中具有一定價(jià)值[9-10]。

細(xì)胞依靠細(xì)胞膜運(yùn)輸來維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形狀和細(xì)胞極性,以及器官的結(jié)構(gòu)和功能[11-12]。癌細(xì)胞可改變膜運(yùn)輸,促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲性表型,導(dǎo)致包括EC在內(nèi)的癌癥進(jìn)展[13]。Rab蛋白是進(jìn)化上保守的GTP結(jié)合蛋白,在所有真核細(xì)胞中調(diào)節(jié)細(xì)胞膜內(nèi)運(yùn)輸,控制在癌癥中過度表達(dá)的血小板衍生生長因子受體(PDGFR)、血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)和整合素等生長因子受體的內(nèi)吞運(yùn)輸和再循環(huán),增加癌細(xì)胞增殖的潛力[14-15]。Rab35屬于Rab蛋白家族成員,是一種致癌性GTPase,參與細(xì)胞膜內(nèi)運(yùn)輸、細(xì)胞動(dòng)力學(xué),在惡性腫瘤中Rab35致癌體細(xì)胞突變,通過磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)依賴機(jī)制調(diào)節(jié)PDGFR運(yùn)輸導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化[3],在癌癥侵襲、轉(zhuǎn)移和免疫逃避中發(fā)揮作用[16]。既往研究顯示Rab35在胃癌組織中激活和募集,并促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲[17];Rab35在EC癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)失調(diào),與EC病情進(jìn)展有關(guān)[5]。本研究發(fā)現(xiàn)EC癌組織中Rab35表達(dá)陽性率高于癌旁組織,Rab35表達(dá)陽性與EC低分化、FIGO分期ⅢA期、肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),是EC患者死亡的危險(xiǎn)因素,提示Rab35可能在EC發(fā)病過程中發(fā)揮致癌基因作用。Rab35參與EC的機(jī)制尚不明確,研究顯示PI3K/Akt信號(hào)通路激活促使細(xì)胞周期由S期向G2期轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致EC細(xì)胞增殖[18-19],Rab35蛋白可消除抑制Akt磷酸化和PI3K信號(hào)通路的活性蛋白,能激活PI3K/Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)正常細(xì)胞發(fā)生癌變,并促使癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[3]。因此推測(cè)Rab35可能通過調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路參與EC的發(fā)生和發(fā)展。

TRIM8基因位于10q24.3染色體上,參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、炎癥、先天免疫等調(diào)控,與自身免疫性疾病、心血管疾病、惡性腫瘤等有關(guān)[20]。TRIM8在多種惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào),其表達(dá)缺失與癌癥進(jìn)展有關(guān),比如,TRIM8在乳腺癌中下調(diào),與雌激素受體α水平呈負(fù)相關(guān),TRIM8表達(dá)缺失顯著增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移[21]。TRIM8在腎透明細(xì)胞癌和結(jié)直腸癌中表達(dá)下調(diào),上調(diào)TRIM8可恢復(fù)p53腫瘤抑制作用,導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖減少或阻滯[22]。恢復(fù)TRIM8表達(dá)可顯著降低膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的克隆潛能,TRIM8的轉(zhuǎn)錄抑制與膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后有關(guān)[23]。既往研究發(fā)現(xiàn)TRIM8表達(dá)與EC患者預(yù)后相關(guān)[9]。本研究也發(fā)現(xiàn)EC癌組織中TRIM8表達(dá)陽性率顯著低于癌旁組織,TRIM8表達(dá)陽性率與EC惡性臨床病理特征以及生存率有關(guān),TRIM8可能在EC中發(fā)揮抑癌基因作用。p53信號(hào)通路激活可抑制EC上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,癌細(xì)胞侵襲和遷移[24]。p53突變?cè)贓C中發(fā)揮致癌基因作用,與EC晚FIGO病理分期、肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[25]。TRIM8作為一種p53調(diào)節(jié)劑,可穩(wěn)定p53,通過鈍化N-MYC活性恢復(fù)p53腫瘤抑制功能,促使癌細(xì)胞凋亡[22],TRIM8表達(dá)上調(diào)可能增強(qiáng)p53活性,誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[26]。因此推測(cè)TRIM8表達(dá)陽性可能增強(qiáng)p53腫瘤抑制作用,抑制EC進(jìn)展,改善患者預(yù)后。

綜上所述,EC組織中Rab35表達(dá)陽性率上調(diào),TRIM8表達(dá)陽性率下調(diào),Rab35表達(dá)陽性率增加、TRIM8表達(dá)陽性率降低與EC低分化、FIGO分期ⅢA期、肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及低生存率有關(guān)。Rab35、TRIM8有望成為EC的潛在標(biāo)志物和治療靶點(diǎn),對(duì)EC預(yù)后分析有著積極的意義。