王全慧,潘 彤 綜述,樊 晶審校

天津市血液中心,天津 300110

乙型肝炎表面抗原(HBsAg)是世界衛(wèi)生組織(WHO)公認的判斷乙型肝炎病毒(HBV)感染的關(guān)鍵指標,也是大多數(shù)國家用于血液篩查、臨床診斷的重要指標。隨著分子生物學診斷應(yīng)用于HBV DNA檢測,部分獻血者HBsAg檢測陰性,但體內(nèi)卻仍然存在較低水平的HBV DNA?；谄潆[匿性的特點,隱匿性乙型肝炎病毒感染(OBI)者不容易被早期發(fā)現(xiàn)和治療,導致感染者隱匿性肝損傷。本文就OBI的概念、發(fā)生的分子機制、輸血傳播風險及防范等方面逐一進行綜述。

1 OBI概述

OBI定義為排除HBV感染的窗口期,肝臟存在有復(fù)制能力的HBV DNA[即游離型共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)]和(或)血液中存在HBV DNA。盡管OBI患者在肝臟中存在活躍的HBV DNA復(fù)制,但血液中的HBsAg為陰性,HBV DNA只能間歇性檢測到。根據(jù)HBV特異性抗體譜,OBI可分為血清學陽性的OBI即乙型肝炎核心抗體(抗-HBc)和(或)乙型肝炎表面抗體(抗-HBs)陽性,以及血清學陰性的OBI即抗-HBc和抗-HBs陰性。此外,還有一個OBI患者亞組被稱為“假OBI”,這是HBsAg突變的攜帶者,但在一些常規(guī)檢測方法中無法識別。這些病例表現(xiàn)出HBV DNA水平升高,類似于在HBsAg陽性的HBV感染中發(fā)現(xiàn)的DNA水平[1]。這些患者被S基因突變的變異株感染,被稱為“逃逸變異”。

OBI的診斷是基于HBsAg陰性個體血液標本或肝組織中HBV DNA的檢測。肝臟標本中HBV DNA的檢測結(jié)果為金標準。研究發(fā)現(xiàn),HBV DNA一般僅在血清/血漿中間歇性地檢測到,通常小于200 IU/mL(約1 000 copy/mL)。但事實上,在超過90%的OBI受試者中,血清HBV DNA僅為20 IU/mL左右。

2 OBI發(fā)生的分子機制

2.1病毒因素 HBV是高度變異的DNA病毒,基因突變頻繁發(fā)生。首先HBsAg主要親水區(qū)(MHR,aa100～169)尤其是a 抗原決定簇(aa124～147)發(fā)生的點突變與OBI形成密切相關(guān),且存在較高的突變頻率。第二,S區(qū)的突變與HBV表面蛋白的表達減少有關(guān);在OBI患者中經(jīng)常觀察到preS1/preS2啟動子突變,使得HBsAg無法被檢測到。第三,在OBI患者中發(fā)現(xiàn)剪接步驟對HBV中的基因表達也有關(guān)鍵影響。第四,表觀遺傳學修飾可以在不改變其核苷酸序列的情況下改變基因的表達模式[2]。在HBV雙鏈 DNA啟動子區(qū)和增強子區(qū)含有3個主要的 CpG 島[3],一般呈非甲基化狀態(tài),一旦出現(xiàn)甲基化則導致基因轉(zhuǎn)錄的沉寂。

2.2宿主因素 HBV cccDNA以微小染色體形式穩(wěn)定地存在于肝細胞核中。由于肝細胞較長的半衰期,一旦感染HBV即使發(fā)揮有效的免疫控制,病毒也可能會攜帶終生。絕大多數(shù)OBI患者的肝臟中HBV cccDNA水平較低,但對其HBV病毒株進行體外培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn),cccDNA 可完全恢復(fù)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和合成蛋白的能力。在宿主控制OBI過程中,除了T細胞免疫,B細胞體液免疫反應(yīng)也起很重要的作用。在接受B細胞選擇性單克隆治療(例如利妥昔單抗和非腫瘤單抗)的患者中可頻繁地觀察到HBV再激活[4]。

2.3共同感染 研究顯示,在合并其他病毒感染的情況下,HBV 的復(fù)制表達可能會被影響。特別是感染丙型肝炎病毒(HCV),核心蛋白通過與HBX蛋白和聚合酶之間的相互作用來抑制HBV基因表達和復(fù)制[5],HCV的非結(jié)構(gòu)蛋白2(NS2)及NS5A也會干擾HBV的復(fù)制,從而導致OBI感染發(fā)生。

3 不同人群中OBI流行率

OBI 在世界上廣泛存在,在 HBV 流行率高的地區(qū),獻血人群中 OBI 的流行率也較高。有研究發(fā)現(xiàn)英格蘭獻血者 OBI 流行率極低,小于0.001%[6]。在美國、中歐、北歐和地中海區(qū)域等國家獻血者中OBI流行率為0.002%～0.070%[7-9]。西太平洋和亞馬遜地區(qū)的HBV流行率要高于歐美地區(qū)[10]。據(jù)巴西、阿根廷、日本、東南亞國家等報告,獻血者OBI流行率為0.012%～2.6%[11]。撒哈拉以南非洲地區(qū)的HBV流行率在非洲最高[12-16]。我國幅員遼闊,人口眾多,是HBV高發(fā)區(qū)。HBV感染流行率越高的人群往往會有越多的OBI患者。江蘇省、安徽省、河南省及山東青島等省市最近幾年內(nèi)的報道數(shù)據(jù)顯示獻血者OBI的流行率為0.017%～0.054%[17-20],低于上海、云南、重慶、 浙江溫州等南方地區(qū)的數(shù)據(jù)[21-24]。

最近,南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院徐華國團隊發(fā)表了一項關(guān)于全球OBI流行率的薈萃分析,結(jié)果顯示:一般人群中OBI總流行率為0.82%,艾滋病患者中為16.26%,其他肝病患者中為13.99%,血液透析患者中為4.25%,有其他風險因素的患者中為5.14%[22]。

4 OBI引發(fā)輸血后HBV感染的風險

HBsAg陰性而HBV DNA陽性的血液成分是具有傳染性的,可通過輸血途徑傳播并在臨床得到了確認,但仍是極少報道的事件。在CANDOTTI等[26]的一項研究中,斯洛文尼亞3例HBsAg陰性重復(fù)獻血者使用高度敏感核酸檢測(NAT)未發(fā)現(xiàn)HBV DNA,31例受血者輸注了其血液及血液成分,其中有9例受血者(29%)被確定為感染了HBV。但如果排除7例抗-HBs陽性的受者,感染比例增加到37.5%。有研究認為OBI是輸血傳播鏈上不可忽視的傳染源,可通過輸血傳播感染[27]。最近開發(fā)了一個數(shù)學模型來估計與OBI相關(guān)的輸血殘余傳播風險,該模型基于隨機選擇的OBI供體中病毒載量的概率分布,給定的病毒載量未被NAT檢測到的概率,以及該病毒載量導致受體感染的概率,該模型估計單人份核酸檢測(ID-NAT)(95%LOD:3.4 IU/mL)檢測陰性的OBI獻血者血液可能使受血者輸注含有20 mL血漿的紅細胞而導致感染的概率為3.3%,輸注200 mL新鮮冰凍血漿而導致感染的概率估計增加到14%[28]。

5 OBI輸血傳播風險防范

5.1檢測HBsAg的超敏方法 HBsAg檢測血清學方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、化學發(fā)光免疫分析(CLIA),這是血液篩查最常用的檢測方法。目前大多數(shù)試劑檢測下限為50 mIU/mL。最近開發(fā)了具有更高靈敏度的測定HBsAg的檢測方法,結(jié)合化學發(fā)光酶免疫分析法(CLEIA)和免疫復(fù)合物轉(zhuǎn)移方法的半自動免疫分析系統(tǒng)(ICT-CLEIA),檢測限為0.5 mIU/mL。這種檢測方法可用于自限性HBV患者,識別cccDNA轉(zhuǎn)錄活性和最小HBV復(fù)制,以檢測OBI。SHINKAI等[29]對120例接受全身化療的血液病患者進行的一項研究顯示:通過HBV DNA檢測發(fā)現(xiàn)有13例患者存在HBV的再活化。ICT-CLEIA試驗在這13例出現(xiàn)HBV再激活的患者中檢測到12例HBsAg陽性,甚至有2例HBsAg陽性出現(xiàn)在HBV DNA升高之前。因此,ICT-CLEIA檢測方法成為一種新的超靈敏的HBsAg檢測方法,并可能將窗口期(WP)降低至14 d。

HBsAg試劑除了具有高靈敏度外,對檢測S區(qū)逃逸變異的能力也不同。為了對這些變異進行最佳檢測,HBsAg檢測必須使用針對HBsAg多個表位的抗-HBs探針的檢測方法,以確保檢測到HBV S變異。此外,HBsAg檢測失敗的另一個原因可能是抗-HBs存在時,HBsAg-HBsAb免疫復(fù)合物的形成。在這種情況下,如果使用能夠?qū)BsAg從免疫復(fù)合物中分離出來的方法檢測,一些OBI患者可能會發(fā)現(xiàn)HBsAg呈陽性[30]。

5.2抗-HBc篩查 抗-HBc與HBV感染相關(guān),是HBV感染后最早出現(xiàn)的特異性抗體。對獻血者、器官捐獻者、接受免疫抑制劑治療的個體進行流行病學調(diào)查時,抗-HBc 檢測可用作診斷OBI的替代血清學標志物。研究發(fā)現(xiàn)在HBsAg陰性和抗-HBc陽性的人群中,有0%～4.6%檢測到HBV DNA,中位患病率為1%。在HBV感染低流行國家根據(jù)流行病學背景,酌情實施抗-HBc篩查。在加拿大、法國、德國、愛爾蘭、荷蘭和美國等一些中等/低流行國家,普遍的抗-HBc篩查造成的獻血者損失是可以承受的[31]。另外一些國家為了減少獻血源流失,在抗-HBc中引入抗-HBs檢測,但目前對100 mIU/mL這個閾值還沒有達成一致。日本抗-HBs要求大于200 mIU/mL,加拿大為100 mIU/mL。我國是HBV高流行國家,為了防止獻血源的大量流失,未將抗-HBc篩查列入常規(guī)檢測項目。但基于我國新生兒乙肝疫苗普遍接種近30年,將來在青年隊伍中開展獻血篩查時可考慮增加抗-HBc檢測。

5.3MP-NAT/ID-NAT篩查模式靈敏度差異 目前,我國采供血機構(gòu)普遍采用HBsAg和MP-NAT/ID-NAT篩查來防止HBV輸血傳播。美國學者的一項關(guān)于獻血者綜合研究表明,在404例確認OBI獻血者中,MP-NAT混樣檢測只檢測出43例(43/404,10.6%),大多數(shù)OBI獻血者(361/404,89.4%)只能通過ID-NAT檢測出[32]。MP-NAT為6或8個供體血漿混合標本檢測模式,混樣過程中引入的稀釋因子降低了HBV NAT的靈敏度,所以即使進行NAT篩查后,OBI獻血者仍然對血液安全構(gòu)成潛在的威脅。另外,YE等[33]研究中還觀察到MP-NAT檢測陽性的42個pool,拆分檢測時未檢出陽性標本,當使用定量PCR(qPCR)和巢式PCR檢測時,17份標本被確定為OBI。在低流行的發(fā)達國家,HBsAg、抗-HBc和HBV NAT的實施提供了最佳的血液安全水平,能篩查出急性感染的早期階段,可檢測到潛在的間歇性病毒血癥的隱匿性感染以及病毒變異。此外,在中度和高流行率國家由于抗-HBc還不能實施,ID-NAT應(yīng)該是首選。

5.4血液制品的病毒滅活 對血液制品進行病毒滅活是保證輸血安全的另一道防線,是輸血領(lǐng)域研究的熱點。OBI通過輸血方式傳播HBV是一項重要的公共衛(wèi)生問題,即便在發(fā)達國家也存在輸血傳播的風險,因為導致人類HBV感染的最低病毒載量低于當前使用的最敏感NAT的檢測下限。在血液制品制備過程中或者臨床輸血前實施病原體滅活程序,既能保障血液成分又能降低感染性疾病傳播的概率,可以最大程度上保證輸血安全性。目前國內(nèi)采供血機構(gòu)廣泛使用的有亞甲藍光化學法血漿病毒滅活技術(shù)。亞甲藍是一種光敏劑,可以與病毒的核酸以及病毒的脂質(zhì)包膜相結(jié)合,在可見光的作用下發(fā)生化學反應(yīng),使病毒的核酸斷裂,包膜結(jié)構(gòu)破損,從而達到病毒滅活的效果。病原體滅活技術(shù)不僅能有效滅活血漿中常見的重要病毒如HBV、HCV、人類免疫缺陷病毒和人類T細胞白血病病毒(HTLV)等,也被證實可以有效去除包括西尼羅病毒(WNV)、登革病毒(DENV)、寨卡病毒(ZKV)以及新型冠狀病毒(SARS)。在發(fā)達國家,病原體滅活技術(shù)目前應(yīng)用于新鮮冰凍血漿和血小板濃縮物,但仍無法用于紅細胞濃縮物。對經(jīng)過處理后血液成分功能方面的影響,也存在一些爭議。

6 OBI對乙肝消除戰(zhàn)略的挑戰(zhàn)

2016年,WHO通過了《全球衛(wèi)生部門戰(zhàn)略》,旨在到2030年消除病毒性肝炎。WHO的目標是到2030年將肝炎發(fā)病率減少到90萬例,并將每年因肝炎死亡的人數(shù)從140萬例減少到50萬例。為此目的,WHO正在幫助不同的國家制定肝炎控制規(guī)劃。文件列出了到2030年消除肝炎的5個領(lǐng)域,其中大多數(shù)以HBV為目標。重點領(lǐng)域如下:(1)擴大針對HBV的疫苗接種覆蓋率及實行病原體減少程序;(2)預(yù)防HBV性傳播;(3)減少靜脈注射傳播;(4)降低OBI傷害和減少合并感染;(5)擴大對HBV和HCV的檢測和治療。除了增加預(yù)防性疫苗接種的覆蓋率之外,WHO還建議增加對HBV感染的早期診斷和治療。提高HBsAg檢測診斷的靈敏度也將有助于檢測“假OBI”,檢測HBV DNA最敏感的方法通常用于血液篩查。在與OBI和消除HBV有關(guān)的主要挑戰(zhàn)中,有以下幾方面的需求:開發(fā)檢測OBI的靈敏度更高、特異度更高和標準化的檢測方法;可以通過篩查抗-HBc、HBV DNA(0.15 IU/mL)或病原體減少法處理血液成分來提高血液安全性;開發(fā)出旨在消除cccDNA及其相關(guān)表觀遺傳變化的治療方法,以減少臨床進展和OBI傳播。

7 總 結(jié)

我國是HBV感染高流行地區(qū),OBI在輸血安全中的隱患不容忽視,在獻血人群中潛在相當數(shù)量的OBI患者,對輸血安全造成極大威脅。目前還存在以下3方面問題:(1)國外已經(jīng)對OBI獻血者造成感染的臨床病例進行了深入研究,但目前我國OBI獻血者造成的輸血傳播風險尚無臨床數(shù)據(jù),需要采供血機構(gòu)聯(lián)合臨床用血單位開展輸血后風險評估的研究,監(jiān)測OBI引發(fā)的輸血傳播風險。(2)同時也應(yīng)該開發(fā)更靈敏、標準化和經(jīng)過驗證的檢測HBsAg的方法,包括檢測 HBV S變異體和存在抗-HBs免疫復(fù)合物中的HBsAg。(3)提高核酸檢測靈敏度。防止輸血傳播HBV所需的NAT靈敏度需要從目前的3.4 IU/mL降低到一個新的檢測下限(0.15 IU/mL)。實施有效的血液安全監(jiān)測體系,包括系統(tǒng)地收集和長期存儲患者的輸血前血漿標本,用于HBV傳播監(jiān)測和患者的治療管理。OBI感染者情況錯綜復(fù)雜,應(yīng)該綜合各種檢測技術(shù)對獻血者的血液質(zhì)量進行全方位的監(jiān)測、評估,以保證臨床用血安全。