黃艷云,陸青蘭,韋必曉,楊麗娜,黃榮透

廣西壯族自治區(qū)百色市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣西百色 533000

腦梗死(IS)是一種致殘率高、致死率高的復(fù)雜性腦血管疾病,微小RNA (miRNA)在其發(fā)病與進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用[1]。作為一種基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控因子,miRNA能夠調(diào)控目標(biāo)mRNA的表達(dá)從而介入多種生命活動(dòng)如細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂、衰退或發(fā)育等[2]。miRNA被廣泛視為多種癌癥的抑制因子,其在腫瘤生長(zhǎng)發(fā)育、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用[3-4]。此外,miR-145也被證明是血管平滑肌細(xì)胞最豐富的miRNA,其水平相對(duì)較小的變化會(huì)顯著影響血管穩(wěn)態(tài),與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[5-7]。以往的諸多研究結(jié)果表明,miR-145在IS患者中表達(dá)失衡,其異常表達(dá)在IS病理學(xué)中起著至關(guān)重要的作用,或?qū)⒊蔀镮S的生物標(biāo)志物和(或)治療目標(biāo)[8-12]。但導(dǎo)致miR-145在IS中表達(dá)失衡的分子機(jī)制尚不清楚。單核苷酸多態(tài)性(SNP)可能是miR-145調(diào)控的重要因素。已有多項(xiàng)研究表明,miR-145基因SNP與多種疾病的易感性有關(guān),并影響miR-145的表達(dá)[5,7,9,13]。鑒于此,本研究篩選了miR-145基因中次要等位基因頻率較高且與多種疾病易感性有關(guān)的rs41291957、rs353291位點(diǎn),探討其與IS的關(guān)系,并評(píng)估m(xù)iR-145在IS患者中的表達(dá)及其與這2個(gè)位點(diǎn)SNP之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 從2021年1-12月在本院神經(jīng)內(nèi)科住院患者中篩選出253例初次確診為IS的患者,其中男153例、女100例,平均年齡(63.4±11.1)歲。IS診斷符合《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2018》中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn),并經(jīng)過(guò)臨床、實(shí)驗(yàn)室及射影像學(xué)等一系列檢查綜合確診。另選取同期在本院體檢中心體檢的275例健康者作為對(duì)照組,其中男147例、女128例,平均年齡(61.9±9.5)歲。兩組性別、年齡比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。排除標(biāo)準(zhǔn):腦出血、顱內(nèi)感染、腫瘤、自身免疫性疾病和傳染類疾病;患嚴(yán)重影響肝、腎、心功能的疾病。這些個(gè)體都是非親緣關(guān)系的廣西地區(qū)人口。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有研究對(duì)象均對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1收集標(biāo)本 收集所有研究對(duì)象清晨空腹靜脈血3～5 mL(EDTA-K2抗凝),用于基因組DNA提取和單個(gè)核細(xì)胞的分離。所有標(biāo)本存儲(chǔ)于-70 ℃冰箱備用。

1.2.2基因組DNA提取和分析 使用由重慶中元匯吉生物技術(shù)股份有限公司供應(yīng)的核酸提取試劑盒(磁珠法)進(jìn)行全血基因組DNA檢測(cè),并嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作。在完成DNA樣本提取后使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其質(zhì)量和濃度。

1.2.3引物的設(shè)計(jì)與合成 利用NCBI搜索含有rs41291957、rs353291位點(diǎn)的長(zhǎng)度適宜的DNA片段,然后使用Prime 3.0軟件為這些片段設(shè)計(jì)引物,并將其交給北京擎科生物科技公司來(lái)生產(chǎn),而探針引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列信息如表1所示。

表1 rs41291957、rs353291引物序列信息

1.2.4rs41291957、rs353291位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè) 采用TaqMan探針?lè)晒舛縋CR檢測(cè)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為上、下游引物各0.4 μL,探針引物0.2 μL,2×AceQ qPCR Probe Master Mix(Vazyme)10 μL,DNA模板1 μL,加雙蒸水至總體積20 μL。按照上述體系完成加樣后,把加好樣品的反應(yīng)板置于德國(guó)Analytik Jena qTOWERE 2.2熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。PCR循環(huán)參數(shù):95 ℃預(yù)變性反應(yīng)3 min,然后40個(gè)循環(huán)(95 ℃變性15 s,56 ℃復(fù)性15 s,72 ℃延伸20 s)。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線的峰型和信號(hào)強(qiáng)度并結(jié)合人工校驗(yàn)進(jìn)行基因型判斷,以保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.2.5外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-145水平的檢測(cè) 利用Trizol技術(shù)從外周血單個(gè)核細(xì)胞中提取總RNA,提取產(chǎn)物使用紫外分光光度計(jì)評(píng)估其純度,如果A260/A280落在1.9～2.1,則該RNA樣本滿足實(shí)驗(yàn)要求。接著,采用由寶生物工程(大連)公司提供的試劑盒來(lái)檢測(cè)基因mRNA的表達(dá)水平。然后采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit,Takara)將RNA合成為cDNA,再根據(jù)cDNA 2 μL、SYBR Advantage Premix 12.5 μL、正向及反向引物各0.5 μL、ROX Dye 0.5 μL、去離子水9 μL的比例進(jìn)行PCR。使用相對(duì)定量分析2-ΔΔCt法計(jì)算miR-145相對(duì)表達(dá)水平。

1.3觀察指標(biāo) (1)比較IS組和對(duì)照組rs41291957、rs353291位點(diǎn)多態(tài)性分布情況。(2)比較IS組和對(duì)照組miR-145水平。(3)分析rs41291957、rs353291位點(diǎn)不同基因型研究對(duì)象的miR-145水平。

2 結(jié) 果

2.1兩組rs41291957、rs353291多態(tài)性遺傳平衡評(píng)估 IS組和對(duì)照組rs41291957、rs353291的基因型分布均符合Hardy-Weinberg 平衡定律的要求(P>0.05),具有群體代表性。見表2。

表2 兩組rs41291957、rs353291多態(tài)性Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)結(jié)果

2.2不同性別研究對(duì)象miR-145基因rs41291957、rs353291多態(tài)性分布情況比較 IS組和對(duì)照組中,不同性別間rs41291957、rs353291基因型及等位基因的分布頻率比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組不同性別研究對(duì)象miR-145基因rs41291957、rs353291多態(tài)性分布情況比較[n(%)]

2.3IS組和對(duì)照組miR-145基因rs41291957、rs353291多態(tài)性分布情況比較 rs41291957、rs353291位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率在IS組與對(duì)照組間比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 兩組間rs41291957、rs353291多態(tài)性分布情況比較[n(%)]

2.4IS組和對(duì)照組miR-145水平比較 IS組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-145水平為4.68±1.02,顯著高于對(duì)照組的2.70±0.83,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

2.5miR-145基因rs41291957、rs353291位點(diǎn)不同基因型miR-145水平比較 對(duì)IS組或?qū)φ战M進(jìn)行組內(nèi)分析,rs41291957和rs353291位點(diǎn)各基因型之間miR-145水平比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 miR-145基因rs41291957、rs353291位點(diǎn)不同基因型miR-145水平比較

3 討 論

IS被確定為一種復(fù)雜的腦血管疾病,受各種環(huán)境和遺傳因素的影響。SNP是人類基因組中最常見的遺傳變異類型。位于miRNA中的SNP被稱為miRSNPs,這種miRSNPs可能通過(guò)改變自身的轉(zhuǎn)錄翻譯過(guò)程或?qū)iRNA-mRNA的相互作用施加影響來(lái)發(fā)揮作用,從而影響個(gè)體患病的風(fēng)險(xiǎn)[14-15]。目前已有多個(gè)miRSNPs被證明與IS風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)[16-17]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),miR-145基因rs41291957和rs353291 SNP不僅與慢性腎臟疾病[18]、腹主動(dòng)脈瘤[19]等多種疾病的易感性相關(guān),而且與動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈疾病的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[5,7]。由于IS的重要病理學(xué)基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化,因此,miR-145的 rs41291957、rs353291位點(diǎn)SNP可能在IS發(fā)生中起作用。為此,本研究在廣西人群中進(jìn)行了二者之間的相關(guān)性研究。本研究結(jié)果顯示,miR-145基因rs41291957、rs353291位點(diǎn)在IS組和對(duì)照組中均存在AA、AG、GG 3種基因型,且這2個(gè)位點(diǎn)在IS組和對(duì)照組中的基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。這表明所選擇的研究樣本可以有效地反映這2個(gè)SNP位點(diǎn)存在于目標(biāo)人口的情況,具有群體代表性,且這種多態(tài)性在群體中不存在性別間的差異。但是rs41291957和rs353291的基因型頻率和等位基因頻率分布在IS組與對(duì)照組間比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),提示miR-145 rs41291957和rs353291多態(tài)性不會(huì)影響廣西人群IS發(fā)病。與上述研究結(jié)果相比,本研究結(jié)果未發(fā)現(xiàn)這2個(gè)SNP與IS易感性有關(guān)聯(lián),可能的原因是本研究與上述研究的疾病和人群不同。即便同一種疾病,也會(huì)因研究人群的不同導(dǎo)致結(jié)果不一致。不同的地理、種族群體因遺傳背景相差較大,往往具有獨(dú)特的遺傳易感性位點(diǎn)。例如,WEI等[9]報(bào)道,miR-145基因rs4705342 TC/CC基因型與中國(guó)南方漢族人群IS風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān);然而,ZHU等[20]報(bào)道,rs4705342 SNP與中國(guó)北方漢族人群IS風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)。

近幾年多項(xiàng)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-145在IS患者中差異表達(dá)與IS的發(fā)生密切相關(guān),miR-145有望成為一種新的無(wú)創(chuàng)的特異性生物標(biāo)志物來(lái)識(shí)別IS[8,11]。本研究數(shù)據(jù)也顯示,IS組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-145水平顯著高于對(duì)照組,這與以往的研究結(jié)果一致,支持miR-145可能是新一代IS預(yù)測(cè)指標(biāo)的觀點(diǎn)。目前,關(guān)于miR-145與IS的研究主要集中在miR-145水平及其調(diào)控機(jī)制上,但導(dǎo)致其在IS中表達(dá)失調(diào)的分子機(jī)制鮮有研究。SNP可能是miR-145調(diào)控的重要因素。已有多項(xiàng)研究表明,miR-145基因rs41291957、rs353291位點(diǎn)與多種疾病的易感性相關(guān),并影響miR-145的表達(dá)。例如,HALL等[5]研究發(fā)現(xiàn),rs41291957 A等位基因的存在與成熟miR-143和miR-145水平顯著增加有關(guān),并影響冠狀動(dòng)脈疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。另有研究報(bào)道,與miR-145 rs353291 TT基因型的個(gè)體相比,C等位基因攜帶者對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的易感性增加且miR-145水平降低[7]。這些研究結(jié)果表明,miR-145基因rs41291957、rs353291位點(diǎn)與miR-145水平之間存在明顯的基因型、表型相關(guān)性。然而遺憾的是,本研究在對(duì)IS組或?qū)φ战M進(jìn)行組內(nèi)分析時(shí),這2個(gè)位點(diǎn)各基因型之間miR-145水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),提示rs41291957和rs353291位點(diǎn)SNP對(duì)miR-145的水平不具有調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果與其他研究結(jié)果相反,這可能是同一個(gè)SNP在不同疾病中調(diào)控機(jī)制不同的原因,miR-145在IS中異常表達(dá)可能是其他分子機(jī)制引起的。

綜上所述,本研究進(jìn)一步確認(rèn)miR-145在IS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中水平升高,為其作為IS潛在的生物診斷標(biāo)志物提供了支持。但是,miR-145基因rs41291957、rs353291位點(diǎn)多態(tài)性與IS易感性不存在關(guān)聯(lián)性,且對(duì)miR-145水平也不具有調(diào)節(jié)作用?；蚨鄳B(tài)性在不同種族及地理人群間存在異質(zhì)性,本研究只針對(duì)廣西地區(qū)人群,該結(jié)論可能不適用于其他種族和其他地區(qū)群體?，F(xiàn)階段的文獻(xiàn)中幾乎沒有涉及miR-145基因rs41291957、rs353291多態(tài)性與IS遺傳風(fēng)險(xiǎn)之間關(guān)聯(lián)的研究報(bào)告,兩者之間是否有關(guān)聯(lián),還需要更多的數(shù)據(jù)支持,包括從更多地域和民族背景的人口或者更大規(guī)模的團(tuán)隊(duì)中收集信息。