周雙艷 黃垚心 李 鑫 白佳慧 袁 帥

（重慶郵電大學(xué)生物信息學(xué)院，大數(shù)據(jù)生物智能重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400065）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD），俗稱老年癡呆癥，是一種典型的神經(jīng)退行性疾病，主要病理特征是腦萎縮和腦細(xì)胞死亡。該病自1906 年被首次報(bào)道以來已有百年之久［1］，但到目前為止有關(guān)AD 的發(fā)病原因仍未明確，這給AD 的治療及藥物研發(fā)帶來了巨大的挑戰(zhàn)，有上百種藥物在研發(fā)階段紛紛宣告失敗。AD藥物研發(fā)的困難很大程度上可歸結(jié)為極為復(fù)雜的AD發(fā)病機(jī)制。截至目前，學(xué)術(shù)界為解釋AD的發(fā)病機(jī)制提出了諸多假說，如β 淀粉樣蛋白（amyloid beta protein，Aβ）級聯(lián)學(xué)說、Tau 蛋白異常磷酸化學(xué)說、膽堿能學(xué)說、神經(jīng)炎癥等［2］。盡管這些學(xué)說的聚焦點(diǎn)有所差異，但由此也說明AD的發(fā)病可能為多因素協(xié)同致病。此外，有研究表明，一些周邊及全身性的異常與AD 有關(guān)，并推測AD 不止是一種腦部疾病，而是一種全身性的疾?。?］。AD復(fù)雜的病因無疑加重了治療藥物研發(fā)困難。圍繞AD發(fā)病機(jī)制的各種學(xué)說，目前抗AD藥物研發(fā)的主流策略包括清除沉積的β淀粉樣斑塊［4］、調(diào)節(jié)膽堿能系統(tǒng)［5］、減少炎癥反應(yīng)和氧化損傷［6］以及多靶點(diǎn)治療策略［7］等。然而，近些年來在這些策略的指導(dǎo)下，僅有Aducanumab、Lecanemab 被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)上市［8-9］。這兩款藥物均由渤健和衛(wèi)材公司聯(lián)合開發(fā)，是通過清除AD患者大腦內(nèi)β淀粉樣斑塊而發(fā)揮作用的單克隆抗體藥物。面對AD藥物研發(fā)的嚴(yán)峻形式和挑戰(zhàn)，如何從困境中尋找新的突破點(diǎn)仍然是AD藥物研發(fā)的重要方向。有研究表明，人體內(nèi)轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白（transthyretin，TTR）對AD具有神經(jīng)保護(hù)作用，這種神經(jīng)保護(hù)作用能夠延緩AD的疾病進(jìn)程［10-12］。這一發(fā)現(xiàn)在一定程度上可為AD的藥物設(shè)計(jì)提供新的思路。

TTR是一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，負(fù)責(zé)甲狀腺素和視黃醇在人體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)工作［13］。正常情況下，TTR 是一種同源四聚體蛋白，其四聚體結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定。但當(dāng)TTR四聚體解離成單體后，TTR單體會迅速發(fā)生錯(cuò)誤折疊并聚集形成淀粉樣纖維，最終導(dǎo)致TTR 淀粉樣變性，如淀粉樣心肌癥。盡管TTR 的錯(cuò)誤折疊與TTR淀粉樣變性密切相關(guān)，但多項(xiàng)證據(jù)表明，TTR對AD具有神經(jīng)保護(hù)作用。一方面，與健康同齡人相比，AD患者腦脊液及血漿中TTR含量明顯降低［14-16］，且腦脊液中TTR水平與AD的嚴(yán)重程度和老年斑的含量呈負(fù)相關(guān)［17］。此外，Buxbaum等［18］報(bào)道，在APP23 轉(zhuǎn)基因AD 小鼠模型中過表達(dá)人類野生型TTR基因能夠抑制小鼠模型AD的疾病進(jìn)程。這些研究結(jié)果均證明TTR直接參與了AD的發(fā)病過程。另一方面，已有研究表明，TTR 對AD 的這種神經(jīng)保護(hù)作用主要體現(xiàn)在TTR 能夠與Aβ 發(fā)生相互作用并抑制Aβ 的聚集和細(xì)胞毒性［19-20］。Aβ 是一種AD 相關(guān)蛋白，其毒性聚集體是AD 患者大腦中淀粉樣斑塊的主要成分。鑒于TTR 與Aβ 之間相互作用對AD 的神經(jīng)保護(hù)作用，研究者們紛紛開展了相關(guān)的研究。

近期，Cotrina等［21］提出了一種靶向TTR的抗AD藥物研發(fā)策略。他們通過計(jì)算機(jī)藥物再利用和體外生物分析方法篩選了一組能夠作為分子伴侶增強(qiáng)TTR/Aβ 相互作用的小分子化合物，其中3 個(gè)作為藥物再利用的上市藥能夠直接進(jìn)入臨床階段成為AD 候選藥物。Cotrina 等［22］也通過量熱研究確定了一個(gè)能夠增強(qiáng)TTR/Aβ 相互作用的小分子伴侶。除小分子伴侶的策略外，Tonali 等［23］提出將蛋白質(zhì)水解靶向嵌合體（proteolysis targeting chimera，PROTAC）方法用來治療AD。該方法是一種多功能多靶點(diǎn)治療策略，其原理同樣是靶向增強(qiáng)TTR/Aβ 之間蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用從而更好地發(fā)揮TTR的神經(jīng)保護(hù)作用。這些研究都表明，增強(qiáng)TTR與Aβ 之間的相互作用可作為潛在的抗AD 藥物研發(fā)策略。

在TTR/Aβ 作用機(jī)制研究方面，Du 等［24］研究表明，TTR 單體是Aβ 單體的主要結(jié)合對象，而TTR四聚體則更易與Aβ聚集體結(jié)合。Saelices課題組［19］最近的一項(xiàng)研究則表明，TTR四聚體主要通過與Aβ 單體結(jié)合的方式將單體“扣押”來達(dá)到抑制Aβ聚集的效果，而只有解離后的TTR單體才能與Aβ 的低聚體結(jié)合并誘導(dǎo)其進(jìn)一步形成更高聚合度的無毒聚集體。這一結(jié)論與此前Garai 等［25］的報(bào)道一致。與Saelices 等的結(jié)論不同，Ghadami等［26］研究表明，TTR 四聚體和單體都能與Aβ 低聚體結(jié)合，二者主要通過抑制Aβ 的初級成核和二級成核過程來抑制Aβ 低聚體的毒性和纖維增長能力。因此，到目前有關(guān)TTR與Aβ發(fā)生相互作用的結(jié)構(gòu)形式仍沒有確定性的結(jié)論。此外，在TTR 與Aβ 相互作用過程中，TTR105-117、TTR38-42以及TTR結(jié)構(gòu)中的β折疊鏈A、EF螺旋片段等是目前報(bào)道的能夠與Aβ發(fā)生相互作用的重要片段［27-29］。

上述研究在一定程度上提供了TTR與Aβ 相互作用的線索，但二者作用的詳細(xì)機(jī)制仍然未知，且現(xiàn)有研究以宏觀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)為主，微觀層面上Aβ 與TTR 作用的結(jié)構(gòu)動力學(xué)及熱力學(xué)信息不足?；诖?，本工作擬采用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對接及分子動力學(xué)模擬方法從分子水平上來探究TTR與Aβ的相互作用。相比宏觀實(shí)驗(yàn)技術(shù)，分子動力學(xué)模擬能提供原子分辨率上二者相互作用過程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)隨時(shí)間變化的動力學(xué)信息，以期從微觀角度闡釋TTR與Aβ相互作用的分子機(jī)制，從而為基于TTR神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制的抗AD藥物設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備

Aβ 聚集體的結(jié)構(gòu)從PDB 結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中獲得（PDB ⅠD：5OQV［31］）。該結(jié)構(gòu)是一個(gè)通過冷凍電鏡技術(shù)輔以固體NMR 實(shí)驗(yàn)獲得的近原子分辨率的纖維聚集體結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)中所有42 個(gè)殘基的骨架和幾乎所有的側(cè)鏈在冷凍電鏡密度圖中都得到很好的解析。因此，該結(jié)構(gòu)能夠提供相對完整的Aβ 聚集體的結(jié)構(gòu)信息。研究表明，較小的可溶性Aβ 低聚體是Aβ細(xì)胞毒性的主要形式［32］，因此本工作以五聚體作為Aβ低聚體的代表形態(tài)進(jìn)行研究（圖1b）。此外，PDB ⅠD 為1F41 的晶體結(jié)構(gòu)［33］被用于構(gòu)建TTR四聚體及單體的結(jié)構(gòu)，該晶體結(jié)構(gòu)為1.30 ?分辨率下的野生型TTR 二聚體三維結(jié)構(gòu)。因此，TTR 單體通過提取1F41 結(jié)構(gòu)中的單體坐標(biāo)獲得，而TTR 四聚體則通過在VMD 中執(zhí)行1F41 的旋轉(zhuǎn)矩陣獲得。TTR 單體及四聚體結(jié)構(gòu)分別如圖1c 和圖1d所示。

1.2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對接

為了獲得用于描述TTR/Aβ相互作用的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的分子對接。在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對接過程中，本文采用了HawkDock在線網(wǎng)站（http://cadd.zju.edu.cn/hawkdock/）。HawkDock是侯廷軍教授課題組開發(fā)的用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對接的在線網(wǎng)站，能夠?qū)崿F(xiàn)1 000個(gè)氨基酸以內(nèi)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對接并預(yù)測蛋白質(zhì)作用的關(guān)鍵殘基［34］。為探究TTR及Aβ不同結(jié)構(gòu)形態(tài)對二者相互作用的影響，分別對TTR單體/Aβ單體、TTR四聚體/Aβ單體、TTR單體/Aβ五聚體及TTR四聚體/Aβ五聚體進(jìn)行了分子對接，各體系分別標(biāo)記為AβTTRM、 AβTTRT、 AβOTTRM 和AβOTTRT。由于正常情況下Aβ 單體為非結(jié)構(gòu)多肽，具有形態(tài)多樣的特點(diǎn)。因此，為考慮Aβ 單體構(gòu)象的影響，首先對Aβ 進(jìn)行200 ns 的分子動力學(xué)模擬，并對模擬軌跡進(jìn)行聚類分析，提取聚類含量最高的三類作為初始構(gòu)象進(jìn)行分子對接（圖1a），對接后選取各構(gòu)象打分最高的作為對接復(fù)合物的代表構(gòu)象。針對Aβ 五聚體體系則分別選用打分較高的前三類作為復(fù)合物的代表構(gòu)象。各體系對接結(jié)果如圖2所示。

1.3 分子動力學(xué)模擬

為了深入探究TTR與Aβ的相互作用過程，進(jìn)一步對各體系進(jìn)行了分子動力學(xué)模擬，用于模擬的初始結(jié)構(gòu)為上述分子對接所得的各體系的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。在模擬文件準(zhǔn)備中，AMBER FF14SB 力場［35］用于描述蛋白質(zhì)的原子作用。為描述溶劑效應(yīng)，在蛋白質(zhì)周圍增加距蛋白質(zhì)邊緣12 ? 厚度的方形水盒子，水分子用TⅠP3P 水模型［36］描述。隨后，對準(zhǔn)備好的復(fù)合物結(jié)構(gòu)先進(jìn)行了10 000步的能量最小化，用于消除初始結(jié)構(gòu)中不合理的原子接觸。之后，對體系進(jìn)行200 ps的升溫模擬，使體系溫度升至310 K。當(dāng)體系升溫至目的溫度后，在NPT系綜下對體系進(jìn)行500 ps的平衡模擬使得體系各項(xiàng)參數(shù)（密度、能量等）達(dá)到平衡。最后，對平衡后的體系在NPT系綜下進(jìn)行200 ns的軌跡動力學(xué)模擬。模擬過程中的溫度通過Langevin方法控制，壓強(qiáng)通過Langevin Nosé-Hoover方法控制。SHAKE算法用于限制所有含氫鍵的鍵長，非鍵相互作用截?cái)嘀翟O(shè)為10 ?，PME 算法用于計(jì)算長程靜電相互作用。模擬的積分步長為2 fs，模擬過程中每2 000 步（4 ps）輸出一個(gè)結(jié)構(gòu)，200 ns共輸出50 000個(gè)構(gòu)象用于軌跡分析。所有模擬均使用NAMD 2.13 軟件完成［37］。

1.4 結(jié)合自由能計(jì)算

MM-GBSA 方法［38-40］用于評估各體系模擬過程中TTR與Aβ相互作用的結(jié)合親和力。該方法在計(jì)算結(jié)合自由能時(shí)將溶劑視為均勻的連續(xù)介質(zhì)，并基于力場和隱式的連續(xù)介質(zhì)模型對平衡軌跡結(jié)構(gòu)進(jìn)行平均。基于此，選用平衡軌跡的最后20 ns 進(jìn)行MM-GBSA 計(jì)算，計(jì)算過程中每100 ps 提取1 個(gè)快照，共提取了200 個(gè)快照結(jié)構(gòu)用于評估TTR 與Aβ相互作用的強(qiáng)弱。MM-GBSA計(jì)算的公式如下：

其中，ΔEvdw和ΔEele分別表示氣相中的范德華能量項(xiàng)及靜電能量項(xiàng)。這兩項(xiàng)通過在氣相狀態(tài)下的AMBER FF14SB力場下計(jì)算獲得。ΔGpolor和ΔGnonpolor分別代表極性溶劑化能和非極性溶劑化能。極性溶劑化能量項(xiàng)ΔGpolor通過Generalized Born（GB）模型計(jì)算獲得，計(jì)算過程中溶質(zhì)和溶劑的介電常數(shù)分別設(shè)為1 和80。非極性溶劑能量項(xiàng)ΔGnonpolor通過計(jì)算溶劑可極表面積（solvent accessible surface area，SASA）獲得，計(jì)算公式為ΔGnonpolor=γ×SASA。在進(jìn)行SASA 計(jì)算時(shí)，水分子的探針設(shè)置為1.4 ?，表面張力常數(shù)γ為0.007 2 kcal/（mol·?2）。隨后，進(jìn)一步將結(jié)合自由能分解到每個(gè)殘基上以此來確定TTR 與Aβ 相互作用過程中的重要?dú)埢?。MMGBSA計(jì)算所用軟件為AMBER 18［41］。

2 結(jié)果

2.1 TTR與Aβ相互作用模式分析

研究表明，TTR 及Aβ 的結(jié)構(gòu)形態(tài)能夠影響二者的相互作用?；谶@一依據(jù)，通過分別對不同結(jié)構(gòu)形態(tài)的TTR及Aβ進(jìn)行分子對接以探究二者的相互作用模式，包括TTR 的單體及四聚體，Aβ 單體及低聚體（五聚體）。對接獲得的復(fù)合物結(jié)構(gòu)如圖2示，圖中分別展示了根據(jù)MM-GBSA方法的對接結(jié)合自由能以及參與形成蛋白質(zhì)界面氫鍵的殘基。

從圖2 中可以看出TTR 單體與3 個(gè)不同Aβ 單體構(gòu)象的結(jié)合自由能整體較高，分別為-35.06 kcal/mol、-37.52 kcal/mol以及-38.54 kcal/mol（均為各Aβ單體構(gòu)象打分最高的結(jié)合模式）。其中，AβTTRM 體系的Model1復(fù)合物結(jié)構(gòu)中Aβ 單體結(jié)合在TTR 單體的F 折疊鏈，Model2復(fù)合物結(jié)構(gòu)中Aβ 單體主要結(jié)合在TTR 單體的DAGH β 折疊片層界面上，該界面在TTR 四聚體中被包裹在內(nèi)部，是甲狀腺素（thyroxine，T4）疏水結(jié)合通道的組成部分，Model3復(fù)合物結(jié)構(gòu)中Aβ 主要結(jié)合在TTR單體EF 螺旋（圖1c） 及其周圍殘基位置。AβTTRT體系中第一個(gè)構(gòu)象與TTR四聚體的結(jié)合自由能打分最高，為-32.33 kcal/mol，這一結(jié)合模式中Aβ單體結(jié)合在TTR四聚體的T4結(jié)合位點(diǎn)的通道中。AβTTRT體系其他兩個(gè)構(gòu)象在TTR四聚體上的結(jié)合位點(diǎn)大致相同，大致位于T4 結(jié)合通道側(cè)面的凹槽部位，與TTR 四聚體結(jié)構(gòu)中的視黃醇結(jié)合蛋白結(jié)合位點(diǎn)接近［42］，這一位點(diǎn)包括EF 螺旋loop區(qū)、AB loop 區(qū)、GH loop 區(qū)等。并且，視黃醇結(jié)合蛋白也曾被報(bào)道能夠參與TTR 抑制Aβ 聚集的過程［43］。

在Aβ 五聚體與TTR單體及四聚體的對接體系中，復(fù)合物的代表構(gòu)象為打分較高的前3個(gè)結(jié)合模式，可以看出AβOTTRM 及AβOTTRT 體系的Model3親和力均較低，分別為-6.72 kcal/mol 和-1.85 kcal/mol，表明這兩個(gè)模式均不利于TTR 與Aβ 五聚體的結(jié)合。有趣的是，在AβOTTRM 體系中Model1的結(jié)合親和力非常高，為-48.47 kcal/mol，在這一結(jié)合模式中TTR 單體的β 折疊鏈H 與Aβ 五聚體的β折疊邊鏈之間形成了較多的氫鍵，包括骨架氫鍵和側(cè)鏈氫鍵，這些氫鍵的形成能夠在一定程度上穩(wěn)定TTR 單體與Aβ 五聚體的作用，尤其是TTR 單體與Aβ 五聚體β 折疊鏈之間的骨架氫鍵，表明TTR單體具有參與Aβ聚集并形成更高聚合度復(fù)合物的潛力。值得一提的是，兩個(gè)TTR單體的H鏈通過骨架氫鍵形成具有分子間β折疊片層的TTR二聚體［44］，TTR 二聚體進(jìn)一步組合形成了TTR 四聚體。這表明TTR單體中的H鏈?zhǔn)禽^好的β折疊鏈結(jié)合部位，與本工作的結(jié)果相符。AβOTTRM體系的Model2中TTR單體結(jié)合在Aβ五聚體β片層的平面之上，參與作用的殘基主要為帶電氨基酸，包括Arg（R）、Asp（D）和Glu（E）。表明靜電作用力是該模式的重要作用力類型。AβOTTRT 體系中Model1的結(jié)合親和力為-36.28 kcal/mol，主要作用界面為Aβ五聚體β折疊邊鏈與TTR四聚體T4結(jié)合位點(diǎn)通道的側(cè)面凹槽，這與AβTTRT 體系的Model2及Model3中的作用位點(diǎn)大致相同。

2.2 TTR與Aβ相互作用的動力學(xué)模擬

在上述部分，通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)分子對接的方法初步探究了不同結(jié)構(gòu)形態(tài)的TTR及Aβ之間可能的相互作用模式。但在這些模式中，TTR是否能夠與Aβ 持續(xù)穩(wěn)定地發(fā)生作用以及作用過程中是否對二者的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響等仍不清楚。為了探究TTR與Aβ 相互作用的動態(tài)過程，本文進(jìn)一步對各結(jié)合模式分別進(jìn)行了200 ns的分子動力學(xué)模擬。同時(shí)以Aβ 的結(jié)構(gòu)為參照，對Aβ 單體及Aβ 五聚體各進(jìn)行了200 ns 的動力學(xué)模擬，分別記為AβM 和AβO。這里，Aβ 單體的模擬構(gòu)象為圖1a 中最左邊的構(gòu)象，即聚類分析含量最大的構(gòu)象進(jìn)行模擬。

楊譯：...whoever knows the truth can be a teacher.[5]151

首先通過計(jì)算各體系A(chǔ)β單體和五聚體Cα原子的均方根偏差 （root-mean-square deviation，RMSD）來監(jiān)測模擬過程中Aβ 結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，計(jì)算過程中選用各模擬軌跡的第一幀作為參考結(jié)構(gòu)。AβM體系在所有Aβ單體結(jié)合的體系中的RMSD值最大（圖3a），表明TTR 單體及TTR 四聚體與Aβ單體結(jié)合后，在一定程度上限制了Aβ的構(gòu)象變化，使得其更好地維持原有構(gòu)象。除AβOTTRT2 體系在最后40 ns 經(jīng)歷了較大的RMSD 波動外，其他體系的RMSD 曲線接近或低于AβO 體系，基本維持在3 ? 以下（圖3b）。這表明除AβOTTRT2 體系，其他模式下Aβ聚集體與TTR單體和四聚體作用能夠較好地保持Aβ 聚集體的結(jié)構(gòu)，即作用過程中TTR 單體及四聚體對Aβ 聚集體整體結(jié)構(gòu)的影響較小。

Fig. 3 Time evolution of the RMSD of Cα atoms for each simulated system

隨后，為了評估各體系在動態(tài)模擬過程中不同結(jié)構(gòu)形態(tài)的TTR 是否能夠與Aβ 穩(wěn)定作用，利用MM-GBSA 方法分別計(jì)算各體系TTR 與Aβ 之間的結(jié)合自由能（表1）。從表1可以看出在動態(tài)相互作用過程中不同構(gòu)象的Aβ單體與TTR單體和四聚體的結(jié)合自由能較高，且大部分結(jié)合模式相較于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對接中的打分自由能有不同程度的增強(qiáng)，尤其是AβTTRT體系中3個(gè)結(jié)合模式的結(jié)合自由能增加顯著， 分別由對接打分過程中的-32.33 kcal/mol、-18.99 kcal/mol以及-24.19 kcal/mol增 加 到 -43.45 kcal/mol、 -38.47 kcal/mol 和-32.73 kcal/mol。這一結(jié)果表明TTR四聚體在動態(tài)作用過程中能夠通過動態(tài)結(jié)構(gòu)調(diào)整增強(qiáng)其與Aβ 單體的作用，同時(shí)也說明TTR 四聚體具有較強(qiáng)的“扣押”Aβ單體的潛力。

Table 1 Binding free energy for interactions between different structural forms of TTR and Aβ(energy unit: kcal/mol)

對比Aβ 單體體系，在Aβ 低聚體體系中除AβOTTRM 體系的Model1和AβOTTRT 體系中的Model2有較高的結(jié)合自由能外，其他體系的結(jié)合自由能均較低，尤其是AβOTTRM 體系的Model2和AβOTTRT 體系的Model3，結(jié)合自由能分別為-0.42 kcal/mol和2.11 kcal/mol，表明這兩個(gè)作用模式不能持續(xù)穩(wěn)定地結(jié)合。此外，將Aβ 低聚體體系與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對接過程中的結(jié)合自由能打分相比，僅AβOTTRM 體系的Model1保持了較高的結(jié)合強(qiáng)度，為-45.47 kcal/mol，而在AβOTTRT 體系中原來打分較高的Model1在動態(tài)作用過程中結(jié)合自由能強(qiáng)度降低至-16.96 kcal/mol，但原來打分較低的Model2結(jié)合自由能由原來的-10.45 kcal/mol增加至-31.18 kcal/mol。從圖3b的RMSD曲線中可以看出在最后40 ns，Model2結(jié)合模式中的Aβ 五聚體經(jīng)歷了較大的結(jié)構(gòu)變化。因此，推測AβOTTRT Model2結(jié)合自由能的增加與Aβ 五聚體構(gòu)象調(diào)整有關(guān)。

隨后，為了確定TTR與Aβ動態(tài)作用過程中對二者相互作用起關(guān)鍵作用的關(guān)鍵殘基，本文對各體系結(jié)合自由能最高的結(jié)合模式進(jìn)行了殘基能量分解，即將作用過程中總的結(jié)合自由能分解到各個(gè)殘基中。同時(shí)，為了更直觀地觀察模擬后的結(jié)構(gòu)特征，將上述模式的動力學(xué)軌跡進(jìn)行了聚類分析，并提取聚類分析中占比最大的一類作為代表構(gòu)象。殘基能量分解及聚類分析代表構(gòu)象如圖4所示。

Fig. 4 The decomposition of free energy to residues and the representative conformations for system with the highest binding free energy

從圖4中可以看出，AβTTRM體系結(jié)合自由能最高的模式為Aβ單體結(jié)合在TTR單體的DAGH片層界面，且TTR單體中與Aβ單體作用的殘基主要為疏水殘基，包括L17、P24、A108、L110、V121，在Aβ 單體6 個(gè)關(guān)鍵氨基酸中有3 個(gè)為疏水殘基，分別為L17、V18、A21。這表明在該模式中疏水作用力是維持TTR單體與Aβ單體作用重要因素。值得注意的是，此前Du 等［24］通過測定TTR單體與Aβ單體復(fù)合物交聯(lián)肽段的MS/MS譜確定TTR 單體的β 折疊鏈A 及周圍殘基是Aβ 單體的作用位點(diǎn)之一，而Aβ 單體中的中心疏水區(qū)（Aβ17-24）是與TTR單體作用的主要區(qū)域。Du等［24］報(bào)道的TTR 單體作用位點(diǎn)與圖4 中Aβ 單體在TTR單體中的作用部位接近（DAGH 片層包含β 折疊鏈A），且該模式Aβ 單體參與作用的關(guān)鍵殘基（L17、V18、A21） 屬于中心疏水區(qū)殘基。在AβTTRT體系中，模擬過程中結(jié)合自由能最高的模式為Aβ單體結(jié)合在T4結(jié)合位點(diǎn)的通道中，通過殘基結(jié)合自由能分解得到的關(guān)鍵殘基包括M13、E54、H56、R104、T123 等。T4 結(jié)合位點(diǎn)作為Aβ單體的結(jié)合位點(diǎn)也曾被Li 等［45］報(bào)道。他們通過NMR實(shí)驗(yàn)方法監(jiān)測TTR四聚體與Aβ單體作用過程中酰胺-質(zhì)子的化學(xué)位移，發(fā)現(xiàn)二者在作用過程中能夠?qū)е職埢鵐13、V16、A109、L110、A120、V121以及V122發(fā)生明顯的化學(xué)位移變化，這些殘基均屬于T4 結(jié)合位點(diǎn)或附近殘基。盡管本工作通過殘基自由能分解識別的關(guān)鍵作用殘基與Li 等報(bào)道的殘基有所差異，但這些殘基基本位于T4 結(jié)合位點(diǎn)附近，其中M13 為報(bào)道的T4 結(jié)合位點(diǎn)殘基。推測本工作模擬得到的TTR四聚體中與Aβ單體作用的關(guān)鍵殘基與Li 實(shí)驗(yàn)所得殘基之間的差異可能是由Aβ單體的構(gòu)象差異引起的，因?yàn)锳β作為無固定結(jié)構(gòu)多肽，具有結(jié)構(gòu)多樣性的特點(diǎn)。但本工作識別的Aβ 結(jié)合位點(diǎn)與Li 等［45］通過實(shí)驗(yàn)確定的位點(diǎn)基本一致，即T4結(jié)合位點(diǎn)通道可作為“扣押”Aβ單體的位點(diǎn)。

相較而言，Aβ 低聚體與TTR 單體和四聚體的作用與Aβ 單體體系有較大的差距。從結(jié)構(gòu)形態(tài)上來說，與Aβ單體的無序結(jié)構(gòu)不同，Aβ低聚體主要為富含β折疊片層的有序結(jié)構(gòu)。從結(jié)合自由能計(jì)算來看，AβOTTRM體系的3個(gè)結(jié)合模式僅有Model1中的TTR單體與Aβ五聚體維持了相互作用的高親和力。通過對這一模式的結(jié)合自由能進(jìn)行殘基能量分解得到TTR 單體中的關(guān)鍵殘基為T119、A120、V121、V122、T123、N124（圖4），這些殘基主要位于TTR單體的β折疊鏈H，且β折疊鏈H與Aβ五聚體的β 折疊邊鏈（包括殘基D23、V24、G25、S26、N27和K28）形成了穩(wěn)定的β片層結(jié)構(gòu)。一方面，根據(jù)Aβ 聚集過程中的Dock-Lock 機(jī)理［46］，TTR 單體與Aβ 五聚體之間β 折疊片層結(jié)構(gòu)的形成能夠阻止游離Aβ 單體的進(jìn)一步聚集。值得注意的是，近期Sun 等［47］通過分子動力學(xué)模擬的方法揭示αB晶體蛋白可通過覆蓋Aβ聚集體及纖維結(jié)構(gòu)中暴露的β折疊延伸面（即β折疊邊鏈）抑制Aβ的聚集，這與本工作的研究結(jié)果一致。除此之外，Aβ聚集體中與TTR 單體作用的關(guān)鍵殘基基本位于Aβ的13~28 殘基區(qū)間，這與Gimeno 等［48］報(bào)道的Aβ12-28片段是Aβ 識別TTR 的關(guān)鍵區(qū)間的結(jié)論基本一致。TTR單體中除上述β折疊鏈H上的關(guān)鍵殘基外，F(xiàn)87、L110以及Y114在與Aβ五聚體作用過程中也有較突出的貢獻(xiàn)，表明這些殘基同樣能夠影響TTR 單體與Aβ 聚集體之間的相互作用；并且Du等［28］也曾報(bào)道相比野生型TTR，Aβ與F87M/L110M突變TTR 單體之間具有更高的結(jié)合能力，表明殘基F87 及L110 能顯著影響TTR 與Aβ 之間的相互作用。

最后，通過分析Aβ 五聚體與TTR四聚體之間的相互作用發(fā)現(xiàn)原本打分結(jié)合能最高的Model1在模擬過程中結(jié)合自由能降低至-16.96 kcal/mol，而Model2的打分自由能由原來的-10.45 kcal/mol 增加至-31.18 kcal/mol。此外，從圖2b的RMSD曲線及圖4 AβOTTRT體系的代表結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，Model2中Aβ 五聚體的結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大的變化，五聚體N 端的β 折疊片層與其下層β 片層有明顯錯(cuò)位，即在該模式中Aβ五聚體通過構(gòu)象調(diào)整獲得了與TTR四聚體較強(qiáng)的結(jié)合自由能。但值得注意的是，盡管Aβ五聚體構(gòu)象N段上下片層之間的錯(cuò)位，聚集體的β折疊結(jié)構(gòu)較好地被保留，表明該模式下TTR 四聚體并不破壞Aβ低聚體的二級結(jié)構(gòu)。

3 討論

自AD被報(bào)道以來，AD的發(fā)病機(jī)制及抗AD藥物設(shè)計(jì)一直備受學(xué)界關(guān)注，然而截至目前仍沒有有效的預(yù)防及治療策略。TTR對AD所表現(xiàn)出的神經(jīng)保護(hù)作用為AD的治療提供了一種靶向蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的藥物設(shè)計(jì)策略［21，23］。本工作聚焦TTR對AD的神經(jīng)保護(hù)作用，針對性地探究了不同結(jié)構(gòu)形態(tài)的TTR和Aβ之間的相互作用。

本工作通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對接的方式獲得了Aβ 單體及聚集體分別與TTR 單體和四聚體可能的作用模式，并進(jìn)一步通過分子動力學(xué)模擬探究了TTR 與Aβ 相互作用的動態(tài)過程。研究結(jié)果表明，TTR 的單體和四聚體均能與Aβ 單體產(chǎn)生較強(qiáng)的相互作用。針對TTR單體與不同構(gòu)象的Aβ單體之間的相互作用，分子對接獲得的自由能打分整體較高，且能在分子動力學(xué)模擬過程中維持較高結(jié)合親和性（表1）。在本工作重點(diǎn)分析的3 個(gè)TTR 單體與Aβ 單體的作用模式中，Model2和Model3的結(jié)合位點(diǎn)曾被報(bào)道（圖2）。在結(jié)合模式Model2中，Aβ 單體結(jié)合在TTR 單體的DAGH β 折疊片層，該折疊片層是組成TTR 四聚體的二聚體-二聚體作用界面，即該部位被包裹在TTR四聚體內(nèi)部。并且，在分子動力學(xué)模擬過程中Model2在3 個(gè)模式中的結(jié)合自由能最高，為-41.48 kcal/mol。這一模式下，TTR 單體與Aβ 單體動態(tài)作用過程中的關(guān)鍵殘基包括L17、 R21、 G22、 S23、 P24、 A108、L110、T119、V121、T123，這些殘基中L17、R21位于β 折疊鏈A 上，G22、S23 屬于AB loop 區(qū)殘基，A108、L110 位于β 折疊鏈G 上，V121 位于β折疊鏈H上，且TTR的β折疊鏈A和β折疊鏈G也曾被報(bào)道是與Aβ作用的重要位點(diǎn)［24，28］。AβTTRM體系中，Model3結(jié)合模式中Aβ 單體主要作用于TTR 單體的EF 螺旋區(qū)及其周圍殘基，這一位點(diǎn)被報(bào)道為另一個(gè)Aβ 的作用位點(diǎn)［24，49］。他們推測，EF 螺旋及EF loop 可能是Aβ 的感應(yīng)部位，能夠探測并結(jié)合體內(nèi)的Aβ，而Aβ作用于該部位能夠進(jìn)一步誘導(dǎo)TTR 四聚體的構(gòu)象變化，并導(dǎo)致四聚體內(nèi)部Aβ 作用位點(diǎn)（內(nèi)部β 折疊片層，即DAGH 折疊片層）的暴露，從而結(jié)合更多的Aβ［49］。

在Aβ單體與TTR四聚體的研究體系中，同樣有兩個(gè)結(jié)合模式與實(shí)驗(yàn)報(bào)道較為一致，分別為Model1和Model3（圖2）。結(jié)合模式Model1中，Aβ單體結(jié)合在T4結(jié)合通道中，該結(jié)合模式在模擬過程中維持了較高的親和力，為-43.45 kcal/mol（表1）。TTR四聚體的T4結(jié)合位點(diǎn)及其周圍殘基作為Aβ單體作用部位曾被Li等［45］報(bào)道。在Model3中，Aβ單體則結(jié)合在TTR四聚體T4結(jié)合通道側(cè)面的凹槽部位，該凹槽由四聚體中上下兩個(gè)TTR 單體的EF螺旋結(jié)構(gòu)包圍組成，這在一定程度與EF螺旋及EF loop可能是Aβ感應(yīng)部位的推測相符合［49］。此外，該部位也是視黃醛結(jié)合蛋白在TTR 四聚體結(jié)構(gòu)中的結(jié)合部位［42］，且視黃醛結(jié)合蛋白被報(bào)道能夠參與TTR抑制Aβ聚集的過程［43］。

相較于Aβ單體與TTR的相互作用，Aβ聚集體與TTR 的相互作用有顯著的差異。從結(jié)構(gòu)上來說Aβ 單體為無定形非結(jié)構(gòu)多肽，具有結(jié)構(gòu)柔性大、體積相對小的特點(diǎn)，有利于在相互作用過程中通過構(gòu)象的適當(dāng)調(diào)整獲得相對穩(wěn)定的結(jié)合狀態(tài)。相比之下，Aβ低聚體主要以富含β折疊結(jié)構(gòu)的形式存在，結(jié)構(gòu)固定且聚集體體積大，在作用過程中不易進(jìn)行構(gòu)象調(diào)整。本工作通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對接獲得的Aβ 五聚體與TTR 單體及四聚體的作用模式中，親和力較高的模式較少。在AβOTTRM 體系中，僅Model1有較高的親和力，且在模擬過程中能夠持續(xù)穩(wěn)定地作用（-45.47 kcal/mol）。通過分析Model1的特點(diǎn)可以發(fā)現(xiàn)該模式下相互作用主要存在于TTR 單體的β 折疊鏈H 與Aβ 五聚體的β 折疊邊鏈，并且二者在模擬過程中形成了穩(wěn)定的β折疊片層結(jié)構(gòu)（圖4）。Model2和Model3的對接打分及動力學(xué)模擬過程中的結(jié)合親和性均較低，結(jié)合較弱。在Aβ五聚體與TTR四聚體作用體系中（AβOTTRT），盡管Model1在對接打分中有較高的親和力打分（-36.28 kcal/mol），但該模式在模擬后的結(jié)合自由能僅為-16.96 kcal/mol，此外，雖然Model2的親和力在動態(tài)相互作用過程中有所增加（由對接打分的-10.45 kcal/mol增加至-31.18 kcal/mol），但整體的結(jié)合自由能相較于其他3個(gè)體系仍相對較低。基于此，推測TTR四聚體與Aβ聚集體之間的相互作用可能不是TTR神經(jīng)保護(hù)作用的主要原因。

綜合以上討論，本文對Aβ與TTR之間的相互作用機(jī)制進(jìn)行了推測：TTR 對Aβ 的抑制聚集作用展現(xiàn)在兩個(gè)方面（圖5）。

一方面，TTR四聚體和TTR單體都能與Aβ單體發(fā)生相互作用，這種相互作用能夠起到“扣押”Aβ 單體的作用［45，50］。盡管Li 等［45］認(rèn)為，正常情況下體內(nèi)的TTR 四聚體含量遠(yuǎn)高于TTR 單體，因而TTR四聚體是“扣押”Aβ單體的主要結(jié)構(gòu)形式。但在此前Du 等［24］的工作中，他們通過酶聯(lián)免疫分析和交聯(lián)實(shí)驗(yàn)得到結(jié)論，相比TTR 四聚體，Aβ單體能夠結(jié)合更多的TTR單體。與Du等的結(jié)論相似，Jain 等［51］認(rèn)為相比TTR 四聚體，其單體形式能更好地抑制淀粉樣纖維的形成。結(jié)合先前實(shí)驗(yàn)報(bào)道，本文認(rèn)為TTR 四聚體和TTR 的單體均有“扣押”Aβ單體的能力。在不同情況下，TTR“扣押”Aβ 單體的形式不同。正常情況下，TTR 以穩(wěn)定四聚體形式存在，其濃度遠(yuǎn)高于TTR 單體，因而是“扣押”Aβ單體的主要形式，T4結(jié)合通道是Aβ單體結(jié)合的主要位點(diǎn)。此外，本工作及其他工作報(bào)道表明，TTR四聚體中除T4結(jié)合通道可作為Aβ的結(jié)合位點(diǎn)外，四聚體結(jié)構(gòu)中的EF螺旋、EF loop區(qū)也能夠與Aβ 作用。當(dāng)Aβ 作用于EF 螺旋形成的結(jié)合部位后，能夠誘導(dǎo)TTR 四聚體解離［49，52］，導(dǎo)致其內(nèi)部疏水結(jié)合位點(diǎn)的暴露（即TTR 單體的DAGH折疊片層）。由于TTR 單體更易與Aβ 單體結(jié)合，因而TTR 單體與Aβ 單體的作用能夠進(jìn)一步促進(jìn)TTR四聚體的解離，這時(shí)TTR單體即成為“扣押”Aβ單體的主要形式。

Fig. 5 The illustration of speculative interaction mechanisms between TTR and Aβ

另一方面，TTR 單體除了通過Aβ 單體的結(jié)合“扣押”其單體形式抑制Aβ聚集外，TTR單體特殊的結(jié)構(gòu)特征使其能夠與Aβ 的聚集體共聚集形成聚合度更高的聚集體。從結(jié)構(gòu)上來說，TTR單體由8條β 折疊鏈組成了上下兩層的β 折疊片層結(jié)構(gòu)，分別為DAGH片層和CBEF片層，其中DAGH片層被包裹在四聚體界面圍成了T4 結(jié)合通道。TTR 單體富含β 折疊片層結(jié)構(gòu)的特征與Aβ 聚集體的結(jié)構(gòu)相似，使得TTR 單體邊緣的β 折疊鏈能夠與Aβ 聚集體邊緣的β 折疊鏈形成新的β 折疊片層結(jié)構(gòu)而形成聚合度更高的無毒聚集體。重要的是，Garai等［25］通過雙色熒光爆發(fā)重合檢測實(shí)驗(yàn)確定TTR 單體能與可溶性Aβ 低聚體共聚集形成非纖維聚集體，且Cascella 等［53］通過原子力顯微鏡成像及細(xì)胞存活率檢測（MTT）等實(shí)驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn)TTR單體與Aβ聚集體作用形成的大聚集組裝體的細(xì)胞毒性降低。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果無疑為上述推論提供了強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)支撐。從這一機(jī)制推測出發(fā)，TTR單體是直接作用于Aβ 的毒性聚集體的結(jié)構(gòu)形式，因此在一定程度上解釋了Cao 等［19］報(bào)道的只有解離成單體的TTR 才能抑制Aβ 的細(xì)胞毒性。此外，根據(jù)淀粉樣聚集的Dock-Lock 機(jī)理［46］，當(dāng)Aβ 聚集體的邊緣β 折疊鏈被TTR單體占據(jù)后，聚集體募集游離Aβ單體的能力降低，因而能夠阻止Aβ 的進(jìn)一步聚集。本工作揭示的TTR 單體通過與Aβ 聚集體β 折疊邊鏈作用從而抑制Aβ 聚集的機(jī)制與Sun 等［47］提出的αB 晶體蛋白通過覆蓋Aβ 聚集體及纖維結(jié)構(gòu)中暴露的β折疊延伸面（β 折疊邊鏈）來抑制Aβ 聚集的結(jié)論一致。

基于研究結(jié)論，本文在此提出一些有關(guān)AD藥物研發(fā)的思考：首先，TTR作為內(nèi)源性蛋白在體內(nèi)具有較好的生物相容性和低免疫性，因而以TTR為對象設(shè)計(jì)抗AD 策略具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢。其次，本研究表明TTR 單體既能通過“扣押”Aβ 單體抑制Aβ 聚集，也能與Aβ 聚集體共聚集干擾Aβ的進(jìn)一步聚集。因此，TTR單體可作為重點(diǎn)對象來開展抗AD藥物的研究。一方面可以考慮增強(qiáng)TTR單體自身結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，如設(shè)計(jì)穩(wěn)定性氨基酸突變（T119M）；另一方面可以考慮從TTR 單體結(jié)構(gòu)出發(fā)增強(qiáng)TTR 單體對Aβ 單體及Aβ 聚集體的特異性識別作用，強(qiáng)化TTR單體與Aβ之間的相互作用。

4 結(jié)論

本工作聚焦于TTR對AD的神經(jīng)保護(hù)作用，通過分子動力學(xué)模擬方法從分子層面探究了TTR 與Aβ 之間作用機(jī)制。綜合本工作的研究發(fā)現(xiàn)得到以下結(jié)論。首先，TTR 結(jié)構(gòu)的特殊性使得其對Aβ 單體具有較強(qiáng)的相互作用能力，可通過“扣押”單體的形式抑制Aβ 的聚集。這種結(jié)構(gòu)特殊性表現(xiàn)為：a. 正常情況下TTR 以穩(wěn)定四聚體形式存在，其結(jié)構(gòu)中的T4結(jié)合通道及視黃醇結(jié)合部位為Aβ提供了適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合空間，有利于Aβ 單體的結(jié)合；b. 四聚體解離產(chǎn)生TTR 單體，導(dǎo)致疏水界面DAGH 折疊片層的暴露，使得Aβ 單體同樣能夠作用于該疏水界面（Aβ 單體的疏水核心為17LVFFA21），達(dá)到“扣押”Aβ單體的作用。其次，TTR單體的結(jié)構(gòu)特征與Aβ 聚集體的結(jié)構(gòu)相似，均為富含β 折疊的結(jié)構(gòu)，這使得TTR單體能夠與Aβ聚集體共聚形成聚合度更高的無毒聚集體，從而達(dá)到抑制Aβ 細(xì)胞毒性的效果。整體而言，本工作在原子尺度上探究了TTR與Aβ相互作用的機(jī)制，并揭示了TTR神經(jīng)保護(hù)作用的分子機(jī)制，在一定程度上為基于TTR 神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制的抗AD 藥物研發(fā)提供了理論線索。