沈崇杰 莫日根

（內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，省部共建草原家畜生殖調(diào)控與繁育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010020）

基因表達(dá)通過轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個步驟讀取存儲在DNA 中的遺傳信息。這兩個步驟分別由兩個大分子裝置執(zhí)行：RNA 聚合酶（RNA polymerase，RNAP） 和核糖體［1］。兩者都沿著各自的模板（DNA或mRNA）移動，以給出反映模板序列信息的聚合產(chǎn)物（mRNA 或蛋白質(zhì)）。在原核生物中，由于缺乏將染色體DNA 與細(xì)胞溶質(zhì)物理分隔的核膜，轉(zhuǎn)錄和翻譯發(fā)生在同一個細(xì)胞區(qū)室（細(xì)胞質(zhì)）中［2］，因此，mRNA 可以在轉(zhuǎn)錄時(shí)進(jìn)行翻譯。轉(zhuǎn)錄和翻譯在時(shí)空上互相協(xié)調(diào)的現(xiàn)象稱作轉(zhuǎn)錄-翻譯耦合（transcription-translation coupling）。

大約六十年前，有關(guān)“原核生物中轉(zhuǎn)錄和翻譯是耦合的”的觀點(diǎn)被首次提出［3］。E. coli核質(zhì)的電子顯微圖片顯示，RNAP和核糖體之間的聯(lián)系非常密切：第一個與延伸中的mRNA 鏈結(jié)合的核糖體通常緊鄰DNA，有時(shí)看起來是與RNAP 直接接觸［4］，這表明細(xì)菌中RNAP 的轉(zhuǎn)錄和尾隨核糖體（第一個結(jié)合到轉(zhuǎn)錄本并執(zhí)行翻譯的核糖體，又稱先導(dǎo)核糖體）的翻譯可能是同時(shí)進(jìn)行的。通過測量轉(zhuǎn)錄和翻譯的延伸速率，研究者獲得了RNAP和尾隨核糖體功能上耦合的直接證據(jù)［5-7］。最近，以單粒子冷凍電子顯微技術(shù)（cryo-electronmicroscopy，cryo-EM）為代表的結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)被用于闡明耦合的細(xì)菌RNAP和核糖體復(fù)合體（“表達(dá)體”）的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，其主要揭示了轉(zhuǎn)錄因子NusG 和/或NusA將RNAP與核糖體物理連接的作用［8-9］。

雖然翻譯和轉(zhuǎn)錄速率在不同的生長條件下有所不同，但這兩者間始終保持協(xié)調(diào)［5-7］，說明平衡的轉(zhuǎn)錄-翻譯耦合機(jī)制對于細(xì)胞的正常功能不可或缺。耦合的解除所導(dǎo)致的多種沖突，將對基因表達(dá)和細(xì)胞活力產(chǎn)生負(fù)面影響。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的最新研究結(jié)果，本文重點(diǎn)綜述了E. coli中轉(zhuǎn)錄-翻譯耦合的表現(xiàn)形式、結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)、機(jī)制及意義，并對耦合的研究內(nèi)容、方法及其在抗生素治療領(lǐng)域的應(yīng)用前景進(jìn)行展望。

1 轉(zhuǎn)錄-翻譯耦合的表現(xiàn)形式

1.1 轉(zhuǎn)錄極性

在E. coli中，大約20%的穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)錄終止事件由轉(zhuǎn)錄終止因子Rho介導(dǎo)［10］。Rho介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄終止需要一段稱為Rho利用（Rho utilization，rut）位點(diǎn)的非結(jié)構(gòu)化且富含胞嘧啶的序列［11］。通過緊跟在RNAP之后，mRNA上的尾隨核糖體掩蓋了基因內(nèi)的rut位點(diǎn)，因此抑制了Rho 的結(jié)合，從而阻礙轉(zhuǎn)錄終止。當(dāng)轉(zhuǎn)錄極性發(fā)生時(shí)，過早的翻譯終止導(dǎo)致核糖體從新生的mRNA 上解離，從而允許轉(zhuǎn)錄終止因子Rho 沿著新生的RNA 一直前進(jìn)到RNAP；在RNAP處，Rho誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄終止，停止下游基因在操縱子上的轉(zhuǎn)錄；同樣地，翻譯速率的降低導(dǎo)致的RNAP 和尾隨核糖體之間的距離增加有利于Rho與rut位點(diǎn)的結(jié)合和Rho 介導(dǎo)的過早轉(zhuǎn)錄終止（premature transcription termination， PTT） 發(fā)生［12］。特別地，反義轉(zhuǎn)錄本由于缺乏與翻譯的耦合而使它們成為Rho的目標(biāo)，進(jìn)而降低了其對正義鏈轉(zhuǎn)錄單位表達(dá)水平的干擾［13］。因此，極性不僅是一種響應(yīng)壓力的資源控制方式，而且是一種有利于基因表達(dá)準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性的調(diào)控機(jī)制。

1.2 轉(zhuǎn)錄衰減

一些E. coli操縱子在轉(zhuǎn)錄單元的起始位置附近包含一個稱為“前導(dǎo)肽”的短開放閱讀框，其翻譯被細(xì)胞用作傳感器來指示下游基因是否應(yīng)該被轉(zhuǎn)錄或過早終止（“衰減”）［14］。轉(zhuǎn)錄衰減最典型的例子是細(xì)胞利用色氨酸濃度調(diào)節(jié)trp操縱子的表達(dá)。用于色氨酸生物合成的E. coli操縱子的前導(dǎo)肽包含兩個連續(xù)的色氨酸密碼子；色氨酸饑餓將導(dǎo)致翻譯操縱子前導(dǎo)序列的第一個核糖體停滯在連續(xù)的色氨酸密碼子處，從而促進(jìn)了抗終止子結(jié)構(gòu)的形成，繼而允許RNAP 繼續(xù)轉(zhuǎn)錄trp操縱子上的下游基因；當(dāng)細(xì)胞內(nèi)色氨酸充足時(shí)，核糖體能夠穿過連續(xù)的色氨酸密碼子并導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄終止發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成，因而關(guān)閉了下游結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)［15-16］。因此，轉(zhuǎn)錄衰減可以通過使轉(zhuǎn)錄與翻譯相互關(guān)聯(lián)來使基因的表達(dá)受到精密且機(jī)動的調(diào)控。

1.3 轉(zhuǎn)錄與翻譯速率的同步

Vogel等［6］通過測量轉(zhuǎn)錄和翻譯延伸速率表明，轉(zhuǎn)錄和翻譯速率總是保持一致，并且隨著生長速度的降低而以同等比例降低。Proshkin等［7］同樣表明，在不同的生長條件下，轉(zhuǎn)錄速率和翻譯速率完美匹配；翻譯速率的增加或降低導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄速率發(fā)生相同的變化。lyer等［5］在引起轉(zhuǎn)錄速率降低的碳饑餓條件下也觀察到翻譯速率相同程度的降低?？傊D(zhuǎn)錄和翻譯速率的耦合總是非常緊密，可能存在某種機(jī)制介導(dǎo)兩者之間的動態(tài)協(xié)調(diào)。

一個轉(zhuǎn)錄-翻譯物理（接觸）耦合的模型被用來解釋不同生長條件下的轉(zhuǎn)錄與翻譯的相關(guān)性［7，17］。根據(jù)該模型，尾隨核糖體的翻譯延伸速率決定轉(zhuǎn)錄延伸速率?？股鼗蛲蛔円鸬姆g減慢會使得RNAP與核糖體之間的距離增大，從而使RNAP停滯或回溯；回溯時(shí)，RNAP在新生RNA和DNA模板鏈上向后滑動，壓縮上游新生RNA和模板DNA，同時(shí)將新生RNA 的3'端擠出核苷三磷酸（nucleoside triphosphate，NTP）進(jìn)入位點(diǎn)；由于具有能量輔助因子EF-G，尾隨核糖體能夠活躍地向前易位并通過物理推動的方式將回溯的RNAP重新激活，從而使RNA鏈繼續(xù)延伸［7，17］。另一項(xiàng)最新的研究深化了這個模型：RNAP 在其DNA 模板上自發(fā)回溯的抑制是通過NusG將尾隨核糖體束縛在RNAP 上來實(shí)現(xiàn)的，并且NusA 參與了束縛的協(xié)作［18］。停滯的RNAP 被尾隨核糖體重新激活并運(yùn)行，RNAP 的速度與核糖體的速度因而相互匹配，即轉(zhuǎn)錄速率與翻譯速率同步。值得一提的是，這種協(xié)調(diào)模式并不一定意味著RNAP·核糖體穩(wěn)定復(fù)合物的形成［17］。核糖體對RNAP激活的同時(shí)可能會降低其轉(zhuǎn)錄精確度［19］。因此，核糖體對RNAP的推動可能是一個短暫的非持續(xù)性過程，即RNAP一旦從回溯狀態(tài)恢復(fù)，尾隨核糖體就不再與其緊密接觸。

四磷酸鳥苷和五磷酸鳥苷統(tǒng)稱為（p）ppGpp，是細(xì)菌中保守的第二信使。作為一種警報(bào)素，（p）ppGpp 的合成通常由營養(yǎng)缺乏引發(fā)，以允許細(xì)菌在各種不利條件下減緩自身生長［20］。（p）ppGpp與轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)，主要是通過直接與RNAP上的兩個特定位點(diǎn)（一個位于ω亞基和β'亞基之間的界面，另一個位于轉(zhuǎn)錄因子DksA與β'次級通道邊緣螺旋間的界面）相互作用，破壞在某些基因（如rRNA和tRNA基因）啟動子處形成的短暫開放復(fù)合體的穩(wěn)定性，從而直接抑制轉(zhuǎn)錄啟動［21-22］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，用夫西地酸（fusidic acid）處理的細(xì)胞顯示出較慢的翻譯延伸速率，而轉(zhuǎn)錄延伸速率沒有降低，并且轉(zhuǎn)錄延伸隨著（p）ppGpp的積累而減慢［23］。此外，當(dāng)細(xì)胞在導(dǎo)致翻譯減緩的氮限制條件下生長時(shí)，需要通過（p）ppGpp介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄減緩來協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)錄與翻譯速率［5］。因此，（p）ppGpp 可以在沒有物理耦合的情況下協(xié)調(diào)核糖體和RNAP 之間的速率。這挑戰(zhàn)了把RNAP和核糖體之間直接接觸作為一般的協(xié)調(diào)機(jī)制的觀點(diǎn)。另一項(xiàng)研究表明，（p）ppGpp能夠防止嘌呤核苷酸的過度積累及其對5-磷酸核糖-1焦磷酸（5-phosphoribosyl-1-diphosphate， PRPP）合成的抑制；PRPP 是嘧啶核苷酸、色氨酸和組氨酸的前體分子，其缺失將導(dǎo)致細(xì)胞在營養(yǎng)限制條件下的生長顯著缺陷［20］。因此，警報(bào)素可能還通過抑制嘌呤核苷酸的合成來確保色氨酸和組氨酸的可用性以維持基礎(chǔ)翻譯，進(jìn)而間接協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)錄-翻譯。綜上所述，當(dāng)生長有利于高效的翻譯延伸時(shí)，物理耦合可能很普遍，而壓力或緩慢的翻譯延伸會產(chǎn)生對警報(bào)素的依賴性以同步轉(zhuǎn)錄和翻譯的速率。

2 轉(zhuǎn)錄-翻譯耦合的分子機(jī)制

2.1 因子介導(dǎo)的物理耦合

2.1.1NusG（RfaH）介導(dǎo)的耦合

NusG 是細(xì)菌RNAP 的必要調(diào)節(jié)因子，大小為20.5 ku；憑借其能產(chǎn)生瞬時(shí)相互作用的雙結(jié)構(gòu)域：N 端結(jié)構(gòu)域（NusG-NTD）、C 端結(jié)構(gòu)域（NusGCTD）以及結(jié)構(gòu)域之間的靈活接頭，NusG 能夠與不同的伴侶相互作用［24］。NusG 同時(shí)與核糖體和RNAP 的相互作用已經(jīng)在體內(nèi)和體外證明［25］。NusG-NTD 與RNAP 結(jié)合，而NusG-CTD 可以結(jié)合Rho 或核糖體蛋白u(yù)S10［26-27］。NusG-NTD 與RNAP的結(jié)合可防止RNAP長期停頓或回溯，從而提高整體轉(zhuǎn)錄速率［25，27］。Rho 因子與NusG-CTD 的結(jié)合將使Rho發(fā)生有利于其裝載到RNA的構(gòu)象變化，并同時(shí)將Rho因子加載到離RNAP僅一小段距離的新生RNA 上，從而促進(jìn)Rho 依賴性轉(zhuǎn)錄終止［12，25］。核糖體蛋白u(yù)S10和Rho在NusG-CTD上共享相同的結(jié)合界面［25，27］。正常翻譯時(shí)，轉(zhuǎn)錄與翻譯耦合，NusG-CTD與uS10結(jié)合，因此無法與Rho結(jié)合；當(dāng)翻譯完成或受抑制時(shí)，核糖體的釋放或停滯將導(dǎo)致NusG-CTD與Rho相互作用并促進(jìn)Rho依賴的終止［25-27］，因此NusG不僅自身結(jié)合RNAP和核糖體，而且在轉(zhuǎn)錄-翻譯耦合過程中在RNAP 和核糖體之間形成物理聯(lián)系［27］。

NusG 在耦合中的作用機(jī)制最近已通過NusG耦合的RNAP·70S 復(fù)合物（NusG 耦合表達(dá)體）的高分辨率結(jié)構(gòu)得到闡明［28-29］。NusG 的存在將RNAP束縛在30S頭部區(qū)域，以避免RNAP的β'亞基與由uS3、uS10、NusG和16S rRNA的螺旋33形成的腔之間的沖突［28］。NusG與RNAP和核糖體上的uS10 結(jié)合，證實(shí)了其作為分子橋的預(yù)期作用。NusG 接頭長度在14到30 ?的范圍變化以及NusG耦合的表達(dá)體呈現(xiàn)的高達(dá)30°的動態(tài)旋轉(zhuǎn)［28］表明，NusG充當(dāng)介導(dǎo)RNAP-核糖體靈活結(jié)合的彈性分子拴鏈。重要的是，由于核糖體蛋白u(yù)S10 與Rho 因子競爭NusG-CTD 上的重疊位點(diǎn)（其中NusG-CTD的F165在結(jié)合uS10方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用），RNAP和核糖體通過NusG 的耦合抑制了Rho 因子的募集，同時(shí)抑制了其介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄終止［10］。因此，正在被有效翻譯的mRNA 能夠避免PTT，而那些沒有被有效翻譯的mRNA 是Rho 的目標(biāo)；通過這種聯(lián)系，基因特異性翻譯調(diào)節(jié)因子可以充當(dāng)基因特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子［14］。

NusG 介導(dǎo)的耦合可能會間接增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄和翻譯的相互關(guān)聯(lián)。一方面，NusG 橋的位置使得核糖體P 位點(diǎn)和RNAP 活性位點(diǎn)之間出現(xiàn)的不同長度（38、41、42、44和47 nt）的新生間插mRNA與核糖體蛋白u(yù)S3的表面對齊［28-29］。預(yù)計(jì)這會最大限度地減少抑制轉(zhuǎn)錄和翻譯速率的mRNA 二級結(jié)構(gòu)的形成，從而降低了由翻譯抑制等因素引起的耦合解除的可能。另一方面，NusG-CTD和核糖體之間的相互作用增加NusG-NTD和RNAP間的親和力，減少NusG-NTD 從RNAP 解離的頻率［28］。因此，在存在尾隨核糖體的情況下，RNAP 與NusG 的結(jié)合會更穩(wěn)定。

NusG 的旁系同源物RfaH 同樣是一個能將RNAP和核糖體橋接的轉(zhuǎn)錄因子［30］。RfaH和NusG的N 端結(jié)構(gòu)域（RfaH-NTD）完全相同，均與延伸中的RNAP 相互作用并減少轉(zhuǎn)錄暫停［31］。RfaH與NusG在RNAP 上共享相同的結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致它們以相互競爭的方式與RNAP結(jié)合［32］。通常情況下，RfaH的C端結(jié)構(gòu)域（RfaH-CTD）折疊成α發(fā)夾并將RfaH-NTD的RNAP結(jié)合位點(diǎn)掩蓋［31］。RfaH在轉(zhuǎn)錄前與非模板DNA中的ops序列結(jié)合，這將導(dǎo)致RfaH-CTD和RfaH-NTD的分離，從而使RfaH-NTD可以與RNAP結(jié)合；同時(shí)，RfaH-CTD將采用NusG的全β折疊結(jié)構(gòu)并允許RfaH在和NusG相同的界面處招募uS10 并激活翻譯［31-32］。與NusG 不同，RfaH 不結(jié)合Rho 因子，這可能與它們CTD中L1與L2環(huán)的序列差異有關(guān)［10］。因此，RfaH 以3 種方式阻礙Rho 依賴性轉(zhuǎn)錄終止［31，33］。首先，它通過調(diào)節(jié)RNAP和第一個尾隨核糖體之間的緊密耦合來阻止Rho 因子到達(dá)RNAP；其次，它通過與NusG 競爭結(jié)合RNAP 來減少NusG 對Rho 依賴性終止的促進(jìn)作用；第三，它通過穩(wěn)定“閉合鉗”形式的RNAP構(gòu)象來減少RNAP的暫停。

2.1.2NusA協(xié)助NusG介導(dǎo)的耦合

NusA 是一種由495 個氨基酸（55 ku）組成的多結(jié)構(gòu)域蛋白，其在細(xì)菌和古細(xì)菌中高度保守［34］。NusA 的N 端結(jié)構(gòu)域（NusA-NTD）通過一個靈活的螺旋連接到3 個結(jié)合RNA 的亞結(jié)構(gòu)域：S1、KH1 和KH2，形成中央SKK 結(jié)構(gòu)域，與新生轉(zhuǎn)錄本的單鏈RNA 結(jié)合；連接到SKK 結(jié)構(gòu)域的C 端是酸性重復(fù)序列1和2（AR1和AR2），迄今為止，這些重復(fù)序列只在E. coli中被鑒定出來［24］。RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)所穩(wěn)定的RNAP暫停由NusA和RNAP間的相互作用促進(jìn)，這些相互作用有利于RNAP暫停構(gòu)象的形成和穩(wěn)定，并進(jìn)一步延長了暫停時(shí)間［34］：NusA-NTD結(jié)合β亞基翼端螺旋（β-FTH）；AR2結(jié)合α1 亞基C 端結(jié)構(gòu)域（α1-CTD）；NusA 的KH 結(jié)構(gòu)域（NusA-KH）與ω 亞基的C 端螺旋結(jié)合以及NusA-NTD 與α2 亞基C 端結(jié)構(gòu)域（α2-CTD）的結(jié)合［34］。相反地，在與其他Nus因子（NusA、B、E和G）的協(xié)同作用下，NusA促進(jìn)了N蛋白依賴的抗終止過程并促使穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合體（transcription elongation complex，TEC）形成，從而引導(dǎo)進(jìn)行性轉(zhuǎn)錄和終止位點(diǎn)的通讀［35-36］。

NusG-NusA 耦合表達(dá)體的結(jié)構(gòu)是利用純化的E. coli因子重組得到的［29］。包含NusA 和NusG 的E. coli表達(dá)體的結(jié)構(gòu)（NusG-NusA耦合表達(dá)體）與僅包含NusG 的結(jié)構(gòu)（NusG耦合表達(dá)體）非常相似：NusG分別與核糖體30S頭部和核糖體蛋白u(yù)S10相互作用；RNAP β'亞基的鋅結(jié)合結(jié)構(gòu)域（zincbinding domain，ZBD）與核糖體蛋白u(yù)S3接觸；重要的是，NusA 可以同時(shí)與核糖體和RNAP 相互作用，形成靈活的分子橋［29］。不同于NusG-NusA耦合表達(dá)體中由NusG與核糖體30S頭部的相互作用，在NusA耦合表達(dá)體中，NusA與核糖體30S體表面進(jìn)行廣泛的相互作用，這種相互作用是由NusA的KH1結(jié)構(gòu)域插入核糖體蛋白u(yù)S2和uS5之間的裂縫中驅(qū)動的［29］。NusA-KH1（E218、E219、D242 和D246）的酸性殘基與uS2（K105 和R108）和uS5（R45、R68和R69）的堿性殘基的相互鄰近可能支持這種相互作用［14］。除此之外，NusA采用的內(nèi)部彎曲的擴(kuò)展構(gòu)型支持其作為RNAP和尾隨核糖體的uS2/uS5 蛋白之間的“耦合受電弓”來促進(jìn)表達(dá)體的組裝，并允許RNAP 相對于核糖體30S 體旋轉(zhuǎn)［34］。

根據(jù)結(jié)構(gòu)測定，與NusG耦合表達(dá)體相比，NusG-NusA耦合表達(dá)體展現(xiàn)出更多的顆粒數(shù)量和更高的分辨率［29］。這表明NusA 可能促進(jìn)NusG 介導(dǎo)的耦合形成或維持其穩(wěn)定性。目前尚不清楚NusA獨(dú)自在耦合中的作用，一個主要原因是缺少具有NusA但沒有NusG的E. coli表達(dá)體結(jié)構(gòu)。

2.2 非因子依賴的物理耦合

與因子介導(dǎo)的耦合相比，非因子依賴的耦合需要RNAP和核糖體間的直接相互作用。這種互作得到了部分實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持。Chakrabarti等［37］較早的研究表明，僅依賴RNAP和核糖體30S亞基間的結(jié)構(gòu)相容性就能確保轉(zhuǎn)錄和翻譯間的耦合。通過cryo-EM，Kohler［9］和Demo［38］兩個團(tuán)隊(duì)分別解析了70S核糖體/30S核糖體亞基與RNAP相結(jié)合的復(fù)合體結(jié)構(gòu)（由于前者是通過將翻譯核糖體與轉(zhuǎn)錄停滯的RNAP碰撞而產(chǎn)生的，故其又被稱作“碰撞表達(dá)體”）；30S亞基與RNAP的互作細(xì)節(jié)也在同一年被Fan等［39］揭示。

Klohler、Demo和Fan三個團(tuán)隊(duì)的研究均表明，30S亞基在RNAP與核糖體的結(jié)合中發(fā)揮了關(guān)鍵作用；RNAP的mRNA出口位點(diǎn)都會?？吭?0S亞基的mRNA入口位點(diǎn)，這確保了自mRNA經(jīng)RNAP合成后到其抵達(dá)核糖體的解碼中心的這段期間，Rho無法訪問轉(zhuǎn)錄本并提前終止轉(zhuǎn)錄；并且NusG沒有足夠的長度橋接RNAP與核糖體，暗示因子介導(dǎo)的耦合無法與非因子依賴的耦合共存［9，38-39］。

不同的是，碰撞表達(dá)體中RNAP的mRNA出口位點(diǎn)始終?？吭?0S亞基上mRNA的入口位點(diǎn)［9］，而在Demo和Fan團(tuán)隊(duì)得到的30S亞基·RNAP復(fù)合體中，RNAP的mRNA出口位點(diǎn)起初均結(jié)合在核糖體的mRNA出口位點(diǎn)附近［38-39］。因此，參與和RNAP互作的核糖體蛋白也有明顯不同（在碰撞表達(dá)體中主要為uS3、uS4和uS5，而在30S亞基·RNAP復(fù)合體中主要為uS1和uS2）［9，38-39］。鑒于核糖體上的mRNA出口位點(diǎn)靠近16S rRNA的Shine-Dalgrano結(jié)合區(qū)，30S亞基·RNAP復(fù)合體可能代表了翻譯起始階段兩個大分子的結(jié)合情況。具體地講，RNAP和30S亞基結(jié)合幫助16S rRNA的折疊和核糖體蛋白的組裝，從而將翻譯起始和轉(zhuǎn)錄延伸相互關(guān)聯(lián)；30S起始復(fù)合物的形成將導(dǎo)致30S內(nèi)部結(jié)構(gòu)的重排和RNAP結(jié)合位點(diǎn)的重塑，RNAP從原來的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（mRNA出口位點(diǎn)）解離并最終?？吭诤颂求w的mRNA入口位點(diǎn)附近［38-39］（與碰撞表達(dá)體中的RNAP和核糖體的結(jié)合情況相符）。RNAP的重新定位充分體現(xiàn)了生物大分子的構(gòu)象靈活性以及功能上合作的緊密性。

2.3 DksA和TufA輔助的間接耦合

轉(zhuǎn)錄因子DksA是一種RNAP結(jié)合蛋白，在E. coli中以相對恒定的濃度存在［21］。作為（p）ppGpp的輔助因子，DksA能夠在嚴(yán)緊反應(yīng)中放大（p）ppGpp依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的效果；DksA通過將其卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域插入到RNAP次級通道來和RNAP相互作用；這種互作導(dǎo)致次級通道擴(kuò)展并影響RNAP核心和骨架組件的取向；DksA和RNAP的結(jié)合可能使RNAP對（p）ppGpp誘導(dǎo)的骨架-核心棘輪效應(yīng)更加敏感，從而在轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中放大（p）ppGpp的信號［22］。

TufA 是E. coli中的一種翻譯延伸因子，除在蛋白質(zhì)合成中發(fā)揮作用外，其已經(jīng)被證明在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)與熱休克和氧化應(yīng)激等脅迫反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)合成［40］。最近的文獻(xiàn)報(bào)道在tufAmRNA 5'UTR 中存在折疊成兩個相似發(fā)夾的結(jié)構(gòu)區(qū)域SRⅠⅠⅠb。該結(jié)構(gòu)化區(qū)域作為一種翻譯起始增強(qiáng)子（structured enhancer of translation initiation，SETⅠ）提高了GTP對30S翻譯起始復(fù)合物的親和力，從而增加了ppGpp耐受性并允許有效的蛋白質(zhì)合成［41］。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室對E. coli的翻譯組測序（Ribosome profiling sequencing，Ribo-seq）結(jié)果，與野生型菌株相比，tufA基因缺失突變體總體轉(zhuǎn)錄表達(dá)量和翻譯表達(dá)量的相關(guān)性下降14.75%，其中DksA蛋白的翻譯水平下調(diào)55.6%（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。所以，TufA可能在耦合形成前或翻譯受阻期間通過上調(diào)DksA的表達(dá)來參與（p）ppGpp依賴的間接耦合。

2.4 轉(zhuǎn)錄-翻譯耦合的階段性模型

本文提出一個E. coli中轉(zhuǎn)錄翻譯耦合的階段性模型。與轉(zhuǎn)錄延伸相比，翻譯起始是一個相對較長的過程，因此，RNAP可以在在尾隨核糖體開始延伸之前獨(dú)立地延長幾十個核苷酸［42］（圖1a）。一旦尾隨核糖體開始延伸，RNAP和核糖體就會通過新生的mRNA 遠(yuǎn)程連接，以間接耦合的方式相關(guān)聯(lián)（圖1b）。（p）ppGpp 在此過程合成維持基本翻譯所需的蛋白質(zhì)并降低轉(zhuǎn)錄延伸速率。TufA通過直接或間接的方式增強(qiáng)（p）ppGpp輔助因子DksA的表達(dá)，從而使（p）ppGpp介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄延伸降低效應(yīng)進(jìn)一步增強(qiáng)。某種調(diào)控作用使RNAP傾向于在起始密碼子后的100 nt 內(nèi)暫停［43］，這可以讓尾隨核糖體趕上RNAP 并形成物理耦合。這種耦合由NusG 或RfaH因子橋接RNAP和核糖體的uS10蛋白來維持，并由NusA在RNAP與核糖體蛋白u(yù)S2、uS5間形成的橋接穩(wěn)定（圖1c）。轉(zhuǎn)錄或翻譯延伸速率的變化會導(dǎo)致連接RNAP 和尾隨核糖體的新生mRNA 的長度不同，進(jìn)而引起幾種耦合機(jī)制間的轉(zhuǎn)變 （圖1）。例如，轉(zhuǎn)錄暫?；騌NAP回溯縮短了尾隨核糖體和RNAP之間的距離，這可能導(dǎo)致兩者在沒有因子存在的情況下以碰撞的方式結(jié)合（圖1d）。隨著尾隨核糖體推動停滯或回溯的RNAP向前運(yùn)行，因子介導(dǎo)的耦合可以重新配置［17］。另一方面，翻譯障礙會增加尾隨核糖體和RNAP之間的距離。如果此時(shí)處于碰撞耦合模式下，耦合將轉(zhuǎn)向間接關(guān)聯(lián)轉(zhuǎn)變；若此時(shí)處于因子耦合階段，則這種耦合不會被輕易破壞，因此無法直接導(dǎo)致耦合向間接關(guān)聯(lián)過渡。在這種情況下，較長的新生mRNA 可能在RNAP和核糖體之間形成突出到外側(cè)的環(huán)，并在轉(zhuǎn)錄延伸減慢或翻譯延伸加快的條件下得到恢復(fù)［12］。

3 轉(zhuǎn)錄-翻譯耦合的生物學(xué)意義

如前所述，翻譯故障將增加RNAP和核糖體之間的距離。當(dāng)兩者距離增加超過間接耦合調(diào)節(jié)的范圍，轉(zhuǎn)錄-翻譯耦合將被破壞。所以，轉(zhuǎn)錄-翻譯耦合的解除實(shí)際上主要是由諸如稀有/過早終止密碼子、聚脯氨酸序列、mRNA二級結(jié)構(gòu)元件（如假節(jié)和莖環(huán)）等引起翻譯減慢或停滯的因素造成的［44］（圖2a），如果這些故障沒有被及時(shí)清除，將產(chǎn)生一系列嚴(yán)重后果。

早期的觀點(diǎn)認(rèn)為，轉(zhuǎn)錄-翻譯耦合是細(xì)胞防止非功能性轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞質(zhì)中積累的一種方式［45］。如前所述，當(dāng)翻譯受阻從而導(dǎo)致核糖體與RNAP解耦合時(shí)，Rho容易結(jié)合到rut位點(diǎn)并運(yùn)行至RNAP分解TEC。特別地，NusG在此情況下可能進(jìn)一步促進(jìn)了mRNA對于Rho的招募，且不需要rut位點(diǎn)［10］。關(guān)于轉(zhuǎn)錄極性的最新發(fā)現(xiàn)也表明，在沒有物理耦合核糖體的情況下，轉(zhuǎn)錄終止因子Rho在轉(zhuǎn)錄啟動后早期通過與NusA 和NusG 的相互作用與RNAP 結(jié)合，使TEC 變成停滯不前的預(yù)終止復(fù)合體。這種狀態(tài)有利于Rho 識別新生mRNA 中的rut位點(diǎn)，隨后是Rho 環(huán)的閉合與移位以及TEC 的分解［46-47］。這些分子事件導(dǎo)致PTT和操縱子極性（圖2b）。由于核糖體和Rho競爭NusG的相同結(jié)合界面，因此，耦合的核糖體會阻止Rho 介導(dǎo)的PTT。這與Zhu等［23］提出的看法一致：轉(zhuǎn)錄和翻譯延伸之間的協(xié)調(diào)可以防止PTT，從而防止細(xì)胞在正常生長條件下合成無用的蛋白質(zhì)。由此看來，合理配置資源似乎是轉(zhuǎn)錄-翻譯耦合的部分功能。無論是翻譯減緩導(dǎo)致的PPT，還是轉(zhuǎn)錄減緩導(dǎo)致的核糖體隊(duì)列擁擠，都將引起成本的增加和能量的浪費(fèi)［48］。

雙超螺旋結(jié)構(gòu)域模型表明DNA 在移動的RNAP后面呈負(fù)超螺旋，這預(yù)計(jì)將有利于R環(huán)的形成［49］（圖2c）。R 環(huán)是一種由雙鏈DNA 中的一條鏈與mRNA 構(gòu)成的異源雙鏈核酸分子結(jié)構(gòu)。在E. coli中，染色體R環(huán)與轉(zhuǎn)錄延伸的缺陷有關(guān)，并且被認(rèn)為充當(dāng)后續(xù)RNAP運(yùn)動的障礙。停滯的TEC可能會干擾復(fù)制叉前進(jìn)，從而導(dǎo)致叉斷裂或崩潰［50］。R 環(huán)也可能介導(dǎo)細(xì)菌中染色體DNA 復(fù)制（組成型穩(wěn)定DNA 復(fù)制） 的異常起始［51］。Gowrishankar和Harinarayanan［52］認(rèn)為，所有細(xì)菌轉(zhuǎn)錄都傾向于形成R環(huán)，并且R環(huán)可以通過以下方式之一避免：類似于在rRNA和tRNA中的RNA二級結(jié)構(gòu)的形成；翻譯與轉(zhuǎn)錄的耦合；在mRNA 無法翻譯的情況下，Rho和NusG介導(dǎo)的PTT。其中，轉(zhuǎn)錄-翻譯耦合有助于防止拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ缺陷（DNA呈負(fù)超螺旋）的菌株中出現(xiàn)R 環(huán)已經(jīng)由Massé等［49］驗(yàn)證。

除翻譯障礙外，當(dāng)RNAP遇到物理障礙或結(jié)合了錯誤的核糖核苷三磷酸（ribonucleotide triphosphate，rNTP） 時(shí)，其也可能會暫?；蚧厮荩?9］。耦合允許核糖體解除TEC 的停滯或回溯，這對于避免復(fù)制體和RNAP 之間的沖突尤為重要（圖2d）。這種沖突會進(jìn)一步引起DNA 雙鏈斷裂以及基因組的不穩(wěn)定［53］。Saxena等［25］的研究也強(qiáng)調(diào)了這一點(diǎn)：NusG 與uS10 結(jié)合界面的突變（NusG F165 或uS10 M88 和D97）將轉(zhuǎn)錄與翻譯耦合解除并增加了對氯霉素的敏感性。這種表型被一種減少復(fù)制體-RNAP沖突的RNAP突變r(jià)poB*35抑制。因此，減弱的NusG∶uS10相互作用會在翻譯受到抑制時(shí)導(dǎo)致耦合破壞，進(jìn)而引起RNAP回溯、復(fù)制阻滯和致命的DNA雙鏈斷裂的形成。

共轉(zhuǎn)錄翻譯還保護(hù)新生轉(zhuǎn)錄物免受核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）的攻擊［54］（圖2e）。Ⅰost和Dreyfus表示［55］，當(dāng)被運(yùn)行速率較快（約230 nt/s）的T7 RNAP 轉(zhuǎn)錄時(shí)，lacZ轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性大大降低。T7 RNAP 轉(zhuǎn)錄lacZ基因的速度比核糖體解碼lacZ基因的速度快大約8 倍，這種更高的速度會暴露一個RNase E切割位點(diǎn)；而當(dāng)使用較慢（速率與核糖體相似）的E. coli酶時(shí)，該位點(diǎn)通常在轉(zhuǎn)錄后不久被核糖體屏蔽，阻止了RNase E對mRNA的特異性切割［55］。

Fig. 2 The consequences of the disrupt of the transcription-translation coupling圖2 轉(zhuǎn)錄-翻譯耦合破壞的后果

4 總結(jié)與展望

轉(zhuǎn)錄-翻譯耦合是人們對基因表達(dá)探索中的一個關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)，其框架已經(jīng)基本確立并走向完善。以E. coli為例，轉(zhuǎn)錄翻譯-耦合以物理接觸或間接（非物理接觸）的方式合作進(jìn)行，并且受到多種因素的調(diào)控。轉(zhuǎn)錄和翻譯互相調(diào)控（轉(zhuǎn)錄極性、轉(zhuǎn)錄衰減和轉(zhuǎn)錄-翻譯速率的同步）的事實(shí)進(jìn)一步支持這種耦合。不同階段的轉(zhuǎn)錄-翻譯耦合機(jī)制對整個細(xì)胞功能意義重大，并在相應(yīng)的生長條件下保持。當(dāng)遇到影響轉(zhuǎn)錄或翻譯的環(huán)境挑戰(zhàn)時(shí)，細(xì)菌會相應(yīng)地迅速平衡這兩個過程的動力學(xué)以使轉(zhuǎn)錄和翻譯相互協(xié)調(diào)。

盡管E. coli能將轉(zhuǎn)錄和翻譯耦合起來，但這可能并不適用于所有原核生物。例如，在枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）中發(fā)現(xiàn)了RNAP 轉(zhuǎn)錄遠(yuǎn)遠(yuǎn)領(lǐng)先于尾隨核糖體的“失控轉(zhuǎn)錄”現(xiàn)象［56］，表明耦合的RNAP-核糖體運(yùn)動不是細(xì)菌的一般標(biāo)志。另外，在肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae）中鑒定出的NusA耦合表達(dá)體顯示出一個與已經(jīng)表征的所有E. coli表達(dá)體存在差異的結(jié)構(gòu)［57］，說明不同生物體可能存在不同的耦合機(jī)制，亦反映了不同物種間基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的潛在多樣性。

Bharti等［58］最近通過對來自1 800個細(xì)菌基因組的基因盒進(jìn)行分析，鑒定出3個頻率較高的基因盒，且每一個基因盒都編碼一種連接轉(zhuǎn)錄和翻譯的蛋白質(zhì)（NusG、RpsD和NusA），暗示基因盒的存在可能在轉(zhuǎn)錄-翻譯耦合機(jī)制中發(fā)揮不可忽視的調(diào)節(jié)作用。此外，轉(zhuǎn)錄組和翻譯組學(xué)的聯(lián)合分析能夠從全局或者單個基因的角度展現(xiàn)轉(zhuǎn)錄與翻譯之間的相關(guān)性或差異性［59］，這或許能為找到和分析更多因素在轉(zhuǎn)錄-翻譯耦合中的作用帶來幫助。因此，通過將高通量組學(xué)（轉(zhuǎn)錄組和翻譯組學(xué)）、分子生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)等技術(shù)聯(lián)合運(yùn)用，或許可以獲得對轉(zhuǎn)錄-翻譯耦合的機(jī)制、作用、必要性等方面更深層次的見解。

作為一種原核生物的特異性現(xiàn)象，轉(zhuǎn)錄-翻譯耦合將為靶向抗菌藥物的開發(fā)提供一個有吸引力的方向。鑒于多細(xì)胞過程的調(diào)控子可能作為未來抗菌藥物的理想靶點(diǎn)［60］，開發(fā)靶向耦合因子（如NusG、NusA和（p）ppGpp）的藥物或許可以同時(shí)影響轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個基因表達(dá)過程的動力學(xué)平衡。特別地，鑒于嚴(yán)緊反應(yīng)在產(chǎn)生非遺傳性抗性和持久細(xì)胞形成中起著關(guān)鍵作用，靶向（p）ppGpp 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄-翻譯耦合的間接調(diào)節(jié)顯示出巨大的潛力，一種（p）ppGpp合成抑制物relacin已經(jīng)被證明通過阻止細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定生長期來降低細(xì)菌活力［61］。傳統(tǒng)的細(xì)菌感染治療主要以必需基因或通路為靶標(biāo)，可能會施加導(dǎo)致抗生素抗性喚醒的選擇壓力，進(jìn)而引起耐藥性菌株的泛濫。缺乏警報(bào)素的菌株在代謝上受到損害但仍能存活。因此，未來通過設(shè)計(jì)出靶向（p）ppGpp 代謝的藥物將在大大降低細(xì)胞活力的同時(shí)減少耐藥性菌株的產(chǎn)生，這對于抗菌治療具有一定的借鑒意義。