徐 鋒,曾小成,吳學(xué)文,張有發(fā),熊 艷*

1湘潭大學(xué)化工學(xué)院,湘潭 411105;2湖南杰萃生物技術(shù)有限公司,湘潭 412007

油橄欖(OleaeuropaeaL.)屬木犀科木犀欖屬常綠喬木,在我國(guó)和地中海國(guó)家廣泛種植,是這些國(guó)家和地區(qū)的主要農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作物之一[1-4]。目前橄欖資源的開發(fā)利用主要集中在果實(shí)的利用上,橄欖葉則作為廢料被遺棄在種植園內(nèi),造成了極大的資源浪費(fèi),現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)在橄欖葉中含有豐富的裂環(huán)烯醚萜苷類、酚類、五環(huán)三萜類以及黃酮類化合物[1,5-7]。其中橄欖苦苷(oleuropein,OL)是最主要的活性物質(zhì),具有抗氧化、抗病毒、殺菌消炎、降血糖、抗高血壓、抗癌等作用,廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域[6-13]。OL屬裂環(huán)烯醚萜苷類,易溶于水,乙醇,甲醇等溶劑,在酸、堿、高溫、光照等條件下易分解成羥基酪醇[5]。

目前,分離OL的方法主要有大孔樹脂吸附、高速逆流萃取及超臨界萃取等[14-18]。其中,高速逆流萃取和超臨界萃取分離效果較好,可以得到純度很高的OL,但這兩種方法對(duì)于設(shè)備、人員操作等方面要求很高,不適合于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。大孔樹脂具多孔結(jié)構(gòu),吸附性能優(yōu)良,廣泛應(yīng)用于植物活性成分的富集、分離和純化[19-23]。大孔樹脂富集、分離OL主要的機(jī)理是二者在一定條件下可通過氫鍵、范德華力發(fā)生可逆的相互作用,從而將其從提取液中選擇性富集、分離[22,23]。近年來,眾多學(xué)者聚焦于非極性、弱極性樹脂富集、分離橄欖葉提取物中的OL。Tian等[5]利用大孔樹脂D101富集分離OL,經(jīng)乙酸乙酯萃取得到純度為63.43%的OL產(chǎn)品。Wang等[8]利用AB-8樹脂富集分離OL,純度從9.16%提升到了20.38%。Sahin等[21]研究發(fā)現(xiàn)XAD 7HP樹脂吸附OL的機(jī)理符合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)。Liu等[24]研究發(fā)現(xiàn)大孔吸附樹脂BMKX-4富集OL的機(jī)理符合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)、Freundlich模型,并將OL的純度提升到47.59%。理論上來說,OL屬于多酚類化合物,陰離子樹脂吸附機(jī)理可實(shí)現(xiàn)其富集、分離。然而,目前尚未見到有關(guān)陰離子樹脂分離OL研究的報(bào)道,因此,我們采用陰離子樹脂(LX-68M),研究其靜態(tài)、動(dòng)態(tài)吸附和解吸附OL的性能,進(jìn)一步研究了OL的泄露曲線、洗脫曲線及陰離子樹脂再生的穩(wěn)定性,以期為陰離子樹脂富集、分離、純化OL及相似天然產(chǎn)物提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

橄欖葉由湖南杰萃生物技術(shù)有限公司贈(zèng)予,湖南中醫(yī)藥大學(xué)童巧珍教授鑒定為油橄欖(OleaeuropaeaL.)的干燥葉,標(biāo)本(2022001)存于湖南杰萃生物技術(shù)有限公司;OL標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%,MUST-21052502,成都曼思特生物科技有限公司);色譜純乙腈(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);無水乙醇(湖南匯虹試劑有限公司)。

色譜柱(BDS HYPERSIL C18,5 μm,4.6 mm ×250 mm);陰離子交換樹脂(LX-68M,粒徑為0.12 mm,西安藍(lán)曉科技新材料股份有限公司);雙功能數(shù)顯恒溫振蕩器(SHA-B,上海梅香儀器有限公司);高效液相色譜儀(LC-10Tvp,賽智科技(杭州)有限公司);自動(dòng)液相色譜分離層析儀(MB99-1,上海滬西分析儀器廠有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 液相條件

流動(dòng)相為0.1%磷酸溶液∶乙腈=77∶23等度洗脫;流速1.00 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)231 nm;柱溫30 ℃。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

準(zhǔn)確稱取OL標(biāo)準(zhǔn)品,配制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,再依次配制成0.025、0.05、0.10、0.15、0.20、0.30 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,并用HPLC測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積,取其峰面積平均值(n=3)。以峰面積為縱坐標(biāo)Y,OL濃度為橫坐標(biāo)X,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為Y=1.01×107X-2.03×105,R2=0.999 2。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.74%(n=6),說明分析結(jié)果的精密度符合測(cè)量要求。

1.2.3 橄欖苦苷的提取

取干燥好的橄欖葉粉末加適量70%乙醇,浸泡過夜;將70%乙醇以2 BV/h的流速進(jìn)行滲漉提取5 h,提取液回收乙醇至無醇味后靜置8 h,過濾,將所得濾液濃縮至0.50 g/mL(生藥濃度,以下同),備用。

1.2.4 靜態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)

樹脂預(yù)處理:將樹脂(LX-68M)浸泡在體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液中溶脹24 h,超純水洗至無醇味,再浸泡于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4% HCl溶液中12 h,洗至中性,最后在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4% NaOH溶液中浸泡12 h,洗至中性備用。

靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn):稱取預(yù)處理好的樹脂0.40 g(干重)于具塞錐形瓶中,加入40.0 mL濃度為0.20 g/mL的提取液;置于恒溫振蕩器每隔1 h取樣,用HPLC測(cè)定吸附殘液中OL的含量,按公式(1)計(jì)算樹脂平衡吸附量。

(1)

其中,Qe(mg/g)為樹脂平衡吸附量,C0、Ce(g/mL)分別表示提取液初始濃度及吸附平衡濃度,m(g)為樹脂質(zhì)量,V(mL)為提取液體積。

解吸附實(shí)驗(yàn):將達(dá)到吸附平衡的LX-68M樹脂用超純水洗滌3次(3×40.0 mL)后,加入40.0 mL 70%的乙醇,置于恒溫振蕩器,每隔1.0 h取樣,測(cè)定解吸液中OL的含量,共解吸8.0 h。按公式(2)計(jì)算解吸量。

Qd=Cd×Vd

(2)

其中,Qd(mg/g)為OL解吸量,Cd(g/mL)為解吸液OL濃度,Vd(mL)為解吸液體積。

1.2.5 提取液濃度對(duì)吸附性能的影響

稱取樹脂0.20 g于50 mL離心管中,加入20.0 mL不同濃度(0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 g/mL)的提取液,置于恒溫振蕩器吸附8.0 h以上,測(cè)定殘液中OL的含量。

1.2.6 不同濃度乙醇對(duì)解吸性能的影響

將達(dá)到吸附平衡的LX-68M樹脂用超純水洗滌三次,加入20.0 mL不同濃度(0%、15%、30%、45%、60%、75%、90%)的乙醇;置于恒溫振蕩器解吸8.0 h以上,測(cè)定解吸液中OL的含量。

1.2.7 LX-68M樹脂動(dòng)態(tài)吸附-解吸研究

稱取LX-68M樹脂5.0 g采用濕法裝柱,層析柱規(guī)格為1.0 cm × 40 cm。取濃度為0.25 g/mL的橄欖葉提取液,在不同上樣流速(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 BV/h)下上樣。流出液中OL濃度超過提取液OL濃度的10%可視為樹脂達(dá)到吸附飽和,并繪制泄露曲線,此時(shí)對(duì)應(yīng)的體積為泄露體積。上樣結(jié)束后,先用超純水進(jìn)行洗滌,待流出液檢測(cè)基本無OL時(shí);再用45%乙醇溶液進(jìn)行洗脫,在不同流速(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 BV/h)下進(jìn)行解吸,每1.0 BV接一次解吸液,測(cè)定洗脫液中OL的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 樹脂靜態(tài)吸附、解吸性能

為獲得LX-68M樹脂的吸附、解吸性能參數(shù),對(duì)樹脂進(jìn)行靜態(tài)吸附、解吸實(shí)驗(yàn)研究。靜態(tài)吸附結(jié)果如圖1a所示,LX-68M樹脂在起始2.0 h內(nèi)快速吸附,吸附量達(dá)到27 mg/g以上,此后吸附速率增長(zhǎng)變緩,且在7.0 h后達(dá)到吸附平衡。因此,選擇7.0 h為樹脂的吸附平衡時(shí)間。解吸實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1b所示,70%乙醇為解吸液時(shí),樹脂解吸OL較快,在3.0 h左右達(dá)到解吸附平衡;為確保OL的回收率,我們選擇解吸時(shí)間為4.0 h。圖1表明樹脂對(duì)于OL的吸附量大,解吸速度較快,LX-68M樹脂可作為富集、分離、純化OL的材料。

2.2 LX-68M樹脂分離橄欖苦苷的影響因素

我們進(jìn)一步研究了上樣濃度、乙醇濃度對(duì)LX-68M樹脂吸附OL、解吸的影響規(guī)律。結(jié)果如圖2所示,上樣濃度在0.05～0.20 g/mL范圍內(nèi),隨著上樣濃度的增加,OL的平衡吸附量也在相應(yīng)增加;當(dāng)上樣濃度超過0.25 g/mL時(shí),樹脂的吸附量達(dá)到平衡。這可能是因?yàn)闈舛鹊脑龃?上樣液中其他成分的濃度也隨之增大,與OL形成吸附競(jìng)爭(zhēng),使得樹脂中的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)減少,導(dǎo)致樹脂對(duì)于OL吸附能力的下降[25]。因此,LX-68M樹脂對(duì)于OL的最佳上樣濃度在0.20～0.25 g/mL之間。

圖2 不同上樣濃度橄欖苦苷吸附量Fig.2 OL adsorption capacity of ifferent concentrations solution

為探索乙醇濃度對(duì)LX-68M樹脂解吸性能及OL純度的影響,選擇7個(gè)不同濃度乙醇進(jìn)行解吸實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖3a所示,解吸液乙醇濃度≤ 60%時(shí),OL的純度隨著乙醇濃度的升高而升高;解吸液乙醇濃度超過60%后,OL的純度開始下降。OL屬于弱極性物質(zhì),隨著乙醇濃度的增加,解吸液極性下降,解吸率也在增加,但這也使得了其他弱極性物質(zhì)被洗脫出來,最終導(dǎo)致OL純度的下降。解吸率由如圖3b所示,解吸液乙醇濃度≤ 45%時(shí),OL解吸率隨著乙醇濃度的升高而增加,當(dāng)解吸液乙醇濃度達(dá)到45%時(shí),OL解吸率達(dá)到最大。因此,綜合考慮試劑消耗和對(duì)OL收率、純度的影響,選擇45%乙醇作為洗脫劑。提取原液、吸附殘液和解吸液高效液相色譜圖如圖4所示,說明LX-68M樹脂實(shí)現(xiàn)了橄欖苦苷的分離純化。

圖3 不同濃度乙醇解吸橄欖苦苷純度(a)、解吸率(b)Fig.3 Purity (a) and desorption rate (b) of oleuropein by ethanol at different concentrations

圖4 OL標(biāo)準(zhǔn)品、提取原液、吸附殘液、解吸液高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of OL standard,extraction solution,adsorption solution,desorption solution

2.3 LX-68M樹脂吸附動(dòng)力學(xué)

為研究LX-68M樹脂對(duì)OL的吸附動(dòng)力學(xué)機(jī)理和吸附速率的影響參數(shù),采用準(zhǔn)一級(jí),準(zhǔn)二級(jí)和Elovich等動(dòng)力學(xué)模型對(duì)相關(guān)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析(表1)。其中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和模型預(yù)測(cè)值之間的一致性由相關(guān)系數(shù)(R2)表示。R2值越高(接近或等于1)表示樹脂的吸附動(dòng)力學(xué)機(jī)理與動(dòng)力學(xué)模型越吻合[26]。

表1 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)模型

吸附動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表2所示。以R2值為參考指標(biāo),可以看出LX-68M樹脂吸附OL的行為更符合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型(R2=0.993 4)。此外,準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型的理論吸附量Qe1=39.46 mg/g,與實(shí)驗(yàn)所得的平衡吸附量Qe=36.79 mg/g最接近。結(jié)果表明LX-68M樹脂吸附OL可能符合化學(xué)吸附原理,從而達(dá)到富集、分離、純化OL的目標(biāo)[21,22,27,28]。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型中初始吸附速率H(45.51mg/(g·h))較大,半吸附時(shí)間t1/2小于1 h,表明LX-68M樹脂是吸附OL的良好材料。

表2 LX-68M樹脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)

2.4 LX-68M樹脂靜態(tài)等溫吸附

等溫吸附模型通常用來描述一定溫度下吸附劑和被吸附物、平衡濃度與平衡吸附量以及各參數(shù)對(duì)吸附狀態(tài)之間的相互作用關(guān)系。為確定OL的等溫吸附行為,采用Langmuir、Freundlich等模型(表3)對(duì)相關(guān)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合、分析。其中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和模型預(yù)測(cè)值之間的一致性由相關(guān)系數(shù)(R2)表示。R2值越高(接近或等于1)表示樹脂的等溫吸附與該等溫靜態(tài)吸附模型越符合。

表3 Langmuir和Freundlich等溫靜態(tài)吸附模型

由表4數(shù)據(jù)可知,Langmuir模型擬合曲線中,LX-68M樹脂的R1值在0.96和0.99之間,說明在生藥濃度范圍為0.05～ 0.30 g/mL有利于OL的選擇性吸附。然而,Qm值(83.10 mg/g)與實(shí)驗(yàn)值Qe(36.79 mg/g)差距較大。因此,Langmuir模型不能完全解釋LX-68M樹脂吸附OL的行為。Freundlich模型擬合曲線的R2=0.964 2,大于Langmuir模型擬合曲線的R2=0.850 6,表明Freundlich模型能更好地描述OL在樹脂上的吸附行為。且Freundlich模型中1/n小于1,說明在該實(shí)驗(yàn)條件下有利于OL的吸附[22,25,29,30]。樹脂的Kf=4.37 mg1-n/(g·mLn),這進(jìn)一步表明LX-68M樹脂對(duì)OL具有合適的吸附位點(diǎn)和吸附能力[22]。因此,LX-68M樹脂吸附OL的過程更符合Freundlich等溫吸附模型。

表4 LX-68M樹脂的Langmuir和Freundlich等溫靜態(tài)吸附參數(shù)

2.5 LX-68M樹脂動(dòng)態(tài)吸附、解吸研究

采用動(dòng)態(tài)吸附、解吸實(shí)驗(yàn)研究了上樣速率、上樣體積、洗脫速率、洗脫液體積對(duì)LX-68M樹脂吸附、解吸性能的影響,結(jié)果如圖5所示。圖5a顯示上樣濃度為0.25 g/mL時(shí),上樣速率在1.0-5.0 BV/h范圍內(nèi),4.0 BV流出液中OL的含量均小于1%,可看作吸附飽和。而上樣速率在1.0 BV/h和2.0 BV/h下,上樣體積分別為7.0 BV、6.0 BV時(shí)流出液中OL濃度開始上升,超過原液中OL濃度的10%,此時(shí)所對(duì)應(yīng)的體積即為泄漏體積,3.0～5.0 BV/h上樣速率下泄漏體積均為5.0 BV。由圖5b可知,1.0～5.0 BV/h洗脫速率下均在2.0 BV時(shí)OL解吸量最大,并在洗脫液體積達(dá)到10.0 BV時(shí),OL的總解吸率分別為87.85%、87.08%、81.14%、78.45%、75.12%。

圖5 LX-68M樹脂不同流速下泄露曲線(a)、解吸曲線(b)Fig.5 Leakage curve (a),desorption curve (b) of LX-68M resin at different flow rates

總吸附量、解吸量如表5、表6所示,上樣或解吸流速越快,總吸附率、總解吸率越低,原因可能是速率越快,提取液、洗脫液與樹脂接觸的時(shí)間越短,導(dǎo)致吸附、解吸率下降。且上樣和洗脫速率超過2.0 BV/h后,總吸附率和總解吸率均大幅度下降,為保證較大的吸附、解吸率,同時(shí)綜合考慮吸附、解吸時(shí)間及溶劑消耗,最終選擇上樣速率、洗脫速率均為2.0 BV/h,上樣體積為6 BV,解吸液體積為10.0 BV。

表5 LX-68M樹脂動(dòng)態(tài)吸附性能參數(shù)

表6 LX-68M樹脂動(dòng)態(tài)解吸性能參數(shù)

在選擇的最佳條件下取LX-68M樹脂5.0 g采用濕法裝柱,層析柱為1.0 cm ×40 cm,在上樣濃度為0.25 g/mL,解吸液為45%乙醇,吸附、解吸速率均為2.0 BV/h時(shí),所得到的OL純度達(dá)到52.33%,吸附率、解吸率分別為86.86%、87.08%。進(jìn)一步說明LX-68M樹脂是富集、分離、純化OL的良好材料。

2.6 LX-68M樹脂再生

稱取樹脂0.20 g于50 mL離心管中,加入20.0 mL 0.25 g/mL提取液,置于恒溫振蕩器吸附6.0 h,用45%乙醇溶液解吸4.0 h,結(jié)果如圖6所示。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)表明,經(jīng)4次吸附-解吸后樹脂的吸附量為初始吸附量的54.9%。進(jìn)一步,將經(jīng)4次吸附-解吸后的樹脂進(jìn)行再生處理:先用2%NaOH溶液浸泡振蕩12 h,用超純水洗至中性,再用95%乙醇浸泡振蕩12 h,用超純水洗至無醇味。對(duì)再生后的樹脂進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn),吸附率達(dá)到初始吸附率的93.51%,說明LX-68M經(jīng)過再生后仍具有良好的吸附效率,具有一定工業(yè)化前景。

圖6 LX-68M樹脂重復(fù)利用實(shí)驗(yàn)Fig.6 Recycling experiments of LX-68M resin

3 結(jié)論

等溫吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Freundlich等溫吸附模型能很好地描述實(shí)驗(yàn)溫度下LX-68M樹脂吸附OL的過程,相關(guān)系數(shù)R2=0.964 2,即吸附利于進(jìn)行。LX-68M樹脂對(duì)OL的吸附更符合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué),R2=0.993 4,表明LX-68M樹脂對(duì)于OL的吸附為物理吸附和化學(xué)吸附同時(shí)發(fā)生,且以化學(xué)吸附為主[31],其機(jī)理可能是樹脂的基團(tuán)與OL的官能團(tuán)通過形成化學(xué)鍵。經(jīng)靜態(tài)、動(dòng)態(tài)吸附與解吸附實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化得出最佳的分離條件為:提取液濃度0.25 g/mL,洗脫液為45%乙醇,上液速率為2.0 BV/h,上樣體積為6.0 BV,解吸速率2.0 BV/h,解吸液體積為10.0 BV;此時(shí)的吸附率、解吸率分別為86.86%、87.08%,所得OL的純度為52.33%。當(dāng)樹脂吸附-解吸4次后吸附效率為54.9%,經(jīng)再生后,吸附率達(dá)到初始吸附率的93.51%,表明樹脂再生后仍具有較好的吸附性能。上述結(jié)果說明,LX-68M樹脂對(duì)于OL具有良好富集、分離、純化效率,且與現(xiàn)有工藝相比,本工藝為常溫常壓操作,安全簡(jiǎn)便,所用均為綠色無毒的溶劑,可以為陰離子樹脂在OL及相似天然產(chǎn)物分離純化工業(yè)上的應(yīng)用提供理論研究基礎(chǔ)和技術(shù)支持。雖然本研究探討了LX-68M樹脂對(duì)OL的吸附過程,但雜質(zhì)與OL產(chǎn)生的吸附競(jìng)爭(zhēng)行為,也會(huì)對(duì)分離效率產(chǎn)生一定的影響。因此,仍需進(jìn)行相關(guān)研究以確定相應(yīng)的吸附機(jī)理,為L(zhǎng)X-68M樹脂的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。